大白菜胞质雄性不育系育种方法 【技术领域】
本发明大涉及大白菜育种方法的改进，尤其是大白菜胞质雄性不育系育种方法，其属于大白菜杂种优势利用技术领域。
技术背景
大白菜杂种优势是大白菜改良工作中赖以提高单产、改进品质、增强抗逆性的一条重要途径。目前国内外实现这一途径的方法有：(1)自交不亲和系：自交不亲和性在十字花科植物中最为普遍，美国人Peason，O.H.(1932)首先提出利用甘蓝的两个自交不亲和系天然杂交生产杂种一代种子，这一方法后来在日本得到完善，所以，十字花科的优势育种是随着1954年日本遗传育种学家确立了利用自交不亲和系生产杂种一代种子的体系后，而广泛开展起来的。我国20世纪60年代初，青岛市农业科学研究所开始进行大白菜自交不亲和系的选育，1971年率先利用自交不亲和系配制出大白菜一代优良杂种“青杂早丰”，此后这成为大白菜杂种优势利用的主要途径。但是，利用自交不亲和系的方法也有不足之处：①自交不亲和系自身繁殖需打破其不亲和性，因此需要人工辅助授粉，或采用其它化学方法处理才能自交结实，成本高，繁殖系数低。②亲本经多代自交后，会出现生活力下降，抗逆性减退等症状。③其配制的杂交种杂交率不易达到100％，难以保证制种纯度。(2)雄性不育系：大白菜雄性不育系的研究和利用工作，20世纪60年代在日本、韩国展开，我国的研究工作始于1971年育成：由核基因控制的雄性不育两用系，该不育性由隐性核基因控制，不育系兼具有不育系和保持系的功用，所以在杂交育种中称之为“两用系”，该不育系必须具有标记性状才能有效用于大面积杂交种生产，否则必须在开花后拔除一半可育株，所以既费工费时，又会影响杂种的产量和质量，因此在生产中应用受限制较多；核基因互作雄性不育系：由沈阳市农业科学研究所1988年育成并提出核不育显性基因互作的遗传模式，即两对非等位基因间具有显性上位效应，并在同源材料中选育出甲型两用系和乙型两用系，已有配制出的杂交种在生产中应用。但在生产大白菜一代杂种时，甲型两用系和临时保持系性状差异很大，由它们配成的杂交种相当于三交种，其整齐度较差。同时繁殖亲本需设2级圃地，在1级圃地仍需拔除50％可育株，手续繁杂，成本高。(3)胞质雄性不育系：自Ogura(1968)发现萝卜细胞质不育源以来，国内外学者在十字花科作物上做了大量的转育改良工作，黑龙江园艺所将王兆红萝卜不育胞质转到了大白菜上，但由于存在蜜腺退化和经济性状不良等原因，未能广泛用于杂交种的制种生产。此后在甘蓝型油菜上发现的玻里马胞质雄性不育源(polcms)，由于其不育性高，保持谱和恢复谱广，已被转育到多种十字花科作物上，应用于育种实践。
【发明内容】
本发明目的是克服上述地缺点，提供一种大白菜胞质雄性不育系育种方法，该方法省工、成本低；繁殖容易，不必象自交不亲和系那样人工剥蕾或喷盐水，不必象核基因互作雄性不育系那样需另增加一个繁殖圃，拔除50％可育株，杂交种纯度高。
本发明的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种大白菜胞质雄性不育系育种方法，采取如下步骤：
(1)以小白菜玻里马雄性不育源为母本，用大白菜自交系B7为父本杂交，得到亚种间杂种F1；
(2)以亚种间杂种F1为母本，以大白菜自交系B7为轮回亲本连续回交4-6次，获得不育系A7；
(3)用不育系A7为母本，以大白菜自交系B7为父本进行杂交，繁殖不育系；
(4)用不育系A7为母本，用大白菜自交系C24为父本进行杂交，配制杂交种EF6。
所述的不育系A7，其不育性表现性能是：早熟类型不育系，不育性稳定，不育株率100％，不育度99-100％以上，对低温敏感性极低；开花正常，花药A字型，黄白色，无花粉，雌蕊和蜜腺正常，自然传粉结实良好，自然杂交率100％
所述的不育系A7，其植株外形是：；植株半直立，株高20-23cm，开展度35-40cm，叶长20-23cm，宽14-17cm，球叶叠抱，头球形，叶球高10-13cm，球径8-10cm。
所述的杂交种EF6，其表现性能是：极早熟品种，株高23-28厘米，开展度45-50厘米；叶面光滑无刺毛，外叶6-9片；球叶叠抱，包球紧实，叶球卵圆形，球高14-18厘米，球径10-14厘米，单球重450-700克，净菜率70-73％，40-50天收获；在30-38℃高温下结球正常；耐高湿，在多雨季节栽培不易发生软腐病。
所述的杂交种EF6，其栽培要点是：在20-38℃气温条件下栽培，每亩5000-6000棵。所述的大白菜自交系B7为耐热早熟自交系，来自耐热白菜“93-1”的自交分离后代球叶叠抱，其植株外形是：植株半直立，株高20-23cm，开展度35-40cm，叶长20-23cm，宽14-17cm，球叶叠抱，头球形，叶球高10-13cm，球径8-10cm。
所述的大白菜自交系C24为耐热早熟自交系，来自耐热白菜“玉宝”的自交分离后代，其植株外形是：株高18-20厘米，开展度35-45厘米，无刺毛，叶长21-26厘米，叶宽16-20厘米，球叶叠抱，圆球形，球高10-14厘米，球径10-14厘米。
本发明的优点是：
(1)A7不育性稳定，不育株率100％，不育度达99％以上，雌蕊、蜜腺正常，杂交结实好。
(2)A7对低温敏感性极低，克服了Pol温度不稳定的弱点，有利于保证杂交种纯度。
(3)省工、成本低：A7繁殖容易，不必象自交不亲和系那样人工剥蕾或喷盐水，不必象核基因互作雄性不育系那样需另增加一个繁殖圃，拔除50％可育株。
(4)杂交种纯度高。
(5)有利于保护育种者权益。
附图及具体实施例
图1为不育系A7的选育过程。
图2为不育系A7繁殖式。
图3为杂交组合EF6制种图。
参见图1-图3本发明研制了一种大白菜胞质雄性不育系育种方法，采取如下步骤：
(1)以自南京农业大学引进的不结球白菜玻里马胞质雄性不育源为母本，用大白菜自交系B7为父本杂交，得到亚种间杂种F1；
(2)以亚种间杂种F1为母本，以大白菜自交系B7为轮回亲本连续回交4-6次，获得不育系A7；
(3)用不育系A7为母本，以大白菜自交系B7为父本进行杂交，繁殖不育系；
(4)用不育系A7为母本，用大白菜自交系C24为父本进行杂交，配制杂交种EF6。
所述的不育系A7，其不育性表现性能是：早熟类型不育系，不育性稳定，不育株率100％，不育度99％以上，对低温敏感性极低；开花正常，花药A字型，黄白色，无花粉，雌蕊和蜜腺正常，自然传粉结实良好，自然杂交率100％
所述的不育系A7，其植株外形是：植株半直立，株高21、23、26、27cm，开展度36、42、43、45cm，叶长23、25、28、29cm，宽16、18、21、22cm，球叶叠抱，头球形，叶球高12、13、15、16cm，球径9、11、12、13cm。
所述的杂交种EF6，其表现性能是：极早熟品种，株高23、25、27、28厘米，开展度45、47、49、50厘米；叶面光滑无刺毛，外叶6、7、8、9片；球叶叠抱，包球紧实，叶球卵圆形，球高14、15、17、18厘米，球径10、12、13.5、14厘米，单球重400、450、550、750克，净菜率70％、71％、72％、73％，42、45、48、50天收获；在33℃、35℃、36℃、37℃高温下结球正常；耐高湿，在多雨季节栽培不易发生软腐病。所述的杂交种EF6，其栽培要点是：在20-38℃气温条件下栽培，每亩5000、5500、5800、6000棵。所述的大白菜自交系B7为耐热早熟自交系，来自耐热白菜“93-1”的自交分离后代，其植株外形是：植株半直立，株高21、23、26、27cm，开展度36、42、43、45cm，叶长23、25、28、29cm，宽16、18、21、22cm，球叶叠抱，头球形，叶球高12、13、15、16cm，球径9、11、12、13cm。所述的大白菜自交系C24为耐热早熟自交系，来自耐热白菜“玉宝”的自交分离后代，其植株外形是：株高18、19、19.5、20厘米，开展度35、36、39、40厘米，无刺毛，叶长21、21.5、224.5、26厘米，叶宽16、16.5、18、20厘米，球叶叠抱，圆球形，球高10、11、12、14厘米，球径10、12、13、14厘米。
1、不育系A7原种繁殖技术
本发明是用不育系A7为母本，以大白菜自交系B7为父本，进行杂交繁殖不育系，具体如下：
(1)采种方式：小株采种，采用秋季田间株系选择与小株采种相结合的方法繁殖不育系原种。
(2)播种期及播种方式：采用冬季阳畦育苗的方法，1月下旬至2月初，7厘米见方的营养土块，单粒点播。
(3)定植时期及方法：10厘米土温稳定在5℃以上时即可定植，带土坨移栽，栽后浇定植水，行株距50×35厘米，A7与B7的行比为3∶1，定植在20目以上的隔离网罩或自然隔离区内。
(4)授粉：隔离网罩内繁殖不育系原种，要求人工授粉，人工用海绵棒或蜂棒等沾取保持系花粉给不育系花授粉，自然隔离区内昆虫自然传粉。
(5)收获：从不育系植株上收获的种子即为不育系A7。
2、A7杂交制种技术
本发明是采用不育系A7为母本，用大白菜自交系C24为父本进行杂交，配制杂交种EF6。
本发明的实施效果对比实验见表1-7：
表1不育系A7与保持系B7花器官特征比较(单位：mm)
品系 花瓣长 花瓣宽 花药长 雄蕊长 雌蕊长 雌蕊长/雄
蕊长
A7 8.64±0.39 5.26±0.38 1.93±0.12 3.96±0.23 6.95±0.47 0.57±0.04
B7 10.8±0.51 7.67±0.35 2.26±0.12 8.09±0.51 7.24±0.63 1.12±0.06
由表1可知，不育系A7的花冠小于其保持系B7，花药长度相差不大，雄蕊长度明显变短，而雌蕊长度变化不大，雄雌蕊比值明显小于其保持系，故可用雄蕊长、雌蕊长和雄雌蕊比值作为判断育性变化的辅助手段。
表2不育系A7与保持系B7植株特征比较
品系 株高(cm) 开展度 分枝数 总分枝
长(cm) 宽(cm) 一次 二次 三次 数
A7 91.4±4.3 87.2±7.3 75.8±8.3 7.7±1.1 22.1±3.2 37.5±5.6 67.3
B7 92.6±4.6 72.4±7.0 62.8±6.8 5.8±0.5 15.6±2.9 17.2±2.9 38.6
从表2中可以看出，不育系A7和保持系B7株高相差不大，但A7的开展度显著大于B7，各次分枝数也多，总分枝数更是大于保持系，说明不育系A7的生长势强于其保持系B7，这为利用其进行优良组合的测配提供了可能。
表3不育系自然结实情况
品系 分枝 个 总荚 有效 荚粒 种子产量 总分 有效分枝 千粒重(g) 单株种子产
数 数 荚数 数 占总产比 枝数 数 量(g)
例(％)
A7 主枝 1 45.5 40.0 21.8 5.14
× 一次 6.0 269. 216. 21.6 27.50
C24 4 0 45.3 45.2 1.80 30.54
二次 16. 534. 391. 18.7 43.12
5 5 2
三次 22. 502. 274. 15.0 24.24
8 2 1
从表3中可以看出，该品系分枝数一次、二次、三次分枝依次增多，总荚数和有效荚数以二次分枝最多，三次、一次分枝次之；荚粒数一次分枝最多，二次分枝次之，三次分枝最少，反映出一次分枝荚大粒多；各分枝种子产量占总产量比例以二次分枝最大，一次、三次分枝次之。其次，该品系千粒重为1.80g，单株种子产量在30g以上，表明其自然结实性良好。
表4温度处理后A7不育性表现
处理时间 处理 月/日
1/2 1/3 2/3 2/5 2/8 2/10 2/1 2/1 2/1 2/19
8 1 2 5 7
8/4℃ 4 4 4 3.95 3.96 4 4 4 4 4
11/7℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
3d 13/11℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
17/13℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
室外 4 4 4 4 4 4 4 4 4
8/4℃ 4 4 4 3.96 4 4 4 4 4
11/7℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
5d 13/11℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
17/13℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
室外 4 4 4 4 4 4 4 4
8/4℃ 4 4 4 3.9 4 4 4 4
11/7℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
7d 13/11℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
17/13℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
室外 4 4 4 3.98 3.9 4 4 4
3
8/4℃ 4 4 4 4
11/7℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
9d 13/11℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
17/13℃ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
室外 4 4 4 4 3.9 3.9 3.9 4
8 8 8
温室CK 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
由表4可见，A7虽然对低温敏感性极低，低温处理仅出现短时极少量微点花，单株不育度始终为3.9级以上，但也存在着一定程度的低温敏感，变温8/4℃(即日均温6℃)为低温敏感的临界温度，低温作用的最短有效时间为3d，最大育性转换值出现在8/4℃7d的处理中，处理结束后第15天调查，6个单株全为3.9级，此时每株均有3-4朵花为2级。在日均温20℃条件下，育性转换出现在温度处理后12-18天，最大育性转换期出现在温度处理后第15天，这与以前对不结球白菜polcms研究结果一致[5]。8/4℃9d的处理，由于低温持续时间长，主枝部分花蕾黄化，所以并未出现有粉花。
表5不同播期A7的不育性变化
不
播期 月/日
育
3/11 3/13 3/15 3/17 3/19 3/21 3/23 3/26 3/28 3/30 4/1 4/3
系
12/25 4 4 3.99 3.99 3.99 3.99 3.99 3.99 3.99 3.99 4 3.79
1/10 4 4 4 4 4 4 4 3.93
A7 1/25
2/5
不 播期 月/日
育
4/6 4/8 4/10 4/12 4/15 4/17 4/20 4/22 4/24 4/26 4/30
系
12/25 3.78 3.92 3.95 3.98 3.99 4 3.98 3.99 4 4 4
1/10 3.94 3.96 3.97 3.99 3.99 3.95 3.99 3.99 4 4 4
A7 1/25 3.98 3.97 3.99 4 4 4 4 4 4 4 4
2/5 4 3.99 4 3.99 3.99 4 3.99 3.99 4 4 4
表6不育系A7不育株率、不育度统计结果
播期
12月/25日 1月/10日 1月/23日 2月/5日
不育株率 100％ 100％ 100％ 100％
不育度 99.38％ 100％ 100％ 100％
由表5、表6可知，A7不育性较为稳定，尤其是第一播期A7在3月11日即开花的情况下，单株不育度仅在4月3日和4月6日两次调查中，出现少数3级单株，其余时间单株不育度均在3.9级以上。其它各播期也只是出现个别微点花，不散粉。这说明A7不育性稳定，可以用于生产制种。
表7 A7的抗病性
重复 病毒病 霜霉病 备注
病情指数 反应型 病情指数 反应型
11.90 R 14.58 R 人工接种鉴定
II 17.85 R 15.28 R (2001年)
III 16.67 R 20.14 R
平均 15.47 R 16.67 R
C10(CK) 87.30 HS 34.26 MR
A7 0 23.29 田间调查
(2001/11/1)
经苗期人工接种鉴定，A7表现为抗病毒病，抗霜霉病，这与1998年-2001年的田间调查结果基本一致。
表8 EF6抗病性人工鉴定结果
试材 重复 病毒病 霜霉病
病情指数(％) 反应型 病情指数(％) 反应型
I 14.28 R 18.06 R
EF6 II 16.67 R 11.11 HR
III 21.43 R 14.44 R
平均 17.46 R 14.54 R
I 95.24 HS 41.67 MR
C10(CK) II 80.95 HS 33.33 R
III 85.71 HS 27.87 R
平均 87.30 HS 34.26 MR
表8表明，杂交种EF6在人工接种条件下，对病毒病和霜霉病的抗性水平达到抗病。