一种马克斯克鲁维发酵饮品及其制备方法 所属领域：本发明涉及发酵工业学科领域，具体说是一种马克斯克鲁维发酵饮品及其制备方法
背景技术：众所周知，在食品工业中，许多真菌发酵的产物，可以作为许多国家和人民的美食或特有的调味品。不同的菌种，赋予不同的发酵产物，以不同的营养价值受惠于人类。 马克思克鲁维酵母Kluyveromyces marnianus(E.G.Hansen)van der Walt是一种流行于国内外的人类有益酵母真菌，它有很强的生命力和发酵功能。根据我们的研究和相关资料表明：将其在人工设计良好的环境中培养发酵，可以产生和分泌多种有益于人体健康的营养因子和生物活性物质。我们利用其这一特性，研制成一种新型绿色健康天然饮品，相信它对维护人体健康和提高人们生活质量，起到积极的作用。
文献资料业已证明：在酵母类真菌的细胞中，含有以下多种重要的营养和活性物质。(1)酵母蛋白，其分解产物为酵母核素，它既是生命有机体重要的营养素，又是临床上用于治疗震颤和麻痹的药物；(2)酵母核酸，在酵母细胞中，它以酵母蛋白地辅基形式存在，含有磷酸、嘌呤和嘧啶，在临床上具有扩张末梢血管、提高血红素浓度和红细胞数目、减轻浮肿、抗病毒等作用。此外，研究证明它还有抗癌和溶解癌细胞的功能；(3)激糖素，又被称为酵母胰岛素或植物胰岛素，它同血液胰岛素、球蛋白胰岛素、牛胰腺胰岛素性能相似，可有效纠正胰岛素缺乏症——糖尿病的代谢障碍；(4)丰富的氨基酸，在酵母蛋白中，具有人体必须的八种氨基酸。尤其是赖氨酸的含量超过任何其它蛋白质。(5)多种维生素，在酵母细胞及其代谢产物中，含有大量的B族维生素及维生素A、D、E、C。(6)生物活性物质，最著名的有两种，其一是酵母酵素，另一是β-葡聚糖。酵母酵素以酵母核酸酵素、内胰蛋白酵素、内中性蛋白酵素多种形式存在。它们既可促进食物水解，转化为有益于人体营养的消化剂，又是防治胆囊炎、胰腺炎以及其他肠道疾病的药物成分；β-葡聚糖是酵母在其代谢过程中分泌产生的一种生化物质。据文献报道，它是目前世界公认和倍受重视的一种抗癌物质；(7)大量的有机酸，可助消化，防腐消毒，杀灭病菌，有良好清理胃肠道作用。
根据目前国内外学者对马克斯克鲁维菌的研究。已经证明，它可产生的天然成分有：核苷酸、低聚糖、寡肽、凝集素、抗生素和多种酶等生物活性物质。核苷酸是核酸的基本结构单位，是代谢上极为重要的物质，几乎参与细胞的所有生化反应。大量研究证明，核酸可调节新陈代谢、提高机体免疫力、改善肝功能、减少体能消耗、改善肠胃功能、改善睡眠、抗疲劳、抗氧化并在促进生长发育等方面发挥着重要作用；低聚糖不仅能降低胆固醇的吸收，还能促进肠内双岐杆菌、乳酸菌等益生菌的生长，从而达到预防肠炎的作用。此外，寡肽、凝集素、抗生素及各种酶都对人体生物代谢有重要的促进作用。
纵观目前饮料市场，不论曾经深受消费者喜爱的各类果蔬汁，还是碳酸型饮料，以及见诸报导的果醋饮料，它们或营养单一，或其成分均系添加人工合成物，都不能满足当今人们营养和保健相结合的完美需求。
发明内容：本发明的目的是提供一种克服了目前饮料行业中营养单一和人工添加成分过滥问题而研究开发的一种集营养、保健于一体，且其成分来自天然不含任何人工添加物质，对有机体无任何毒副作用的天然有机活性饮品——马克斯克鲁维发酵饮品及其制备方法。
一种马克斯克鲁维发酵饮品，其特征在于采用一株分离出的马克斯克鲁维酵母菌，Kluyveromyces marnianus(E.G.Hansen)van der Walt在经过筛选的培养基和25-30℃条件下发酵培养，然后经过除菌过滤和后续常规处理而制成。
制备方法及过程如下：
A菌种的分离培养
在无菌、室温条件下，将来自民间的“藏灵菇”菌经灭菌PBS洗涤三次，用铂耳圈勾取其深层菌落，接种于分离培养基上，然后置37℃恒温培养箱中，经5-7天培养；选肉眼观察菌落呈奶酪状，乳白色或深褐色，表面平滑，有光泽，边缘光滑，显微镜观察为大量的菌丝和孢子的单独菌落。无菌条件下做二次分离，所用培养基同前，后置37℃恒温培养箱中培养3-5天，选同前的单独菌落，无菌条件下接种于保存培养基上，于4℃条件下保藏；
上述分离培养基是由下述原料及配比制备：
马铃薯汤 200份 葡萄糖 10-15份 蛋白胨 10份
酵母膏 2份 琼脂 20份 加水至 1000份
上述保存培养基是由下述原料及配比制备：
马铃薯汤 200份 葡萄糖 5-7份 蛋白胨 10份
琼脂 20份 加水至 1000份
B发酵菌种液的制备
发酵菌种液培养基使用下述原料及配比制备：
马铃薯汤 200-300份 葡萄糖 15-20份 蛋白胨10-20份
麦芽糖 2-10份 加水至 1000份
①I级发酵菌种液：将保存于4℃条件下的马克斯克鲁维酵母菌种，无菌条件下接种于发酵菌种液培养基试管中，25-30℃恒温培养箱中培养2-3天，得I级发酵菌种液；
②II级发酵菌种液：将I级发酵菌种液，无菌条件下接种于250ML瓶装的发酵菌种液培养基中，在25-30℃恒温条件下培养2-3天；
C初发酵液的制备：
将II级菌种液，无菌条件下接种于发酵培养液中，25-30℃条件下静置发酵三天；其培养基所用原料及配比为：
马铃薯汤 50-70％ 葡萄糖 5％ 麦芽糖 0.1-0.5％ 乳糖 0.1％
淀粉糖 2-5％ 胡萝卜汁 3-5％ 加水至 1000
D原发酵液的制备：
将C制得的初发酵液在20℃以下条件下，静置发酵三天，得饮品原液；
E过滤；
F有效成分检验；
G调味，用白砂糖调至酸甜适口；
H灌装；
J灭菌。
本饮品集中了当前市场流行各类饮料的多种优点，其制作、成分、色泽、口味都具有自己独特的风格。总的来讲有以下几方面：(1)营养性，本饮品含有多种人体所需的营养成分，如蛋白质、脂肪、糖、氨基酸、低聚糖、维生素A、D、E、B、C及各种微量元素、矿物质、有机酸(详见后附检验报告单)，可全面补充人体营养需要；(2)保健性，如前所述，在酵母菌生长过程中，能够产生多种有益于人体健康的活性因子(由于目前食品检验内容及方法所限，有些未曾列入检验内容)。此外，根据我们的动物实验结果分析证明，该饮品具有一定的拮抗脂肪沉着和降低血糖的作用；(3)天然性，本饮品所含有大量有益人体的活性物质，如核苷酸、低聚糖、寡肽、各种酶、各种维生素，矿物质，有机酸等。它们或者是马克斯克鲁维酵母菌在其生长代谢过程中产生和分泌的，或者是原材料天然成分所固有，并非源自人工添加。它们对补充人体营养需要和维持人体健康，具有重要意义。此外，我们研制的新型饮品与当前市场流行的其他饮品相比，不仅营养丰富，纯系天然，而且口味醇正，易被消费者接受。通过我们先后多次重复实验，证明其成分稳定、口味不变、重复性好、且对受试动物无毒副作用，能够用于工业化生产。随着我国建设小康步伐的推进和社会人们健康意识的提高，该饮品将会受到社会人们的更大青睐，在经济、技术和社会效果上，都将产生积极的作用。
【附图说明】
图1为本发明饮品原汁对正常大鼠血红蛋白的影响
图2为饮品原汁对正常大鼠红细胞总数的影响
图3为饮品原汁对正常大鼠白细胞总数的影响
实验结果说明
1减脂作用的研究——预防肥胖模型法
将昆明种小鼠随机分为空白对照组(普通饮水组)，模型对照组(培养基汁组)，及三个受试样品实验组(饮品原汁组、高压处理组、高压过滤组)。自实验开始，培养基汁组、饮品原汁组、高压处理组、高压过滤组每组动物给予等量的饮料，普通饮水组以相同方式给予一般自来水。连续饲养30天，剖腹取体脂(睾丸及肾周脂肪垫)并称重，计算脂体比。脂体比＝脂肪重量/体重×100。比较三组减脂效果，以普通饮水组、培养基汁组为对照，对各试验组数据进行t检验。
表一：减脂作用
组别 剂量(ml/组) 动物数(个) 体脂值(g)
普通饮水组 25 5 1.58±0.34
培养基汁组 25 5 1.66±0.54
饮品原汁组 25 5 0.44±0.16**##
高压处理组 25 5 0.55±0.09**##
高压过滤组 25 5 0.89±0.28*#
注：与普通饮水组比较，*：P＜0.05，**：P＜0.01；与培养基汁组比较，#：P＜0.05，##：P＜0.01
表二：脂体比
组别 剂量(ml/组) 动物数(个) 脂体比(％)
普通饮水组 25 5 4.2±0.7
培养基汁组 25 5 5.0±1.5
饮品原汁组 25 5 1.4±0.6**##
高压处理组 25 5 1.7±0.2**##
高压过滤组 25 5 2.8±0.8*#
注：与普通饮水组比较，*：P＜0.05，**：P＜0.01；与培养基汁组比较，#：P＜0.05，##：P＜0.01
由表一、表二可知，在预防肥胖模型实验中，作为空白对照的普通饮水组，体脂为1.58g，脂/体为4.2％，作为模型对照的培养基汁组，体脂为1.66g，脂/体为5.0％，二对照组没有显著性差异。同样条件下，饮品原汁组，体脂为0.44g，脂/体为1.4％；高压处理组，体脂为0.55g，脂/体为1.7％；高压过滤组，体脂为0.89g，脂/体为2.8％，与两对照组相比，有一定的减脂作用。经t检验分析，饮品原汁组、高压处理组与两对照组相比，差异均达极显著差异水平，高压过滤组达差异显著水平。
2降糖试验——降低空腹血糖实验
昆明种小鼠禁食24小时后，给予四氧嘧啶(150mg/Kg)造型，5-7天后禁食3-5小时，检测其血糖值10-25mmol/L者为高血糖模型成功动物。选高血糖模型动物按禁食3-5小时的血糖水平分组，随机分为4组，均常规饲养，自然光照。(1)普通饮水组每日给以自来水100ml/组；(2)10倍饮品浓缩组每日给以10倍饮品浓缩液100ml/组；(3)饮品原汁组每日给以饮品原汁100ml/组；(4)50％稀释原汁组每日给以50％稀释原汁100ml/组。连续实验30天，断尾取血，测空腹血糖值(禁食同实验前)，比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。血糖下降百分率＝(实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值×100％。比较三者降血糖效果，以普通饮水组为对照，对各试验组数据进行t检验。
表三：降血糖效果
组别 剂量(ml/组) 动物数(个) 降糖值 血糖下降率
(mmol/L) (％)
普通饮水组 50 8 1.13±0.12 15.44±0.46
10倍浓缩组 50 8 3.96±0.79** 42.15±9.51**
原汁组 50 9 3.40±0.68** 35.05±9.12**
50％稀释组 50 8 2.93±0.62* 27.95±9.52*
注：与普通饮水组比较，*：P＜0.05，**：P＜0.01
由表三可知，成功诱导的糖尿病模型，平均血糖值达到12.45mmol/L。普通饮水组作为对照，其血糖值下降了1.13mmol/L，血糖下降率为15.44％。同样条件下，10倍浓缩组，血糖值下降了3.96mmol/L，血糖下降率为42.15％；原汁组，血糖值下降了3.40mmol/L，血糖下降率为35.05％；50％稀释组，血糖值下降了2.93mmol/L，血糖下降率为27.95％。经t检验分析，所有实验饮料组与对照组相比，差异均达显著水平，说明饮品有一定的降糖作用。由降糖效果来看，三个浓度之间存在一定的剂量效应，浓度越高，降血糖的效果越好。
3藏灵菇饮品对大鼠血液中血红蛋白浓度、红细胞总数、白细胞总数的影响
将Wister大鼠常规饲养一段时间后给予饮品原汁，尾静脉采血，在给予饮品前后分别测其血液中的血红蛋白浓度、红细胞总数、白细胞总数。比较血液中各项指标的含量，以给予饮品前为对照，进行t检验。
表四：血红蛋白、红细胞、白细胞的影响
血红蛋白 红细胞 白细胞
时间
(g/100ml) (106/mm3) (103/mm3)
给予饮品前 13.86±0.96 8.53±0.78 14.86±0.47
给予饮品后 13.96±0.29 8.27±0.68 14.75±0.75
由表四知给予饮品原汁后，大鼠血液中的血红蛋白浓度、红细胞总数、白细胞总数没有显著变化，说明给予饮品原汁后，大鼠保持了正常的生理状态，从一个侧面也说明该饮品作为饮料的安全性。
4血红蛋白的测定——酸化法
将Wister大鼠随机分为空白对照组和样品实验组，分别给予普通饮水和饮品原汁并给予常规饲料饲养。每七天尾静脉采血一次，给血液加酸，使血红蛋白变成棕色的酸性正铁血红素，稀释后与血红蛋白计的标准玻璃色柱进行目光比色，即得每100ml血液中所含血红蛋白的克数。比较二者血红蛋白含量，对以普通饮水组为对照，对试验组数据进行t检验。
由图一知，给予饮品后，大鼠血液中的血红蛋白含量与对照组相比没有显著性差异，从而说明饮品对其血红蛋白含量没有影响。
5红细胞的测定
将Wister大鼠随机分为空白对照组和样品实验组，分别给予普通饮水和饮品原汁并给予常规饲料饲养。每七天尾静脉采血一次，进行红细胞计数，即得每立方毫米(mm3)血液中所含的红细胞总数。比较二者红细胞总数量，以普通饮水组为对照，进行t检验。
由图二知，给予饮品后，大鼠血液中的红细胞总数与对照组相比没有显著性差异，从而说明饮品对其红细胞总数没有影响。
6白细胞总数的测定
将Wister大鼠随机分为空白对照组和样品实验组，分别给予普通饮水和饮品原汁并给予常规饲料饲养。每七天尾静脉采血一次，酸化处理，进行白细胞计数，即得每立方毫米(mm3)血液中所含的白细胞总数。比较二者白细胞总数，以普通饮水组为对照，对试验组数据进行t检验。
由图三知，给予饮品后，大鼠血液中的白细胞总数与对照组相比没有显著性差异，从而说明饮品对其白细胞总数没有影响。
实施例：
实施例1：2002年10月9日，按照培养基各组分的常规比例配制批号为021009的饮品50000ml，
(1)菌种的分离培养
在无菌、室温条件下，将来自民间的“藏灵菇”菌经灭菌PBS洗涤三次，用铂耳圈勾取其深层菌落，接种于分离培养基上，然后置37℃恒温培养箱中，经5天培养；选肉眼观察菌落呈奶酪状，乳白色或深褐色，表面平滑，有光泽，边缘光滑，显微镜观察为大量的菌丝和孢子的单独菌落。无菌条件下做二次分离，所用培养基同前，后置37℃恒温培养箱中培养3天，选同前的单独菌落，无菌条件下接种于保存培养基上，于4℃条件下保藏；
分离培养基的原料及配比为：
马铃薯汤200ml 葡萄糖10g 蛋白胨10g 酵母膏2g 琼脂20g，加水至1000ml
保存培养基的原料及配比为：
马铃薯汤200ml 葡萄糖5g 蛋白胨10g 琼脂20g 加水至1000ml
2)发酵菌种液的制备
发酵菌种液培养基使用下述原料及配比制备：
马铃薯汤200ml 葡萄糖15g 蛋白胨20g 麦芽糖10g 加水至1000ml
①I级发酵菌种液：将保存于4℃条件下的马克斯克鲁维酵母菌种，无菌条件下接种于发酵菌种液培养基试管中，25℃恒温培养箱中培养3天，得I级发酵菌种液；
②II级发酵菌种液：将I级发酵菌种液，无菌条件下接种于250ML瓶装的发酵菌种液培养基中，在25℃恒温条件下培养3天；
(3)初发酵液的制备：
将II级菌种液，无菌条件下接种于发酵液培养基中，25℃条件下静置发酵3天；其培养基所用原料及配比为：
马铃薯汤 25000ml
葡萄糖 2500g
麦芽糖 250g
乳糖 50g
淀粉糖 250g
胡萝卜汁 1500ml
水 23500ml
(4)原发酵液：将(3)制得的初发酵液在低于20℃条件下，静置发酵3天，得饮品原液；
(5)过滤；
(6)有效成分检验；
(7)调味，用白砂糖调至酸甜适口；
(8)灌装；
(9)灭菌。
实施例2：2003年3月14日，按照各组分的最佳比例配制批号为030314的饮品100000ml，其配比为：
(1)菌种的分离培养
在无菌、室温条件下，将来自民间的“藏灵菇”菌经灭菌PBS洗涤三次，用铂耳圈勾取其深层菌落，接种于分离培养基上，然后置37℃恒温培养箱中，经7天培养；选肉眼观察菌落呈奶酪状，乳白色或深褐色，表面平滑，有光泽，边缘光滑，显微镜观察为大量的菌丝和孢子的单独菌落。无菌条件下做二次分离，所用培养基同前，后置37℃恒温培养箱中培养5天，选同前的单独菌落，无菌条件下接种于保存培养基上，于4℃条件下保藏；
分离培养基的原料及配比为：
马铃薯汤200ml 葡萄糖15g 蛋白胨10g 酵母膏2g 琼脂20g 加水至1000ml
保存培养基的原料及配比为：
马铃薯汤200ml 葡萄糖7g 蛋白胨10g 琼脂20g 加水至1000ml
2)发酵菌种液的制备
发酵菌种液培养基使用下述原料及配比制备：
马铃薯汤300ml 葡萄糖20g 蛋白胨10g 麦芽糖2g 加水至1000ml
①I级发酵菌种液：将保存于4℃条件下的马克斯克鲁维酵母菌种，无菌条件下接种于发酵菌种液培养基试管中，30℃恒温培养箱中培养2天，得I级发酵菌种液；
②II级发酵菌种液：将I级发酵菌种液，无菌条件下接种于250ML瓶装的发酵菌种液培养基中，在30℃恒温条件下培养2天；
(3)初发酵液的制备：
将II级菌种液，无菌条件下接种于发酵液培养基中，30℃条件下静置发酵3天；其培养基所用原料及配比为：
马铃薯汤 70000ml
葡萄糖 7000g
麦芽糖 300g
乳糖 100g
淀粉糖 500g
胡萝卜汁 5000ml
水 25000ml
(4)原发酵液：将(3)制得的初发酵液在低于20℃条件下，静置发酵三天，得饮品原液；
(5)过滤；
(6)有效成分检验；
(7)调味，用白砂糖调至酸甜适口；
(8)灌装；
(9)灭菌。
实施例3：2003年6月10日，按照培养基各组分的优化比例配制批号为030610的饮品200000ml，其配比为：
(1)菌种的分离培养
在无菌、室温条件下，将来自民间的“藏灵菇”菌经灭菌PBS洗涤两次，用铂耳圈勾取其深层菌落，接种于分离培养基上，然后置37℃恒温培养箱中，经5天培养；选肉眼观察菌落呈奶酪状，乳白色或深褐色，表面平滑，有光泽，边缘光滑，显微镜观察为大量的菌丝和孢子的单独菌落。无菌条件下做二次分离，所用培养基同前，后置37℃恒温培养箱中培养3天，选同前的单独菌落，无菌条件下接种于保存培养基上，于4℃条件下保藏；
分离培养基的原料及配比为：
马铃薯汤200ml 葡萄糖10g 蛋白胨10g 酵母膏2g 琼脂20g，加水至1000ml
保存培养基的原料及配比为：
马铃薯汤200ml 葡萄糖5g 蛋白胨10g 琼脂20g 加水至1000ml
2)发酵菌种液的制备
发酵菌种液培养基使用下述原料及配比制备：
马铃薯汤200ml 葡萄糖15g 蛋白胨20g 麦芽糖10g 加水至1000ml
①I级发酵菌种液：将保存于4℃条件下的马克斯克鲁维酵母菌种，无菌条件下接种于发酵菌种培养液试管中，25℃恒温培养箱中培养3天，得I级发酵菌种液；
②II级发酵菌种液：将I级发酵菌种液，无菌条件下接种于250ML瓶装的发酵菌种培养液中，在25℃恒温条件下培养3天；
(3)初发酵液的制备：
将II级菌种液，无菌条件下接种于发酵培养液中，25℃条件下静置发酵3天；其培养基所用原料及配比为：
马铃薯汤 25000ml
葡萄糖 2500g
麦芽糖 250g
乳糖 50g
淀粉糖 250g
胡萝卜汁 1500ml
水 23500ml
(4)原发酵液：将(3)制得的初发酵液在低于20℃条件下，静置发酵3天，得饮品原液；
(5)过滤；
(6)有效成分检验；
(7)调味，用白砂糖调至酸甜适口；
(8)灌装；
(9)灭菌。
实施例4：2003年10月18日，按照最优化比例配制批号为031018的饮品300000ml：
(1)菌种的分离培养
在无菌、室温条件下，将来自民间的“藏灵菇”菌经灭菌PBS洗涤三次，用铂耳圈勾取其深层菌落，接种于分离培养基上，然后置37℃恒温培养箱中，经7天培养；选肉眼观察菌落呈奶酪状，乳白色或深褐色，表面平滑，有光泽，边缘光滑，显微镜观察为大量的菌丝和孢子的单独菌落。无菌条件下做二次分离，所用培养基同前，后置37℃恒温培养箱中培养5天，选同前的单独菌落，无菌条件下接种于保存培养基上，于4℃条件下保藏；
分离培养基的原料及配比为：
马铃薯汤200ml 葡萄糖15g 蛋白胨10g 酵母膏2g 琼脂20g 加水至1000ml
保存培养基的原料及配比为：
马铃薯汤200ml 葡萄糖7g 蛋白胨10g 琼脂20g 加水至1000ml
2)发酵菌种液的制备
发酵菌种液培养基使用下述原料及配比制备：
马铃薯汤300ml 葡萄糖20g 蛋白胨10g 麦芽糖2g 加水至1000ml
①I级发酵菌种液：将保存于4℃条件下的马克斯克鲁维酵母菌种，无菌条件下接种于发酵菌种液培养基试管中，30℃恒温培养箱中培养2天，得I级发酵菌种液；
②II级发酵菌种液：将I级发酵菌种液，无菌条件下接种于250ML瓶装的发酵菌种液培养基中，在30℃恒温条件下培养2天；
(3)初发酵液的制备：
将II级菌种液，无菌条件下接种于发酵液培养基中，30℃条件下静置发酵3天；其培养基所用原料及配比为：
马铃薯汤 195000ml
葡萄糖 19500g
麦芽糖 400g
乳糖 200g
淀粉糖 400g
胡萝卜汁 3000ml
水 102000ml
(4)原发酵液：将(3)制得的初发酵液在低于20℃条件下，静置发酵三天，得饮品原液；
(5)过滤；
(6)有效成分检验；
(7)调味，用白砂糖调至酸甜适口；
(8)灌装；
(9)灭菌。