注射用丹红及其制备方法和质量控制方法.pdf

本发明公开了一种以植物生药丹参和红花为原料的注射用丹红及其制备方法和含量测定方法。本发明的制备方法为丹参采用乙醇回流提取，再将乙醇回流提取过的丹参用水煎煮，合并煎液，滤过；红花乙醇浸渍提取，滤过。将丹参及红花提取液混匀制成注射剂。本发明制备方法工艺先进、科学，有效成分提取更完全，提取工艺质量可控，制剂质量标准更高，并且稳定性好，药物浓度高，便于运输、储存和使用的注射用丹红及其制备方法。

1、  一种注射用丹红的有效成分混合液，其特征在于每毫升注射用丹红的混合液含相当于原生药量丹参0.75～3.0g、红花0.25～1.0g。

2、  如权利要求1所述的注射用丹红的有效成分混合液，其特征在于每毫升注射用丹红的混合液含相当于原生药量丹参2.7g、红花0.3g。

3、  如权利要求1所述的注射用丹红有效成分混合液的制备方法，其特征在于丹参的药用组分采用乙醇回流与水煎煮相结合提取；红花的药用组分采用稀乙醇浸渍与水温浸相结合提取；提取工艺步骤如下：
丹参粉碎成细粒状，先采用20～50倍乙醇回流提取3～4次，每次2～3小时，用薄层层析法控制提取终点，得丹参有效成分提取液A；再将乙醇回流提取过的丹参用10～20倍的水煎煮2～3次，每次40～80分钟，合并煎液，滤过；滤液浓缩后进行两次醇沉，第一次使含醇量达75％，第二次使含醇量达85％，每次醇沉后均冷藏放置，然后取上清液滤过，滤液与上述提取液A合并，冷藏；取上清液滤过，滤液浓缩至稠膏状后，加水沉淀处理，过夜，然后取上清液滤过，即得丹参药用组分提取液B，供配液使用；
红花经拣选，先采用20～50倍稀乙醇浸渍提取2～3次，每次3.0小时，冷藏，取上清液滤过，滤液浓缩后水沉，再取上清液滤过，即得红花有效成分提取液C；再将乙醇浸渍提取过的红花用20～50倍水温浸提取，滤过，滤液浓缩至稠膏状后加入乙醇进行两次醇沉；第一次使含醇量达80％，第二次使含醇量达85％，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至稠膏状，然后加水，搅匀，冷藏，滤过，即得红花药用组分提取液D；将红花有效成分提取液C与D合并，滤过，即得红花药用组分提取液E；
将上述所得提取液B与E混匀，即得注射用丹红所用植物生药的有效成分提取液，向有效成分提取液中按每毫升加入赋形剂0.05～0.5克，搅拌，溶解，滤过，并加注射用水适量，再调节PH值至4～9，即得注射用丹红有效成分混合液。

4、  如权利要求3所述注射用丹红有效成分混合液的制备方法，其特征在于该方法为：
丹参粉碎成细粒状，先采用25倍乙醇回流提取3次，每次2.5小时，用薄层层析法控制提取终点，得丹参有效成分提取液A；再将乙醇回流提取过的丹参用20倍的水煎煮三次，每次60分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩后进行两次醇沉，第一次使含醇量达75％，第二次使含醇量达85％，每次醇沉后均冷藏放置，然后取上清液滤过，滤液与上述提取液A合并，冷藏，取上清液滤过，滤液浓缩至稠膏状后，加水沉淀处理，过夜，然后取上清液滤过，即得丹参药用组分提取液B，供配液使用；
红花经拣选，先采用50倍稀乙醇浸渍提取2次，每次3.0小时，冷藏，取上清液滤过，滤液浓缩后水沉，再取上清液滤过，即得红花有效成分提取液C；再将乙醇浸渍提取过的红花用40倍水温浸提取，滤过，滤液浓缩至稠膏状后加入乙醇进行两次醇沉，第一次使含醇量达80％，第二次使含醇量达85％，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至稠膏状，然后加水，搅匀，冷藏，滤过，即得红花药用组分提取液D；将红花有效成分提取液C与D合并，滤过，即得红花药用组分提取液E；
将上述所得的药用组分提取液B和E混合均匀，即得注射用丹红所用植物生药的有效成分提取液，向有效成分提取液中按每毫升加入赋形剂0.05克，搅拌，溶解，滤过，并加注射用水适量，再调节PH值至6.5，即得注射用丹红的有效成分混合液。

5、  如权利要求3、4所述注射用丹红的有效成分混合液的制备方法，其特征在于加入赋形剂可为甘露醇、右旋糖酐或葡萄糖∶甘露醇为1∶1的混合物。

6、  如权利要求1、2所述注射用丹红有效成分混合液的制备冻干粉针的方法，其特征在于将混合液按每瓶定量分装后，未封口放入冻干箱的金属盘内，并将其搁板的温度降低至-25℃～-50℃，迅速将装有制剂的金属盘放入冻干箱内，维持1～6小时，然后对冻干箱进行真空处理，使箱内的真空度为0.2～0.5Pa，再将搁板升温，并严格控制在共熔点-2℃以下，保持10～24小时，最后升温至40℃，并保持一定时间，使制剂温度与搁板温度重合，放入无菌的过滤气体，控制制剂的含水量在1～5％，迅速封口即可。

7、  如权利要求6所述注射用丹红有效成分混合液的制备冻干粉针的方法，其特征在于冷冻干燥过程中可选择的最佳物理条件是：首先将搁板降温至-30℃，维持3小时，然后使冻干箱内的真空度0.2Pa，将搁板升温并严格控制在-2℃，保持18小时，将搁板升温至40℃放入无菌气体后，控制制剂的含水量为2％。

注射用丹红及其制备方法和质量控制方法
技术领域
本发明属于药品领域，涉及一种以植物生药丹参和红花为原料的注射用丹红及其制备方法、含量测定方法。
背景技术
目前已有的丹红注射液是由丹参和红花为原料，进行有效成分提取后制备的水针剂，虽然临床上是确有疗效的中药急症治疗药物，用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、缺血性脑病、脑血栓及肺心病等心血管性疾病，还可用于治疗瘀血闭塞所致的胸痹及中风等。但现有的丹红注射液存在提取工艺不完善，有效成分提取不全，产品质量控制难度大，制剂质量标准低且不完善，特别是丹红注射液的稳定性差，运输、储存也均不方便等。例如：现有丹红注射液的制备工艺(WS-11220(ZD-1220)-2002)和中国专利CN 1418678A(一种治疗心脑血管疾病的药物组合物及其制备方法)所涉及的制备方法中，无监测提取终点的方法，红花的药用组分提取不全；红花的含量测定标准不够全面；注射液水溶性黄酮苷类成分分解生成的苷元不溶于水；加入注射用氯化钠调节等渗，而据文献(曹毅敏等，红花注射液与五种注射液配伍稳定性考察，广东药学，2002，12(4)：31-32)报道：红花注射液与氯化钠注射液配伍，粒径大于2μm和5μm的微粒均剧增，微粒的负面作用不容忽视；现有的丹红注射液采用混合提取工艺，成分过于复杂，中间体控制难度大；丹红注射液稳定性也较差，长期储存后，颜色会变深，并产生沉淀。文献(申庆亮等，正交设计法研究丹参红花注射液最佳精制工艺，前卫药学杂志，2001，15(1))所述的丹参红花注射液最佳精制工艺存在明显的不足，一是仅以丹参的成分之一原儿茶醛的量作为唯一的判断指标，而不考虑其它主要成分，特别是红花所含的药用组份如腺苷和红花黄色素等；二是采用的提取工艺为丹参红花二者先混合，再水提醇沉，丹参和红花也仅有水提组分，也无监测提取终点的方法，产品质量控制难度大；最后，丹参注射液的运输、储存很不方便。正是由于上述缺点，本发明对提取工艺进行了更深一步的研究和改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种注射用丹红有效成分混合液及其质量控制方法，本发明另一目地在于提供将混合液制成冻干粉针的方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
1、丹参先采用20～50倍乙醇回流提取3～4次，每次2～3小时，用薄层层析法控制提取终点，得丹参有效成分提取液A；再将乙醇回流提取过的丹参用10～20倍的水煎煮2～3次，每次40～80分钟，合并煎液，滤过；滤液浓缩后进行两次醇沉，第一次使含醇量达75％，第二次使含醇量达85％，每次醇沉后均冷藏放置，然后取上清液滤过，滤液与上述提取液A合并，冷藏；取上清液滤过，滤液浓缩至稠膏状后，加水沉淀处理，过夜，然后取上清液滤过，即得丹参药用组分提取液B，供配液使用。
2、红花先采用20～50倍稀乙醇浸渍提取2～3次，每次3.0小时，冷藏，取上清液滤过，滤液浓缩后水沉，再取上清液滤过，即得红花有效成分提取液C；再将乙醇浸渍提取过的红花用20～50倍水温浸提取，滤过，滤液浓缩至稠膏状后加入乙醇进行两次醇沉；第一次使含醇量达80％，第二次使含醇量达85％，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至稠膏状，然后加水，搅匀，冷藏，滤过，即得红花药用组分提取液D；将红花有效成分提取液C与D合并，滤过，即得红花药用组分提取液E。
3、将上述所得提取液B与E混匀，即得注射用丹红所用植物生药的有效成分提取液，向有效成分提取液中按每毫升加入赋形剂0.05～0.5克，搅拌，溶解，滤过，并加注射用水适量，再调节PH值至4～9，即得注射用丹红有效成分混合液；每毫升注射用丹红含相当于原生药量丹参0.75～3.0g、红花0.25～1.0g；
将上述注射用丹红的有效成分混合液按每瓶2ml，5ml，10ml或20ml的规格分装后，未封口放入与冻干箱尺寸相应的金属盘内，对冻干箱进行灭菌处理，并将其搁板的温度降低至-25℃～-50℃，迅速将装有制剂的金属盘放入冻干箱内，维持1～6小时，然后对冻干箱进行真空处理，使箱内的真空度为0.2～0.5Pa，再将搁板升温，并严格控制在共熔点-2℃以下，保持10～24小时，最后升温至40℃，并保持1～5小时，使制剂温度与搁板温度重合，放入无菌的过滤气体，控制制剂的含水量在1～5％，迅速封口即可。
冷冻干燥过程中可选择的最佳物理条件是：首先将搁板降温至-30℃，维持3小时，然后使冻干箱内的真空度为0.2Pa，将搁板升温并严格控制在-2℃，保持18小时，将搁板升温至40℃放入无菌气体后，控制制剂的含水量为2％。
含量测定
原儿茶醛与丹参素的含量测定方法：
1、色谱条件与系统试用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-甲醇-冰酷酸(94∶6∶0.6)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按丹参素计算，应不低于5000。
2、对照品溶液的制备：密称取在100～110℃干燥至恒重的原儿茶醛、丹参素对照品各30mg，置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得(每1ml中含原儿茶醛、丹参素各0.06mg)。
3、测定法：精密量取本发明注射用丹红5ml，置25ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀。精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。
本发明注射用丹红每1ml含丹参提取物以原儿茶醛(C₇H₆O₃)与丹参素(C₉H₁₀O₅)的总量计，应不少于0.6mg。
总黄酮的含量测定方法：
1、对照品溶液的制备：精密称取在100-110℃干燥至恒重的芦丁对照品30mg，置100ml量瓶中，加50％甲醇适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水芦丁0.3mg)。
2、标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置10ml量瓶中，各加40-60％甲醇至5ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置4-8分钟，加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置5-8分钟，加氢氧化钠试液4ml，再加50％甲醇至刻度，摇匀，以相应的溶液为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
3、测定法：精密量取本发明注射用丹红5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加40-60％甲醇至刻度，摇匀，作为空白对照，另精密量取1ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加50％甲醇至5ml”起，依法立即测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得。
本发明注射用丹红每1ml含总黄酮以芦丁(C₂₇H₃₀O₁₆)计，应不少于6.0mg。
黄色素的含量测定方法：
1、对照品溶液的制备：精密称取在105℃干燥至恒重的黄色素对照品100mg，置100ml量瓶中，加60-80％甲醇适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含黄色素1.0mg)。
2、标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.5ml、3.0ml、4.5ml、6.0ml、7.5ml、9ml、10.5ml，分别置50ml量瓶中，各加70％甲醇至刻度，摇匀，以相应的溶液为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在403nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
3、测定法：精密量取本发明注射用丹红2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，作为空白对照，另精密量取1ml，置10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，依法立即测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于黄色素的重量，计算，即得。
本发明注射用丹红含黄色素应不低于25％。
本发明注射用丹红的制备方法提供一种提取工艺更先进、科学，有效成分提取更完全，提取工艺质量可控，制剂质量标准更高，并且稳定性好，药物浓度高，便于运输、储存和使用的注射用丹红及其制备方法。
实验例1：丹参与红花有效成分提取工艺的筛选
单独提取工艺(1)乙醇回流提取结合水煎醇沉法提取丹参有效成分：称丹参0.75kg，采用20倍乙醇回流提取3次，每次2.5小时，用薄层层析法控制提取终点，得丹参有效成分提取液A；再将乙醇回流提取过的丹参分别用20倍的水煎煮三次，每次60分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩后进行两次醇沉，第一次使含醇量达75％，第二次使含醇量达85％，每次醇沉后均冷藏放置，然后取上清液滤过，滤液与上述提取液A合并，冷藏，取上清液滤过，滤液浓缩至稠膏状后，加水至450ml沉淀处理，过夜，然后取上清液滤过，即得丹参药用组分提取液B。(2)乙醇浸渍提取结合水温浸提取法提取红花有效成分：称取红花0.25kg，先采用20倍稀乙醇浸渍提取2次，每次3.0小时，冷藏，取上清液滤过，滤液浓缩后水沉，再取上清液滤过，即得红花有效成分提取液C；再将乙醇浸渍提取过的红花用20倍水温浸提取，滤过，滤液浓缩至稠膏状后加入乙醇进行两次醇沉，第一次使含醇量达80％，第二次使含醇量达85％，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至稠膏状，然后加水，搅匀，冷藏，滤过，即得红花药用组分提取液D；将红花有效成分提取液C与D合并，加水至450ml，滤过，即得红花药用组分提取液E。(3)丹参与红花有效成分提取混合液的制备：将上述所得的丹参与红花药用组分提取液B和E混合均匀，然后加水至1000ml，即得注射用丹红所用植物生药的有效成分提取液。
混合提取工艺：醇浸水提法提取丹参与红花有效成分混合液：按照丹红注射液(WS₃-B-3267-98)所述的制备方法制备丹参与红花有效成分混合液。具体做法是：称取丹参0.75kg，用稀乙醇温浸二次，每次60分钟，滤过，滤液备用；药渣与红花混合后，加水温浸二次，每次60分钟，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.15的清膏，然后加水至1000ml，冷藏，滤过，即得。
每处理重复3次，实验结果(见表1)表明：以原儿茶醛与丹参素、总黄酮及红花黄色素计算，丹参与红花单独提取工艺，即先采用乙醇回流结合水煎醇沉提取丹参有效成分，再采用稀乙醇浸渍结合水温浸提取红花的有效成分，最后将二者混合，该单独提取工艺所得原儿茶醛与丹参素、总黄酮及红花黄色素的量均明显高于混合提取工艺所得的量。
表1  提取工艺对原儿茶醛与丹参素、总黄酮及红花黄色素量的影响
                              单独提取工艺       混合提取工艺
原儿茶醛与丹参素(mg/ml)       0.99               0.61
总黄酮(mg/ml)                 7.1                5.4
红花黄色素(％)                32.5％             14.3％
实验例2：赋形剂的选择
向上述单独提取工艺所得的药用组分提取液中加入不同种类的赋形剂，经冷冻干燥制成冻干粉针剂的外观结果，见表2。
表2  不同赋形剂的影响
右旋糖酐       葡萄糖    甘露醇    水解明胶    蔗糖    乳糖    外观指标
0.05                                                           较好
               0.05                                            一般
                         0.05                                  最佳
                                   0.05                        一般
                                               0.05            萎缩
                                                       0.05    较差
              0.05       0.05                                  较好
              0.05                             0.05            较差
                         0.05                  0.05            一般
每处理重复3次，表2表明选用甘露醇为最佳赋形剂。
实验例3：本发明所述注射用丹红比原有的丹红注射液的质量标准有提高，其“含量测定”项下对比如表3：
表3  “含量测定”方法与指标的比较
              方法指标
丹红注射液      HPLC法          原儿茶醛与丹参素不少于0.5mg/ml
                分光光度法      总黄酮不少于5.0mg/ml
注射用丹红      HPLC法          原儿茶醛与丹参素不少于0.6mg/ml
                分光光度法      总黄酮不少于6.0mg/ml
                分光光度法      红花黄色素不低于25％
本发明所述注射用丹红“含量测定”方法如下：
(1)原儿茶醛与丹参素的含量测定方法
色谱条件与系统试用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水—甲醇—冰酷酸(94∶6∶0.6)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按丹参素计算，应不低于5000。
对照品溶液的制备：精密称取在105℃干燥至恒重的原儿茶醛、丹参素对照品各30mg，置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得(每1ml中含原儿茶醛、丹参素各0.06mg)。
测定法：精密量取本发明注射用丹红5ml，置25ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀。精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。
本发明注射用丹红每1ml含丹参提取物以原儿茶醛(C₇H₆O₃)与丹参素(C₉H₁₀O₅)的总量计，应不少于0.6mg。
(2)总黄酮的含量测定方法
对照品溶液的制备：精密称取在105℃干燥至恒重的芦丁对照品30mg，置100ml量瓶中，加50％甲醇适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水芦丁0.3mg)。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置10ml量瓶中，各加50％甲醇至5ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4ml，再加50％甲醇至刻度，摇匀，以相应的溶液为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法：精密量取本发明注射用丹红5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，作为空白对照，另精密量取1ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加50％甲醇至5ml”起，依法立即测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得。
本发明注射用丹红每1ml含总黄酮以芦丁(C₂₇H₃₀O₁₆)计，应不少于6.0mg。
(3)黄色素的含量测定方法
对照品溶液的制备：精密称取在105℃干燥至恒重的黄色素对照品100mg，置100ml量瓶中，加70％甲醇适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含黄色素1.0mg)。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.5ml、3.0ml、4.5ml、6.0ml、7.5ml、9ml、10.5ml，分别置50ml量瓶中，各加70％甲醇至刻度，摇匀，以相应的溶液为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，在403nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法：精密量取本发明注射用丹红2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，作为空白对照，另精密量取1ml，置10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，依法立即测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于黄色素的重量，计算，即得。
本发明注射用丹红含黄色素应不低于25％。
实验例4：注射用丹红与丹红注射液稳定性的比较
将本发明所述注射用丹红和相应的丹红注射液同置于37℃恒温恒湿箱中存放。定时抽样检查(丹红注射液每天检查澄明度)，共3个月，检查项目如下：
外观检查：丹红注射液：一般观察颜色是否变深；
注射用丹红：是否变形萎缩，颜色是否变深；
澄明度检查：丹红注射液：灯检是否有沉淀物析出；
注射用丹红：取一瓶加5ml蒸馏水，观察溶解时间，20秒内为速溶，视为合格。灯检是否有沉淀物析出。
药液pH值检查：丹红注射液：用25型pH计测定药液pH值；
注射用丹红：取一瓶加5ml蒸馏水溶解后，用25型pH计测定药液pH值。
主要成分原儿茶醛与丹参素的含量测定
按上述方法分别测定丹红注射液与注射用丹红的原儿茶醛与丹参素的含量。
表4结果显示丹红注射液很不稳定，加速试验60天即发生沉淀，pH值及原儿茶醛与丹参素的含量均明显下降。
将注射用丹红置于37℃连续考察3个月，实验结果见表5。注射用丹红的外观、色泽、水溶性、pH值及原儿茶醛与丹参素的含量均无明显变化，质量稳定，另外每批含水量测定，均在2％以下。结果表示注射用丹红稳定性良好，优于丹红注射液。
表4丹红注射液37℃加速试验结果