治疗听力丧失的方法 【发明领域】
本发明涉及治疗和预防听力丧失的方法和组合物。
【发明背景】
获得性听力丧失的主要原因是大的噪音。在工作场所中常常要暴露于有害的噪音水平。职业安全和健康国家研究所(National Institutefor Occupational Safety and Health)估计，在美国有大约3千万工人遭遇过危险水平的噪音。(Franks等人(1996)，Preventing OccupationalHearing Loss-A Practical Guide，DHHA(NIOSH)Publication，No.96-110，p.1)。这些噪音水平可在下列情况遇到，即例如在建筑、采矿、农业、制造和公用事业、运输中，和在军队中。尽管作出了努力来调节与噪音暴露相关的工作和改善听力保护装置如耳套和耳塞的使用，与噪音相关的听力丧失的发生率却连续地增加。
另一个听力丧失的原因是暴露于耳毒性药物如顺式铂氨和氨基糖苷类抗生素。因此，就需要用于预防或治疗听力丧失的方法和组合物。
发明概述
在一个方面，本发明提供了改善听力丧失的方法，这些方法各包括向受试者施用一定数量的对于改善听力丧失有效的耳保护组合物(otoprotectant composition)这一步骤。耳保护组合物包含至少一种在此公开的耳保护剂(otoprotectant)。在一些实施方案中，耳保护组合物含有药物有效量的至少一种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物(例如含有依布硒啉的组合物)。在一些实施方案中，耳保护组合物含有药物有效量的(a)至少一种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物和(b)至少一种黄嘌呤氧化酶抑制剂(例如含有依布硒啉和别嘌醇的组合物)。在一些实施方案中，耳保护组合物含有药物有效量的(a)至少一种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物和(b)至少一种谷胱甘肽或谷胱甘肽前体(例如含有依布硒啉和N-乙酰基-半胱氨酸的组合物)。在一些实施方案中，耳保护组合物含有药物有效量的(a)至少一种黄嘌呤氧化酶抑制剂和(b)至少一种谷胱甘肽或谷胱甘肽前体(例如含有别嘌醇和N-乙酰基-半胱氨酸的组合物)。在一些实施方案中，耳保护组合物含有药物有效量地(a)至少一种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物、(b)至少一种黄嘌呤氧化酶抑制剂和(c)至少一种谷胱甘肽或谷胱甘肽前体(例如含有依布硒啉、别嘌醇和N-乙酰基-半胱氨酸的组合物)。
本发明的另一个方面提供了用于改善听力丧失的耳保护组合物。耳保护组合物包含至少一种在此公开的耳保护剂。在一些实施方案中，耳保护组合物含有至少一种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物。在一些实施方案中，耳保护组合物含有至少一种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物和至少一种黄嘌呤氧化酶抑制剂。在一些实施方案中，耳保护组合物含有至少一种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物和至少一种谷胱甘肽或谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，耳保护组合物含有至少一种黄嘌呤氧化酶抑制剂和至少一种谷胱甘肽或谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，耳保护组合物含有至少一种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物、至少一种黄嘌呤氧化酶抑制剂和至少一种谷胱甘肽或谷胱甘肽前体。
附图简述
当参考伴随的附图时，将会更容易意识到本发明的前述方面和许多随之而来的优点，同样它们也会在参照下面的描述之后得到更好地理解，在这些附图中：
图1显示了比较听觉引起的脑干反应(ABR)的阈值位移的图，其测试方法为在将对照大鼠(A)、N-乙酰基-半胱氨酸处理的大鼠(B)和依布硒啉处理的大鼠(C)暴露于115dB、4-16kHz的噪音4小时之后的1天、1星期、2星期和3星期，用4-16kHz的卡嗒声刺激进行测试。对照大鼠和依布硒啉处理的大鼠之间阈值位移的差异在噪音暴露之后的1天、1星期和2星期是非常显著的(p＜0.01)，和在噪音暴露之后的3星期是显著的(p＜0.05)。对照大鼠和N-乙酰基-半胱氨酸处理的大鼠之间阈值位移的差异在噪音暴露之后的所有时间点上是显著的(p＜0.05)。偏离基线的阈值位移以5dB的间隔进行测量。
图2显示了比较ABR的阈值位移的图，其测试方法为在将对照大鼠(A)、16mg/kg依布硒啉处理的大鼠(B)、16mg/kg别嘌醇处理的大鼠(C)和8mg/kg依布硒啉/别嘌醇处理的大鼠(D)暴露于115dB、4-16kHz的噪音4小时之后的3星期，用4-16kHz的卡嗒声刺激和频率为4kHz、8kHz、12kHz和16kHz的刺激进行测试。对照大鼠(A)和依布硒啉处理的大鼠(B)之间阈值位移的差异对于卡嗒声刺激和4kHz刺激是非常显著的(p＜0.01)。对照大鼠(A)和别嘌醇处理的大鼠(C)之间阈值位移的差异对于卡嗒声刺激、4kHz刺激和16kHz刺激是非常显著的(p＜0.01)。对照大鼠(A)和依布硒啉/别嘌醇处理的大鼠(D)之间阈值位移的差异对于卡嗒声刺激、4kHz刺激和16kHz刺激是非常显著的(p＜0.01)，和对于12kHz刺激是显著的(p＜0.05)。偏离基线的阈值位移以5dB的间隔进行测量。
图3显示了比较ABR的阈值位移的图，其测试方法为在将对照大鼠(A)和依布硒啉处理的大鼠(B)两次(两次之间的间隔为3星期)暴露于110dB、4-16kHz的噪音4小时之后的3星期，用频率为4kHz、8kHz、12kHz和16kHz的刺激进行测试。对照大鼠和依布硒啉处理的大鼠之间阈值位移的差异对于8kHz刺激是非常显著的(p＜0.01)，和对于16kHz刺激是显著的(p＜0.05)。偏离基线的阈值位移以5dB的间隔进行测量。
图4A-D显示了比较作为离耳蜗尖距离的函数的外部毛细胞损失百分数的图，这是在将对照大鼠(A和C)和16mg/kg依布硒啉处理的大鼠(B和D)两次(两次之间的间隔为3星期)暴露于110dB、4-16kHz的噪音4小时之后进行测定的。大鼠A和C中损失的外部毛细胞的数目分别为401和246；大鼠B和D中损失的外部毛细胞的数目分别为90和56。
优选实施方案的详述
在此处使用时，术语“耳保护剂”是指能够改善听力丧失的化学物质。
在此处使用时，术语“改善听力丧失”包括：(a)减少听力丧失的等级和/或持续时间；和/或(b)延缓听力丧失的进程；和/或(c)预防当没有施用本发明的耳保护组合物时将会出现的听力丧失的发生。
在此处使用时，术语“耳毒性因子”表示这样的因子，即其可能损害与听力相关的任何耳组分的功能，因此可能引起暂时性或者永久性的听力丧失。耳毒性因子的例子为耳毒性药物和耳毒性噪音。
在此处使用时，术语“暴露于耳毒性因子”包括一次或多次暴露于在本领域中认为可能引起暂时性或者永久性的听力丧失的耳毒性因子。例如职业安全和健康管理局(OSHA)认为大于或等于85分贝(dB)的噪音对于听力是危险的。因此，OSHA规定工人不得暴露于大于或等于85dB的噪音超过连续8小时(基于时间加权平均值)，除非使用噪音减少措施(即耳套)。
在此处使用时，术语“耳保护组合物”是指包含至少一种耳保护剂和可能包含超过一种耳保护剂的组合物。除了一种或多种耳保护剂之外，耳保护组合物可能也包含药物上可接受的载体，这些载体使得向哺乳动物受试者施用耳保护组合物变得容易。
在一个方面，本发明提供了改善听力丧失的方法，这些方法各包括向受试者施用一定数量的对于改善听力丧失有效的耳保护组合物这一步骤。本发明的方法可应用于任何哺乳动物受试者，例如人受试者。耳保护组合物可以在暴露于耳毒性因子之前、期间或之后进行施用。
耳保护组合物可以包含一种或多种耳保护剂。除非另外规定，在本发明中可以使用此处公开的任何耳保护剂的任何同分异构或互变异构形式。一些可以包含在本发明的耳保护组合物中的耳保护剂包括谷胱甘肽和谷胱甘肽前体。该类别中具有代表性的例子为：甲硫氨酸；N-乙酰基-DL-甲硫氨酸；S-腺苷甲硫氨酸；半胱氨酸；高半胱氨酸；N-乙酰基半胱氨酸；谷胱甘肽；谷胱甘肽乙基酯；谷胱甘肽二乙基酯；谷胱甘肽三乙基酯；半胱胺；胱硫醚(cystathione)；N，N′-二乙酰基-L-胱氨酸(DiNAC)；2(R，S)-D-核糖-(1′，2′，3′，4′-四羟丁基)-噻唑烷-4(R)-羧酸(RibCys)；2-烷基噻唑烷-2(R，S)-D-核糖-(1′，2′，3′，4′-四羟丁基)噻唑烷(RibCyst)；和2-氧-L-噻唑烷-4-羧酸(OTCA)。
在本发明的实行中可以使用黄嘌呤氧化酶抑制剂如别嘌醇(C5H4N4O)和其互变异构体作为耳保护剂。在本发明的实行中使用下列具有代表性的别嘌醇衍生物作为耳保护剂：1-甲基别嘌醇；2-甲基别嘌醇；5-甲基别嘌醇；7-甲基别嘌醇；1，5-二甲基别嘌醇；2，5-二甲基别嘌醇；1，7-二甲基别嘌醇；2，7-二甲基别嘌醇；5，7-二甲基别嘌醇；2，5，7-三甲基别嘌醇；1-乙氧基羰基别嘌醇；和1-乙氧基羰基-5-甲基别嘌醇。
在本发明的实行中可以使用谷胱甘肽过氧化物酶模拟物作为耳保护剂。谷胱甘肽过氧化物酶模拟物的具有代表性的例子包括：2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮(依布硒啉)；6A，6B-二亚硒酸-6A′，6B′-硒桥β-环糊精(6-diSeCD)；和2，2′-二硒基-双-β-环糊精(2-diSeCD)。
表1给出了对于一些此处描述的耳保护剂的具有代表性的有效剂量范围。表1中给出的耳保护剂优选地通过口服或静脉内进行施用。表1中给出的耳保护剂可以在暴露于耳毒性因子如耳毒性噪音之前、期间或之后施用于哺乳动物受试者。一般地，哺乳动物受试者在每次暴露于耳毒性因子之前和之后接受至少一个剂量的至少一种耳保护剂。在一些实施方案中，哺乳动物受试者在暴露于耳毒性因子之前接受一个剂量的至少一种耳保护剂，和在暴露于耳毒性因子之后接受至少一个剂量的至少一种耳保护剂。在一些实施方案中，哺乳动物受试者对于单次暴露于耳毒性因子而接受至少两个日剂量的至少一种耳保护剂，例如暴露于耳毒性噪音并持续大约1-大约6小时。在一些实施方案中，哺乳动物受试者对于重复地暴露于耳毒性因子或者长时间地暴露于耳毒性因子而接受至少三个日剂量的至少一种耳保护剂，例如暴露于耳毒性噪音并持续超过大约6小时。
在本发明的一些实施方案中，将含有一种或多种耳保护剂的耳保护组合物以一次或多次的方式施用于哺乳动物受试者，该施用在从哺乳动物受试者暴露于耳毒性因子之前18小时至哺乳动物受试者暴露于耳毒性因子之后18小时的期间内进行。在本发明的一些实施方案中，将含有一种或多种耳保护剂的耳保护组合物以一次或多次的方式施用于哺乳动物受试者，该施用在从哺乳动物受试者暴露于耳毒性因子之前1小时至哺乳动物受试者暴露于耳毒性因子之后1小时的期间内进行。在本发明的一些实施方案中，将含有一种或多种耳保护剂的耳保护组合物以一次或多次的方式施用于哺乳动物受试者，该施用在从哺乳动物受试者暴露于耳毒性因子之前30分钟至哺乳动物受试者暴露于耳毒性因子之后30分钟的期间内进行。在本发明的一些实施方案中，将含有一种或多种耳保护剂的耳保护组合物以一次或多次的方式施用于哺乳动物受试者，该施用在从哺乳动物受试者暴露于耳毒性因子之前10分钟至哺乳动物受试者暴露于耳毒性因子之后10分钟的期间内进行。在本发明的一些实施方案中，将含有一种或多种耳保护剂的耳保护组合物施用于哺乳动物受试者，同时哺乳动物受试者暴露于耳毒性因子如耳毒性噪音。
缩写“mg”表示毫克。
表1.耳保护剂的剂量范围化合物化学名称本发明优选的范围本发明更优选的范围本发明最优选的范围NAMN-乙酰基-甲硫氨酸5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天甲硫氨酸甲硫氨酸5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天SAMS-腺苷甲硫氨酸5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天半胱氨酸半胱氨酸5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天NACN-乙酰基-L-半胱氨酸5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天DiNACN，N′-二乙酰基-L-胱氨酸5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天高半胱氨酸高半胱氨酸5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天RibCyst2-烷基噻唑烷-2(R，S)-D-核糖-(1′，2′，3′，4′-四羟丁基)噻唑烷5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天RibCys2(R，S)-D-核糖-(1′，2′，3′，4′-四羟丁基)-噻唑烷-4(R)-羧5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天
酸胱硫醚胱硫醚5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天谷胱甘肽谷胱甘肽5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天谷胱甘肽乙基酯谷胱甘肽乙基酯5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天谷胱甘肽二乙基酯谷胱甘肽二乙基酯5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天谷胱甘肽三乙基酯S-(1，2-二羧乙基)谷胱甘肽三酯5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天半胱胺半胱胺5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天OTCA2-氧-L-噻唑烷-4-羧酸5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天依布硒啉2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天2-diSeCD2，2′-二硒基-双-β-环糊精5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天6-diSeCD6A，6B-二亚硒酸-6A′，6B′-硒桥β-环糊精5-5000mg/天50-2000mg/天500-1000mg/天别嘌醇4-羟基吡唑并[3，4-d]嘧啶10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天1-甲基别嘌醇10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天2-甲基别嘌醇10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天5-甲基别嘌醇10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天7-甲基别嘌醇10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天1，5-二甲基别嘌醇10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天2，5-二甲基10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天
别嘌醇1，7-二甲基别嘌醇10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天2，7-二甲基别嘌醇10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天5，7-二甲基别嘌醇10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天1-乙氧基羰基别嘌醇10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天1-乙氧基羰基-5-甲基别嘌醇10-2400mg/天50-1200mg/天100-800mg/天
耳保护组合物可以包含一种或多种耳保护剂。因此，本发明的耳保护组合物可以包含任何此处描述的单个耳保护剂的任何组合。在一些含有多于一种耳保护剂的耳保护组合物的实施方案中，将耳保护组合物配制成可提供表1中给出的有效剂量的单个组分耳保护剂。如实施例2所述，在一些实施方案中，耳保护剂的组合可以相互协同作用。
在另一个方面，本发明提供了各自含有至少两种(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十种)此处公开的单个耳保护剂的耳保护组合物。例如，一些耳保护组合物包含有至少一种选自组A的耳保护剂、至少一种选自组B的耳保护剂和至少一种选自组C的耳保护剂，其中组A、B和C包括下列耳保护剂：
组A(谷胱甘肽或谷胱甘肽前体)：甲硫氨酸；N-乙酰基-DL-甲硫氨酸；S-腺苷甲硫氨酸；半胱氨酸；N-乙酰基半胱氨酸；谷胱甘肽；谷胱甘肽乙基酯；谷胱甘肽二乙基酯；谷胱甘肽三乙基酯；DiNAC；RibCys；高半胱氨酸；胱硫醚；半胱胺；OTCA；和RibCyst。
组B(黄嘌呤氧化酶抑制剂)：别嘌醇；1-甲基别嘌醇；2-甲基别嘌醇；5-甲基别嘌醇；7-甲基别嘌醇；1，5-二甲基别嘌醇；2，5-二甲基别嘌醇；1，7-二甲基别嘌醇；2，7-二甲基别嘌醇；5，7-二甲基别嘌醇；2，5，7-三甲基别嘌醇；1-乙氧基羰基别嘌醇；和1-乙氧基羰基-5-甲基别嘌醇。
组C(谷胱甘肽过氧化物酶模拟物)：依布硒啉；2-diSeCD；和6-diSeCD。
本发明的耳保护组合物例如对于改善由于暴露于耳毒性因子而引起的听力丧失是有用的。本发明的耳保护组合物可以在用于改善耳毒性因子引起的听力丧失的方法中使用，例如暴露于耳毒性噪音引起的听力丧失。
本发明的耳保护组合物可以配制成可提供对于在暴露于耳毒性因子的受试者中改善听力丧失有效的剂量。例如，在一些实施方案中，将耳保护组合物配制成可提供表1中给出的有效剂量的单个耳保护剂。
如实施例1-3所述，本发明的耳保护组合物的施用可通过任何有效的途径来完成，例如口服或者肠胃外途径。肠胃外递送的方法包括局部、动脉内、皮下、髓内、静脉内或者鼻内施用。除了一种或多种耳保护剂之外，耳保护组合物可以含有合适的药物上可接受的包括赋形剂在内的载体，和其他利于向哺乳动物受试者施用耳保护组合物的化合物。对于配制和施用的进一步细节可在最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences(Maack出版公司，Easton PA)中找到。
如实施例1-3所述，用于口服施用的耳保护组合物可以用本领域中熟知的药物上可接受的载体并以对于口服施用合适的剂量来配制。这种载体使得能够将耳保护组合物配制成适合于受试者摄取的药片、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆体、悬浮液等等。
用于口服施用的耳保护组合物例如可以通过这样的方法来获得，即用固体赋形剂联合一种或多种耳保护剂，可选择地研磨所得的混合物，和如果需要，可在加入合适的附加化合物之后加工颗粒混合物以获得药片或糖衣丸核。合适的赋形剂包括碳水化合物或者蛋白质填充剂。这些包括糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或者山梨糖醇，来自玉米、小麦、大米、马铃薯或者其他植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或者羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯胶和西黄蓍胶；以及蛋白质如明胶和胶原，但是并不局限于此。如果需要，可以加入崩解剂或者增溶剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或其盐如褐藻酸钠。
糖衣丸核可以具有合适的涂层如浓缩的糖溶液，涂层也可能含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、Carbopol凝胶、聚乙二醇，和/或二氧化钛、紫胶漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或者色素可以加入到药片或者糖衣丸涂层中，以便鉴定或者表征活性化合物的数量(即剂量)。
可以用于口服的耳保护组合物可以配制成例如由明胶制成的硬胶囊(push-fit capsule)，以及由明胶和涂层如甘油或山梨糖醇制成的密封的软胶囊。硬胶囊可以含有混合了下列物质的耳保护剂，即混合有填充剂或者粘合剂如乳糖或淀粉，润滑剂如滑石或硬脂酸镁，和可选择地还有稳定剂。在软胶囊中，耳保护剂可以溶解或者悬浮在合适的液体中，例如有或没有稳定剂的脂肪油、液体石蜡或者液体聚乙二醇。
如实施例1-3所述，用于肠胃外施用的耳保护组合物含有一种或多种耳保护剂的水溶液。对于注射，可以将本发明的耳保护组合物配制在水溶液中，优选地在生理相容的缓冲液如Hank’s溶液、Ringer’s溶液中，或者在生理缓冲盐水中。含水的注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。另外，耳保护剂的悬浮液可以制备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂质体。可选择地，悬浮液也可以含有合适的稳定剂和可增加化合物的溶解度从而允许制备高浓缩溶液的试剂。
对于局部或鼻部施用，通常在配剂中使用适合于渗透特定屏障的渗透剂。这种渗透剂一般在本领域中是已知的。
本发明的耳保护组合物可以与本领域中已知的方法类似的方法来制造(例如通过常规的混合、溶解、粒化、制成糖衣丸、研磨、乳化、制成胶囊、包裹或者冻干过程)。耳保护组合物也可以经过用常规方法(例如涂层)进行修饰而提供适当的释放特性，例如持续释放或者靶向释放。
耳保护组合物可以盐的形式提供，能够与许多酸一起来形成，包括盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等等，但是并不局限于此。在含水的或者其他质子型溶剂中，盐趋向于比相应的游离碱形式更为可溶。
在制备好这样的配制于可接受的载体中的耳保护组合物之后，可以将它们置于合适的容器中并加上标签以便使用。
实际施用的数量将依赖于需进行治疗的个体，这一数量优选地为可导致获得所希望的效用而无明显的副作用的最佳数量。有效剂量的确定正好在本领域中熟练技术人员的能力范围之内。当然，熟练技术人员将会认识到分开的和部分的剂量也在本发明的范围之内。
如实施例1-3所述，对于任何耳保护组合物，有效剂量可以在最初于细胞培养试验之中或者于任何合适的动物模型(例如灵长类、大鼠和豚鼠，以及其他小型实验室动物)之中进行评测。动物模型通常也用于获得希望得到的浓度范围和施用途径。然后，这种信息可以用于确定在人或者其他哺乳动物中的有用剂量和施用途径。
耳保护组合物的治疗效用和可能的毒性可以通过标准的药物学程序在细胞培养物或者实验动物中来确定(例如ED50，对于50％群体治疗有效的剂量；和LD50，对于50％种群致死的剂量)。治疗和毒性效应的剂量比率为治疗指数，其可表示为比率ED50/LD50。显示出大治疗指数的耳保护组合物是优选的。将从细胞培养试验和动物研究中获得的数据用于设计在人或其他哺乳动物中使用的剂量范围。这些化合物的剂量优选地位于包括ED50的小毒性或无毒性的循环浓度的范围内。取决于使用的剂量形式、患者的敏感度和施用的途径，剂量通常在这一范围内变化。
实施例1
该实施例显示了，施用依布硒啉能防止在暴露于噪音的大鼠中的听力阈值位移和耳蜗毛细胞损失。
1.方法
噪音暴露示例：将8星期大的雌性Fisher-344大鼠暴露于110-115dB、4-16kHz的噪音4小时。
生理学分析：听觉引起的脑干反应(ABR)用于评定在暴露于噪音之前和之后每个动物中每只耳的听力，这一评定使用来自IntelligentHearings System的装置。以5dB的间隔测量用卡嗒声刺激(宽谱刺激，4-16kHz)产生的ABR。在噪音暴露之后的1天、1星期、2星期和3星期对动物进行重复评测。在噪音暴露之后1天测量得到的ABR变化被认为是代表了暂时性阈值位移(TTS)；在噪音暴露之后3星期测量得到的ABR变化被认为是代表了永久性阈值位移(PTS)。
形态学分析：在经过噪音暴露的测试动物的耳蜗中的毛细胞数目和使用ABR的生理学评测通过下述方法来确定，即仔细地解剖耳蜗而获得内耳感受性上皮细胞。这些组织用荧光素标记的鬼笔环肽(对于在毛细胞中大量存在的肌动蛋白纤维具有特异性)和4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；对于细胞核中的DNA具有特异性)进行染色。然后将样品置于显微镜的载玻片上，并通过用表面荧光观察来确定毛细胞损失和保留的程度。生理学数据(ABR)和形态学数据(毛细胞数目)之间的相关性使得能够确认本发明的耳保护剂的保护效用。
耳保护剂的施用：将依布硒啉以4mg/ml溶解在10％DMSO中，并以16mg/kg施用于大鼠。将N-乙酰基-半胱氨酸以100mg/ml溶解在盐水中，并以325mg/kg施用于大鼠。在暴露于噪音之前的那一天、暴露于噪音的那一天和暴露于噪音之后的那一天，将0.5ml依布硒啉溶液或者N-乙酰基-半胱氨酸溶液以一日两次进行腹膜内注射或者通过口部管饲法进行递送。对照动物只用载体(10％DMSO)以同样的程序进行给药。
统计分析：所有的实验以每个研究组4只大鼠来进行，并且在噪音暴露之前和之后独立地测量每只耳。在双盲研究中收集数据。统计分析通过研究组之间的方差分析(ANOVA)来进行。
2.结果
如图1中所示，与对照相比，以5dB的间隔测量的用4-16kHz卡嗒声刺激产生的ABR在噪音暴露之后1天施用依布硒啉的动物中显示出非常显著的TTS的减少，和在噪音暴露之后3星期显示出显著的PTS的减少。与对照动物相比，在施用了依布硒啉的动物中的TTS和PTS的减少为至少2倍。类似地，ABR数据在噪音暴露之后的所有时间点上于施用N-乙酰基-半胱氨酸的动物中显示出显著的TTS的减少。
生理学数据与来自同样测试动物的形态学数据相关，该形态学数据显示出，与对照组相比在用耳保护剂处理的动物的耳蜗中具有更少的毛细胞损失。例如，在具有0dB PTS和显著减少的TTS的用依布硒啉处理的动物中，观察到保留有大多数的外部毛细胞，然而在具有15dB PTS的对照动物中几乎完全损失了外部毛细胞。在用N-乙酰基-半胱氨酸处理的大鼠中也观察到类似的外部毛细胞的保留。因此，施用依布硒啉或者N-乙酰基-半胱氨酸导致了可防止噪音引起的听力丧失和毛细胞损失的生理保护。
类似地，发现施用别嘌醇也可提供防止噪音引起的听力丧失和毛细胞损失的保护(见实施例2)。
实施例2
该实施例显示了，联合施用依布硒啉和别嘌醇可以提供比单独施用各个化合物更大的防止听力丧失的保护。
1.方法
噪音暴露示例：将8-10星期大的雌性Fisher-344大鼠暴露于110-115dB、4-16kHz的噪音4小时。
生理学分析：如实施例1所述，以5dB的间隔测量用卡嗒声刺激(宽谱刺激，4-16kHz)和频率为4kHz、8kHz、12kHz和16kHz的声音刺激产生的ABR。在噪音暴露之前和噪音暴露之后的3星期对动物进行检测以评定PTS。
化合物的施用：将依布硒啉以4mg/ml溶解在10％DMSO中，和将别嘌醇以4mg/ml溶解在水中。将依布硒啉和别嘌醇以16mg/kg的单独剂量或者以各自8mg/kg的联合剂量施用于大鼠。在暴露于噪音之前的那一天、暴露于噪音的那一天和暴露于噪音之后的那一天，将0.5ml依布硒啉溶液、别嘌醇溶液或者依布硒啉/别嘌醇溶液以一日两次进行腹膜内注射或者通过口部管饲法进行递送。对照动物只用载体以同样的程序进行给药。
统计分析：所有的实验以每个研究组4只大鼠来进行，并且在噪音暴露之前和之后独立地测量每只耳。在双盲研究中收集数据。统计分析通过研究组之间的ANOVA来进行。
2.结果
以ABR进行测量的生理学数据表明，单独或联合施用依布硒啉和别嘌醇在暴露于噪音的大鼠中提供了显著的防止暂时性和永久性阈值位移的保护。图2显示了，与对照相比，通过以16mg/kg进行腹膜内注射而递送的依布硒啉和别嘌醇在噪音暴露之后的3星期分别导致PTS的明显减少。以单独剂量的一半(即各为8mg/kg)，依布硒啉和别嘌醇的联合提供了具有比简单相加更高水平的保护(协同)。
实施例3
该实施例显示了，施用依布硒啉可在重复暴露于噪音的大鼠中防止听力阈值位移和耳蜗毛细胞损失。
1.方法
噪音暴露示例：将8星期大的雌性Fisher-344大鼠两次暴露于110dB、4-16kHz的噪音4小时(间隔为3星期)。
生理学分析：如实施例1所述，以5dB的间隔测量用频率为4kHz、8kHz、12kHz和16kHz的声音刺激产生的ABR。在重复噪音暴露之前和重复噪音暴露之后的3星期对动物进行检测以评定永久性阈值位移(PTS)。
形态学分析：如实施例1所述，确定在噪音暴露之后的测试动物的耳蜗中的毛细胞数目，和使用ABR的生理学评定。
依布硒啉的施用：将依布硒啉以4mg/ml溶解在10％DMSO中，并以16mg/kg的剂量施用于大鼠。在每次暴露于噪音之前的那一天、每次暴露于噪音的那一天和每次暴露于噪音之后的那一天，将0.5ml依布硒啉溶液以一日两次进行腹膜内注射或者通过口部管饲法进行递送。对照动物只用载体以同样的程序进行给药。
统计分析：所有的实验以每个研究组4只大鼠来进行，并且在噪音暴露之前和之后独立地测量每只耳。在双盲研究中收集数据。统计分析通过研究组之间的ANOVA来进行。
2.结果
以ABR进行测量的生理学数据表明，依布硒啉在重复暴露于噪音的大鼠中提供了显著的防止暂时性和永久性阈值位移的保护。与对照相比，施用依布硒啉在重复噪音暴露之后的1天导致TTS的明显减少。另外，如图3所示，与对照相比，在重复噪音暴露之后的3星期这些动物中的PTS明显地减少了。如图4中所示，生理学数据与来自同一测试动物的形态学数据相关，该形态学数据显示出，与对照组相比在用依布硒啉处理的动物的耳蜗中具有更少的毛细胞损失。
虽然举例说明和描述了本发明的优选实施方案，但是将会意识到可以在其中进行各种变化而不会背离本发明的精神实质和范围。
下面定义了本发明的实施方案，在其中要求了排他性的所有权或特权。