编码半胱氨酸蛋白酶的基因和启动子及生产雄性不育水稻的方法.pdf

本发明涉及一种编码半胱氨酸蛋白酶的新基因，该基因在水稻花粉囊中特异性表达，本发明还涉及该基因的花粉囊特异性启动子，以及一种通过抑制所述基因的表达来制备雄性不育水稻的方法。本发明的rCysP1基因是一种编码半胱氨酸蛋白酶的新基因，该基因在水稻花粉囊中特异性表达，因此与花粉发育相关。因此，抑制该基因的表达可能用于制备雄性不育水稻，由于这种抑制在水稻中导致花粉退化，因此该种水稻能够控制种子的生成。此外，本发明的上述基因还可用于其它禾本科植物，并利用过度表达表现出的对抗特性而显示出优势。

1.  一种在水稻中编码半胱氨酸蛋白酶的基因的核苷酸，具有SEQ.IDNO.1序列，该序列在水稻(Oryza sativa L.)花粉囊中特异性表达，并与花粉发育相关。

2.  一种具有SEQ.ID NO.4的水稻半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列，该序列在水稻(Oryza sativa L.)花粉囊中特异性表达，并与花粉发育相关。

3.  一种具有SEQ.ID NO.5的基因启动子的核苷酸序列，所述基因编码半胱氨酸蛋白酶，其中所述的启动子在水稻(Oryza sativa L.)花粉囊中具有特异性活性。

4.  一种制备雄性不育水稻的方法，该方法包括下述步骤：
(a)通过将T-DNA插入至水稻基因组来抑制具有SEQ.ID NO.1的编码半胱氨酸蛋白酶的基因表达；
(b)选择纯合子突变株植物，所述纯合子突变株在T2代植物中表现出植株高度矮小、开花和种子发芽延迟、以及花粉退化；以及
(c)利用选定突变株的分蘖进行无性繁殖。

编码半胱氨酸蛋白酶的基因和启动子及生产雄性不育水稻的方法
技术领域
本发明涉及一种在水稻花粉囊中特异性表达的编码半胱氨酸蛋白酶(rCysP1)的新基因及其启动子，以及通过抑制该基因的表达来生产雄性不育水稻的方法。更特异地，本发明的方法利用T-DNA基因捕捉系统并揭示与花粉发育相关的基因功能，从T-DNA插入型水稻Oryza sativa L.库中分离水稻花粉囊特异性半胱氨酸蛋白酶基因，通过抑制编码半胱氨酸蛋白酶基因的表达来向植物中引入不育特性。
背景技术
在迄今已经报道的半胱氨酸蛋白酶中，并没有报道在花粉囊中表达的基因具有与不育功能相关的功能。迄今为止已经发展出来的诱导植物雄性不育的技术仍是利用花粉囊的选择性死亡来实现的，该选择性死亡是通过诱导外源毒性基因来完成的。因此，本发明采用水稻花粉囊特异性基因来诱导水稻雄性不育的技术本身涉及花粉的发育，因此该技术是新的且是非常有价值的。
水稻植物是一种生产稻谷的植物，稻谷是世界上包括韩国在内的三分之一以上人口地主食，其是一种重要的经济型农作物。世界上所有的研究人员都关注通过诱导雄性不育来产生F1杂交从而增加植物产量的技术。通过细胞质雄性不育(CMS)的方法可以在水稻植物中诱导雄性不育，从而制备F1杂交，但是，该方法在使用中并不经济且不实用。还可利用遗传工程的方法来产生雄性不育的转基因水稻植物。但是，该方法使用带有绒毡层特异性(tapetum-specific)启动子的外源毒性基因(细菌或植物基因)来诱导花粉囊器官的选择性死亡，从而导致不育。
花粉囊是开花植物的雄性生殖器官，其包括绒毡层、药室内壁、结缔组织、以及维管束。花粉囊还具有传授花粉的功能。花粉囊的发育性过程分成两个阶段：在第一阶段，在花粉囊形状形成后通过花粉粒母细胞的减数分裂而形成四合花粉粒；在第二阶段，发生花粉和花粉囊分化、组织退化、破裂并释放花粉。在诸多参与了这一发育性过程的基因中，仅有一些在花粉囊中特异性表达。
半胱氨酸蛋白酶在广泛分布的动物、植物以及微生物系统中对细胞内蛋白降解起到重要作用。蛋白降解得到的氨基酸能够再次用于新蛋白质的合成。对高等植物种子中的半胱氨酸蛋白酶(CysP)进行了详细研究，这是由于这些蛋白水解酶被认为是萌发过程中的主要酶(Shutov and Vaintraub，Phytochemistry 26，1557-1566，1987；Ryan and Walker-Simmons，Proteins andNucleic acids.Vol 6，321-350 1991；Ho et al.，Plant Physiol.122，57-66，2000)。可通过对储存在胚乳中的淀粉和储存蛋白进行水解来为种子发芽提供营养。已有报道说，CysPs是对大麦和水稻中大部分储存蛋白、大麦醇溶蛋白、以及谷蛋白进行水解的主要的酶(Rostog and Oaks，Plant Physiol.81，901-906，1986；Kato Minamikawa，Eur.J.Biochem.239，310-316，1996)。CysPs还在细胞进行程序性细胞死亡(PCD)的过程中起作用(Solomon et al.，Plant Cell 11，431-443，1999)：在大豆细胞的PDC过程中，发现该酶的生成增加并调节。
因此，为了生产雄性不育水稻同时克服现有技术的问题，本发明人从2002年开始利用水稻T-DNA插入系筛选了涉及雄性不育性状的基因。结果发现了一种新的半胱氨酸蛋白酶，该酶与普通的在种子中特异性表达并与种子发芽的半胱氨酸蛋白酶不同，它在花粉囊中特异性表达，并鉴别出它与花粉的发育有关。
本发明的公开
因此，本发明的一个目的就是提供一种新的编码半胱氨酸蛋白酶的基因，该半胱氨酸蛋白酶在水稻花粉囊中特异性表达，且与花粉的发育相关。
本发明的另一目的是提供了一种编码半胱氨酸蛋白酶的基因的启动子，该半胱氨酸蛋白酶在水稻花粉囊中具有特异性活性。
本发明进一步的目的在于提供一种通过抑制所述基因的表达来生产雄性不育水稻的方法。
为了完成上述目的，本发明提供了一种新的编码半胱氨酸蛋白酶的基因，其中所述的半胱氨酸蛋白酶在水稻花粉囊中特异性表达且与花粉发育相关，该基因具有SEQ.ID NO.1的核苷酸序列，其氨基酸序列为SEQ.ID NO.4。
为了完成另一目的，本发明提供了编码半胱氨酸蛋白酶基因的启动子，该半胱氨酸蛋白酶在水稻花粉囊中具有特异性活性，其中所述的启动子具有SEQ.ID NO.5的核苷酸序列。
为了完成本发明的进一步目的，本发明还提供了一种通过抑制上述基因的表达来生产雄性不育水稻的方法。
本发明的基因-rCysP1基因，是一种新的编码半胱氨酸蛋白酶的基因，它是从水稻T-DNA插入系中分离出来的，在水稻花粉囊中特异性表达，且与花粉发育相关，该基因以SEQ.ID NO.1的核苷酸序列表示。图1a所示为rCysP1基因的示意图，rCysP1的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示。
在图1a中，右端的闭合的黑色长方形代表rCysP1基因的外显子，左端的灰色框代表该基因的启动子区域，该基因也是反向PCR的产物。用开放的倒三角来显示T-DNA的插入位点。T-DNA在右端(BR)和左端(BL)之间含有gus和匀霉素抗性(hph)基因。箭头显示了用于基因型T2代的三个引物(a，b和c)。
同时，在显示rCysP1基因核苷酸序列的SEQ.ID NO.1中，在5’和3’末端分别含有GT和AG序列的内含子存在于推定的氨基酸编码区域(星号之间)的No.454位密码子和No.457密码子之间。在编码区域的5’非编码序列中，推定TATA盒序列-TATAAAT存在于No.-139位碱基和No.-145位碱基之间；在3’非编码区域中，推定的多腺苷酸信号-AATAAA存在于No.2179位碱基和No.2184位碱基之间。rCysP1基因的花粉囊特异性启动子存在于包含TATA盒序列的5’非编码序列、No.-119位碱基和No.-2333位碱基之间。编码区域的Cys¹⁸⁰，His²⁹⁷和Asn³³⁹与木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶中保守的催化三联体一致。存在于除组织蛋白酶B之外所有木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶中的ERFNIN单元(motif)相同序列(Karrer etal.，1993)也在rCysP1氨基酸序列的Glu^-84和Asn^-103之间找到。但是，发现rCysP1基因利用Val而非Ile(Akasofu et al.，Nucleic Acids.Res.17，6733，1989)。T-DNA插入至5’非编码序列的-86碱基和-87碱基之间的位点(图1b，垂直箭头)。
上述编码区域的ORF编码总共490个氨基酸，其以SEQ ID NO.4的氨基酸序列代表。
对该侧翼序列进行数据搜索显示，ORF位于contig8664(http：//btn.genomics.org.cn：8080/rice/)、OSJNBa0043A12(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、以及AK107506(http：//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)上。利用推断的氨基酸序列进行同源性检索发现：在从植物中发现的半胱氨酸蛋白酶中，最高的同源性发生在水稻oryzain β上，在核苷酸和氨基酸序列上分别有89％和69％的同源性。因此，本发明的基因属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶家族。
本发明中rCysP1基因的表达被暂时性且位置特异性地控制。位置特异性是指rCysP1基因在水稻花的花粉囊器官中高度表达，但是在根部以及没有花粉囊的花中表达很弱或几乎不表达，在叶中完全不表达。特异地，rCysP1基因仅在花粉囊器官的绒毡层以及花粉中表达，但不在维管束或者结缔组织中表达。此外，本发明的基因在发芽的种子中转录积聚物的含量非常有限，水稻的rCysP1-标记的T-DNA插入系显示出花粉囊器官中的花粉退化，暗示rCysP1基因在花粉发育中发挥了重要的作用。另一方面，暂时性地，当花成熟后，rCysP1基因的表达水平增加。特异地，该基因在成熟的花中具有最高水平的表达。这些结果暗示，本发明的rCysP1基因属于花的发育阶段的后期表达基因。
本发明rCysP1基因的水稻花粉囊特异性启动子具有SEQ.ID NO.5的核苷酸序列。该启动子能够通过常规的克隆方法从水稻基因组DNA中获得。例如，可利用根据SEQ.ID NO.5正确设计的引物通过常规的RCR反应制得。
在对rCysP1-标记的T-DNA插入系水稻的T2代进行基因型分析时，该T-DNA在后代中共分离。纯合子rcysp1突变型表现出严重的生长和发育延迟；种子发芽延迟了7-9天，根和苗正常生长，但生长矮小，结果使植物的高度缩短。特异地，对圆锥花序，突变的植物包含几个未受精的花，这些花为绿色，开花延迟约15天。因此，从rcysp1突变型获得的种子形成的数量减少。此外，rcysp1突变型植物显示出异常的花粉发育。第一个可检测的异常信号是在从花粉粒阶段释放为单核花粉阶段观察到的。在该阶段，在花粉囊中观察到非常有限数目的花粉，其中的一些正处于细胞死亡。当花粉进入空泡花粉阶段时这种花粉退化变得更加严重，因此，rCysP1突变型的花粉囊在成熟阶段则包含的是完全空泡的小室。
由上可知，本发明的rCysP1基因是一种新的基因，其编码在水稻花粉囊中表达的半胱氨酸蛋白酶，因此与花粉的发育相关。由于对所述基因表达的抑制将导致水稻中花粉生成的抑制，因此可能利用这种抑制来制备雄性不育水稻，控制种子的生成。此外，本发明的rCysP1基因也可用于其它禾本科，例如小麦、玉米、印度稷或果园草等，并利用过度表达表现出的对抗特性而显示出优势。
另一方面，水稻的每株植物具有几个分蘖，可通过人工分离分蘖并将其移走来进行无性繁殖。利用本发明的rCysP1基因制备雄性不育水稻的方法也可据此进行无性繁殖。
本发明通过下述的实施例进行了详细解释。但是，应该理解，本发明的范围并非囿于其中。
附图简要说明
通过下面的详细描述并结合附图将更加清楚地说明本发明的上述目的、特征以及优点，其中：
图1a和1b是含有启动子的rCysP1基因的示意图及其序列。其中，图1a显示了rCysP1基因及其结构，以及T-DNA的插入位点；图1b显示了rCysP1核苷酸以及推断出的氨基酸序列；
图2a和2b显示了植物中发现的半胱氨酸蛋白酶推断出的氨基酸序列的比较。图2a显示了半胱氨酸蛋白酶的排列；图2b显示了在植物中观察到的代表性半胱氨酸蛋白酶的演化树；
图3a、3b、3c和3d显示了rCysP1的基因组DNA印迹以及RT-PCR分析。图3a显示了rCysP1的基因组DNA印迹；图3b显示了rCysP1基因在不同器官中的转录聚集物(花粉囊、无花粉囊的花、叶以及根)；图3c显示了在花的不同发育阶段的瞬时表达；图3d也显示了rCysP1在发芽种子中的转录聚集物；
图4a、4b、4c、4d和4e显示了rCysP1标记水稻的GUS表达，特别是rCysP1启动子的花粉囊特异性表达。其中，图4a显示了在不同发育阶段的花中GUS的表达；图4b为光学显微镜下GUS表达的花粉囊的解剖图，显示了rCysP1基因的定位；图4c也显示了限制于花粉囊室中的GUS表达(箭头)；图4d显示了未表达GUS的叶；图4e显示了未表达GUS的根；A代表水稻的花粉囊，S1代表不育外稃，P代表内稃，Po代表花粉，T代表绒毡层，V代表维管束。
图5a、5b、5c、5d、5e和5f显示了rCysP1 T2代的基因型以及rCysP1纯合子突变型的表现型；其中，图5a为rCysP1-标记T-DNA水稻的T2代基因型分析；图5b为图5a扩增产物的电泳分析，泳道2，5，9，10，11，14，15和17为纯合体，而泳道1，3，4，6，7，8，12，13，16和19为杂合体；图5c是在突变株植物中观察到了根和嫩苗的正常生长；图5d显示成熟的rcysp1突变株植株矮小；图5e显示突变株形成的圆锥花序中包含一些未受精的花；图5f显示突变株整体生长严重滞后。
图6a显示了rCysP1突变型以及野生型完全成熟植物的形态测定分析。图6b显示了每一圆锥花序中的受精(种子形成)比率。同时，图6c和图6d显示了rCysP1突变型和野生型的花粉囊的四唑染色。在rCysP1突变型的花粉囊中，由于花粉的生成退化，因此未观察到染色的花粉；以及
图7中a-j显示了野生型花粉囊发育的细胞学分析，k-t显示了rCysP1突变型花粉囊发育的细胞学分析。
本发明最佳实施方式
实施例1：rCysP1基因的克隆和测序
(1)首先，按照Jeon et al.(Jeon et al.，2000，T-DNA insertionalmutagenesis for functional genomics in rice，Plant J.22，561-570)描述的方法生产水稻T-DNA插入系(Oryza sativa L.)，其中GUS基因转录子随机插入至该植物的基因组中，并按照Gothandam et al.(Gothandam et al.，2003，Identification of anther-specific gene expression from T-DNA tagging rice，Mol.Cells 15，102-109)描述的方法在水稻T-DNA插入系的T2代中筛选GUS的表达。选择在花粉囊中有特异性GUS表达的T-DNA标记的细胞系并进一步分析其特性(图4)。
(2)利用位于T-DNA区域的GUS转录序列设计引物，进行反向PCR确定T-DNA侧翼序列(图1a)。
利用Triglia et al.(Triglia et al.，1988，A procedure for in vitro amplificationof DNA segment that lie outside the boundaries of known sequences.Nucl.AcidsRes.16，8186)描述的方法进行反向PCR，用Pst I限制性内切酶消化1μg基因组DNA，消化时间为12小时。通过加入乙醇沉淀来停止反应，将DNA重悬于40μl水中。然后利用T4 DNA连接酶使重悬的基因组DNA进行自连接。在含有20ng DNA、1×E×Taq缓冲液、0.2mM dNTP、0.5单位E×Taq聚合酶(Takara，Japan)、以及1μM引物的50μl的混合物中进行PCR反应。在反向PCR反应中所用的引物为：5’-TTG GGG TTT CTA CAG GACGTA AC-3’(反向)和5’-GAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATC-3’(正向)。
反向PCR的结果揭示：T-DNA已经整合入水稻基因组1,666bp长的开放阅读框(ORF)的上游区域。对侧翼序列的数据搜索显示，该ORF位于contig8664(http：//btn.genomics.org.cn：8080/rice/)、OSJNBa0043A12(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、以及AK107506(http：//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)。
(3)对基因组DNA进行分离并测序。对该基因组DNA的氨基酸序列和在植物中发现的半胱氨酸蛋白酶Oryzainβ(Oryza sativa，P25777)、Zeamays(Zea mays，AAB70820.2)、Douqlas fir(Pseudotsuga menziesii，JC4848)、Tabacco(Nicotiana tabacum，TP3941)、以及Rape(Brassica napus，JQ1121)进行同源性寻找。
序列分析的结果如图1所示，该ORF编码总共490个氨基酸。
同源性寻找的结果如图2a所示。在图2a中，用带黑影的方框表示相同的氨基酸残基，用带灰影的方框表示相似的残基。星号表示ERFNIN单元的相同序列，划线的为木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶的肽酶C1结构域。推断的翻译后断裂位点用垂直的箭头标记。
最高的同源性发生在水稻oryzainβ序列中，核苷酸和氨基酸序列分别具有89％和69％的相似性。Oryzain β，以及oryzainα和γ，属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶家族(Watanabe et al.，J.of Biol.Chem.266，16897-16902，1991)。rCysP1基因含有ERFNIN单元的相同序列，该单元在除了cathepsin B的所有木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶中存在(Karrer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，3063-3067，1993)，发现该相同序列在rCysP1氨基酸序列的Glu^-84和Asn^-103之间。如Karrer et al.(1993)所述，尽管两种水稻半胱氨酸蛋白酶rCysP1和Oryzain β具有同一单元序列(图2a)，但已发现共有序列EX₃RX₂(V/I)FX₂NX₃IX₃N在种属之间有变化。与其它半胱氨酸蛋白酶不同，在哺乳动物系统中，发现两种半胱氨酸蛋白酶用Val代替Ile(图1b)。在rCysP1的氨基酸序列中发现了在木瓜蛋白酶家族成员中保守的催化三联体Cys¹⁸⁰-His²⁹⁷-Asn³³⁹(图1b)。该结果与在植物中观察的代表性半胱氨酸蛋白酶的演化分析相一致。演化分析的结果如图2b所示。在演化分析中所用的半胱氨酸蛋白酶为马铃薯(Solanum tuberosum，CAB53515.1)、番茄(Lycopersicon esculentum，YO6416)、豌豆(Pisum sativum，S24602)、芸苔o.(Brassica oleracea，AAL60579.1)、道格拉斯冷杉(diuglas fir)(Pseudotsugamenziesii，JC4848)、clove pink(Dianthus caryophyllus，AAA79915.1)、红肾豆(Phaseolus vulgaris，CAB17076.1)、野豌豆(Vicia sativa，S47312)、烟草(Nicotiana tabacum，TO3941)、拟南芥(Arabidopsis thaliana，AAK92229.1)、大油菜(rape)(Brassica napus，JQ1121)、玉米1(Zea mays，AAB70820.1)、玉米2(Zea mays，TO1206)、玉米3(Zea mays，TO1207)、oryzainα(Oryzain sativa，P25776)、oryzain β(Oryzain sativa，P25777)、大麦(Hordeum vulgare，TO6208)、Christmas(Sandersonia aurantiaca，AAD28477.1)、以及甘薯(Ipomoea batatas，AAK27968.1)。
总体说来，该结果意味着rCysP1基因在水稻中编码半胱氨酸蛋白酶。
(4)DNA印迹分析确定水稻基因组中的基因组复杂性。
将水稻叶在液氮中研磨成粉，重悬于萃取缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.0，50mM EDTA，500mM NaCl和1.25％SDS)中。当用苯酚/氯仿(1∶1，v/v)连续萃取后，利用乙醇沉淀来浓缩水相。沉淀用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.4，1mM EDTA)重悬。用EcoR I，HindIII和Pst I酶来消化13μg基因组DNA，然后用0.8％琼脂糖电泳。变性并中和后，将DNA印迹到尼龙膜上。将烘干的膜在65℃预杂交2小时，然后用两个^32-P标记的rCysP1基因特异性探针杂交过夜。两个探针分别从全长rCysP1克隆和该基因的5’-UTR区域制得。杂交后，在65℃下用2×SSC，0.5％SDS洗涤膜两次，共5分钟，然后用2×SSC，0.1％SDS洗涤两次，共5分钟。
结果如图3a所示。在图3a中，E代表EcoRI酶，H代表HindIII酶，P代表Pst I酶。泳道1-3显示了用来自全克隆的探针杂交的结果，泳道4-6显示了用来自该基因的5’-UTR区域的探针杂交的结果。左侧所示为尺寸标记。
结果显示，来自于全基因的探针与一个以上的条带进行杂交，显示rCysP1基因在水稻基因组中是作为一个小的基因家族存在(图3a)。来自于rCysP1的5’-UTR区域的探针特异性识别基因组中的rCysP1基因(图3a右侧)。
实施例2：用RT-PCR分析来研究水稻中rCysP1基因的表达模式
利用RT-PCR分析来检测rCysP1基因的表达模式(图3)。
(1)首先，为了研究水稻花粉囊、无花粉囊的花、叶、以及根中的rCysP1转录聚积物，以及在不同发育阶段水稻花中基因的瞬时表达，利用RNA分离试剂盒(TRI reagent，Molecular Research Center，Cincinnati，OH)从不同的器官中分离总RNA，利用该总RNA和逆转录酶一起合成cDNA模板。在下述条件下进行RT-PCR：94℃孵育5分钟，然后在94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 50秒，共进行30个循环，然后在72℃延长5分钟。
检测rCysP1转录子的引物为：5’-AAG TGC AAC CTC GCC AAG AG-3’(正向)以及5’-CCG GAG TCC TGA TAT TGT ACG-3’(反向)。用作对照的OsActin引物为：5’-TCC ATC TTG GCA TCT CTC AG-3’(正向)以及5’-GTA CCC GCA TCA GGC ATC TG-3’(反向)。
结果如图3b和图3c。在图3c中，泳道1、2和3分别代表年轻的花、未成熟的花以及成熟的花。如图3b所示，基因转录物在花粉囊中高度聚集，但是在根和叶表达很少，而在没有花粉囊的花中几乎不表达。这一结果暗示，该基因为花粉囊优先型。并且，如图3c所示，rCysP1基因在水稻花的后期发育阶段表达更多。
(2)此外，由于rCysP1与Oryzainβ具有同源性，因此还将种子发芽阶段rCysP1基因的表达与Oryzainβ的表达相比较，其中已知Oryzainβ在种子发芽中具有活性。采用由Oryzainβ序列发展出的引物作为阳性对照，以显示PCR反应是否正确完成。
5’-TGACATCAACAGGGAAAATGCT-3’(正向)
5’-GTGTTCAGTTTAGCGAGCGTG-3’(反向)
RT-PCR的结果如图3d所示。在图3d中，1d、3d和5d分别表示发芽1天、3天和5天。如图3d所示，在种子发芽过程中，Oryzainβ的转录物高度聚集，如前述研究的结果所示(Watanabe et al.，1991)。但是，rCysP1转录物的聚集更加优选在花粉囊中进行，而在发芽的种子中仅有非常少量的转录聚集物。上述结果说明发芽过程可能不是rCysP1的主要靶点，该基因参与的是花粉发育的过程。
实施例3：确定水稻中rCysP1启动子的活性
rCysP1基因启动子的活性是利用rCysP1-标记T-DNA水稻的T2代通过组织化学GUS检测进行测定的(图4)。
收集水稻的多个器官(花、根和叶)来进行GUS检测。将水稻花粉成两部分：花粉囊，以及通过去除花粉囊得到的没有花粉囊的剩余的花。按照Jefferson et al.(Jefferson et al.，1987，GUS fusion：β-D-glucuronidase as ssensitive and versatile gene fusion marker in higher plants，EMBO J.6，3901-3907)描述的方法，仅仅作少量改动，来进行本发明GUS活性的组织化学分析。将样品在溶液(含有100mM磷酸钠，pH 7.0，0.1％5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸，5mM氰亚铁酸钾，5mM铁氰化钾，10mM EDTA，0.5％Triton x-100，和20％乙醇)中于37℃孵育过夜。然后用70％乙醇洗涤样品，在立体显微镜下检测。
为了研究花粉囊中的瞬时GUS表达，收集不同发育阶段的三种花(年轻的花、未成熟的花、成熟的花)进行GUS检测。为了进一步分析启动子的活性，将取自rCysP1突变株的花粉囊器官在溶液(含有4％(w/v)多聚甲醛，0.5％(w/v)戊二醛，和100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0))中4℃固定过夜。然后样品用乙醇系列脱水，包埋于丙烯酸树脂(London Resin Company，London，UK)中。将树脂包埋的花的样品用超薄切片机(LKB，Bromma 2088)切成1μm厚的薄片，然后用番红O负染。在光学显微镜(Zeiss)下检测组织切片。
结果如图4所示。图4a显示了在不同发育阶段的花中GUS的表达，图4b为光学显微镜下GUS表达的花粉囊的解剖图，显示了rCysP1基因的定位。图4c也显示了限制于花粉囊室中的GUS表达(箭头)。图4d和图4e分别显示了未表达GUS的叶和根。在图4中，A代表水稻的花粉囊，S1代表不育外稃。P代表内稃，Po代表花粉。T代表绒毡层，V代表维管束。
如图4a所示，在未成熟的花中，看不到GUS的表达。最高水平的表达是在成熟的花中。这一结果暗示，该基因属于花粉囊的后期表达基因。此外，如图4b-4e所示，rCysP1启动子在花粉囊中是高活性的，但是在花的其它器官中却并未如此(图4b)。在维管束或其它结缔组织中并未检测到GUS的表达。在小室中，在绒毡层和一些发育的花粉中观察到了GUS的表达。但是，与实施例2的结果不同，在水稻的叶和根等其它植物器官中，并未检测到GUS的表达(图4b和4e)。在发芽的种子中也没有观察到GUS的表达。这可能是因为rCysP1启动子的活性太低以至于不能给出可检测的GUS表达水平，尽管这些器官(除叶以外)中都具有少量的转录聚集物(图3)。本发明人还发现rCysP1-标记T-DNA水稻的花粉囊在花粉发育中具有显著的缺陷，即，花粉退化(图4d)。综合来说，这些结果暗示，rCysP1基因参与了花粉发育。
实施例4：T-DNA的共分离以及纯合子突变株的表现型
(1)为了研究T-DNA的遗传分离，生产rCysP1-标记T-DNA水稻的T2代并分析基因型。将从总共19株T2代的年轻叶中提取的基因组DNAs用作基因型分析，以确定它们的纯合或杂合性。PCR反应条件：94℃ 1分钟，57℃ 1分钟，72℃ 2分钟，总共进行35个循环。下述引物a、b和c用于PCR反应。
引物a(rCysP1基因特异性正向引物)：
5’-ATCGAAAAGAAGACCTAAAGAAGCA-3’
引物b(rCysP1基因特异性反向引物)：
5’-AACTTGAGGTTGTCCCTACAGGACGTAAC-3’
引物c(T-DNA边缘特异性反向引物)：
5’-TTGGGGTTTCTACAGGACGTAAC-3’
如图5a的示意图所示，引物a是来源于rCysP1基因的上游区域的正向引物，引物b是来源于rCysP1基因编码区域的反向引物。引物c也是来源于T-DNA区域的反向引物。引物a和c组合制得了0.9kb的PCR片段，允许该扩增的T2代植物只能是纯合子，这是因为通过引物a和b组合来扩增由于片段太大而不能扩增DNA片段(16.5kb)(图5a)。但是，野生型植物能够利用引物a和b的组合来制备单个1.1kb的PCR片段，这是由于在基因组中没有T-DNA插入，而杂合的T2植物可分别通过ac和ab的组合来制备0.9kb和1.1kb的PCR扩增物。
试验结果如图5b所示。泳道2，5，9，10，11，14，15和17为纯合体，而泳道1，3，4，6，7，8，12，13，16和19为杂合体。植物18为野生型。这些结果显示，T-DNA已经被共分离至下一代。
(2)由于预计纯合体植物能够通过T-DNA整合得到的rCysP1基因的功能性捕捉而传递突变表现型，因此进一步对纯合体植物的生长和发育进行定性。
试验结果如图5和图6所示。在纯合体rcysp1突变株中，种子发芽延迟了7至9天，但是它们最终生长为完全成熟的植株。分析17株完全成熟的rcysp1突变株和24株野生型植物的高度的结果，发现成熟的rcysp1突变株植株矮小，导致植株高度的降低(图5d，5f和6a)。在突变株植物中观察到了根和嫩苗的正常生长(图5c)，但是其整体生长严重滞后(图5f)。它们也在花中形成正常的圆锥花序。但是，形成的圆锥花序中包含一些未受精的花，从而使这些花仍为绿色(图5e，箭头)。在rcysp1突变株植物中每个圆锥花序的受精比率远低于野生型植物中的比率(图6b)，而且开花延迟了约15天。这可能是由于花粉囊的不正常发育造成的。
另一方面，还利用四唑染色在光学显微镜下观察了纯合体植物的许多花粉囊。利用含有1％(w/v)2，3，5-三苯基氯化四唑的50％蔗糖水溶液于28℃避光1小时来完成四唑染色。结果显示，纯合体植物并不包含有能生育的花粉(图6c)。因此，rcysp1突变株的种子形成数目降低(图6b)。
实施例5：rcysp1突变株在花粉发育中的细胞学特性
在光学显微镜下进一步研究花粉囊切片，以研究野生型和rcysp1突变体在花粉发育过程中的差别。为了完成这一目的，将花粉囊分成十个发育阶段，更特异地，两个花粉母细胞阶段，两个四合花粉阶段，一个花粉粒阶段，两个单核花粉阶段，一个空泡花粉阶段，以及两个成熟花粉阶段，并仔细研究了它们的细胞学特性。
将野生型以及rcysp1突变型的水稻花在溶液(含有4％(w/v)多聚甲醛，0.5％(v/v)戊二醛，以及100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0))中4℃固定过夜。然后将样品乙醇系列脱水，包埋于丙烯酸树脂(London Resin Company，London，UK)中。将树脂包埋的花的样品用超薄切片机(LKB，Bromma 2088)切成1μm厚的薄片，然后用含有0.1％碳酸钠的0.5％甲苯胺蓝染色。在光学显微镜(Zeiss)下观察组织切片。
为了研究rCysP1标记的花粉囊中GUS的表达，制备花粉囊样品，按前述方法剖开，用蕃红O染色后在光学显微镜下观察。也按照实施例4所述用四唑染色来对花粉囊样品进行观察。
结果如图7所示。在图7中，7a，7b，7k，和7l显示了花粉母细胞阶段的花粉囊的细胞学特性。7c，7d，7m，和7n显示了四合花粉阶段的花粉囊的细胞学特性。7e和7o显示了花粉粒阶段的花粉囊的细胞学特性。7f，7g，7p，和7q显示了单核花粉阶段的花粉囊的细胞学特性。7h和7r显示了空泡花粉阶段的花粉囊的细胞学特性。最后，7i，7j，7s，和7t显示了成熟花粉阶段的花粉囊的细胞学特性。同时，7a-7j还显示了野生型植物的花粉发育，7k-7t还显示了rcysp1突变型的花粉发育。dP表示退化的花粉，E表示表层。En表示内层，M1表示中间层。MSp表示花粉粒，PC表示壁细胞。PG表示细小花粉，PMC表示花粉母细胞，T表示绒毡，Tds表示四合花粉，vMS表示空泡花粉。箭头表示小室中异常的纤维性物质。尺度线为20μm。
如在上述实施例4中所观察到的，发现rcysp1突变体的花粉囊包含异常的花粉发育(图7q-t)。第一种可检测到的异常发现于从花粉粒阶段释放到单核花粉的阶段(图7q)。该阶段，在花粉囊中仅发现非常有限的花粉数目，其中一些正处于细胞死亡阶段。当花粉进入空泡花粉阶段时，这种花粉的退化变得更加严重，这一阶段，花粉失去了细胞质(图7r)。于是rcysp1突变株的花粉囊在成熟阶段为完全的空室，其中野生型的花粉囊在小室中包含完全成熟的细小花粉(图7i)。
工业实用性
如上所述，本发明的rCysP1基因是一种编码半胱氨酸蛋白酶的新的基因，该半胱氨酸蛋白酶在水稻花粉囊中表达，且与花粉发育相关。由于这种抑制能导致水稻中的花粉退化，因此，抑制该基因的表达可能用于制备雄性不育水稻从而控制种子的产量。此外，本发明的上述基因还可用于其它禾本科植物，并利用过度表达表现出的对抗特性而显示出优势。
                           SEQUENCE LISTING
<110>高丽大学校
<120>编码半胱氨酸蛋白酶的基因和启动子及生产雄性不育水稻的方法
<130>PIF041375C
<150>KR 2004-3156
<151>2004-01-16
<160>5
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>4557
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<220>
<221>promoter
<222>(1)..(2215)
<220>
<221>TATA_signal
<222>(2189)..(2195)
<220>
<221>CDS
<222>(2334)..(3695)
<220>
<221>Intron
<222>(3696)..(3888)
<220>
<221>CDS
<222>(3889)..(3996)
<220>
<221>polyA_signal
<222>(4512)..(4517)
<400>1
catacctgtt caactgcagc gatattagaa catccagttc cagccatcac caatttaacc     60
gatatatgat catactttga tctgtctgaa gatttcttca ggtcctttgc ttttgtttga    120
gcattattgc ttgtgctagc tacattggca tctgcctgta atttcataac ggataaaatt    180
aagattagta acagagcaag ttgagctaca acaggatctc actgtccttc cagggacaca    240
aaacaaccaa cagtttacaa tttggacagt gagaaacctt gataataact ggcattgcag    300
gaccttgaca tggatcttcc ctcagtctga cactattgta gtgctcaccc tgatgatacg    360
atctatattg gaatcaaaac aaaggaacat gagaatgtat gtccttttac tgccagtatt    420
agcatattag tttaaaacag cagaacacac attaacttac aaatgaatca tactggtagc    480
ttcacgatca gaaaagtttc ttatgtacca tcgtggtgag ttaagctgca aatcattcag    540
taatggtaca ggcatcaatc aaatgttaca gtacgttctc ttctatagaa gaaaggctat    600
aatatgaaaa tgagtacgaa aaataacaga gaaccatcag gggatatata agcagcacat    660
tgatctatat cacccatgtg tttcaaaata cagactaggc aaggctcaac tgcctagcgt    720
gttattcata ggttgaagaa atcatactgc aaagcttgta ttgaaaatta ccatgtggat    780
gcatatgttt tttctcttga gaatagaagc tgcttgcaac tccatatgac cagcccaagt    840
cccatcctca agcatagagt cacaatattt ctcaaacggt tcctcgtcct caatgaatgg    900
ctcaaaatcc acacggtgct cctgtaagat gcatacaaga aagattatga agtgtaaata     960
ggccaatgct tgcttgcagc atgtctttta gataaaagaa caacccagcc tggcagcctg    1020
tactctacgc ccagatcaga tgtacacagc caaagtttgc agcatgtgca ataccttatt    1080
gattcaatgg caccctaatt acagttctta agtcacagtg ttacaagatg tttcttggtc    1140
atagccaaag cttgcagtat ttctaatacc ttattgattc aatggcaccc taactacagt    1200
tattaagtca cagtgttaca agatgtttgt tttggtcatc tcatctgatg cataccttaa    1260
tgtattgcac aatcattgca cggtacttca tgtgctcttc ctcgttgcct tcgagctggt    1320
cgcccattgc cctgcagact acgatgagta accatataac acaagactgc ataatgcata    1380
tactattcct cctttcataa actaacagta ctctaacata tcgtacaaca tcgattagcc    1440
tcttcttgta aaaagtggca agaatttgag taatggaatc gaaaagaaga cctaaagaag    1500
cagttgccat ccgcactaac ttcgataatc ttcaacccca gcgagtccag ctgcgcccgg    1560
aactccgtca tgtcggcctt cttcgcgaac ttcttctcct cctaacaaat caatcaccaa    1620
aaggaaaaaa aaacgagaaa atatattagc taaagctcaa ttccccttcc accaaaaacg    1680
atccaatctc cagctgactg aggcgcgggg tattactgca tcacgcttcg gcttccgggc    1740
tttgggcgcc gccacggcta ccttcttctt gttccgagcc attacgacac gtgcggtagt    1800
agtggagtct cgcctagatt tccccgcggc ggcggcggcg gcgaggggga ggggaggcgg    1860
aatcgcagat agtatcaaat cgtactctac cagaagcccg gagaagaaat cggatgggaa    1920
aaggaagagg agaagagaag agaagtcgtc aggtgatatt tcgtgggcca aatgggccgg    1980
gccgtaacac ctcaatcccc aatctgctac ggcccgtgtg tgaacgtgac acgtcatcct    2040
atttagaatc gaataccgaa cctgaacgtg acacgtcaga tttaggagta gaaacgagta    2100
cactctacac gatacagatc caatacgaga ccgacacgtc gtcagcgacc aagtaaaatt    2160
cggtcacgaa ccgtacgcca ccaacctgta taaattcatc gaccgccaag cctctccaga    2220
acatagcaca agccaaccaa acaccgcacg atttcgtatc cacacatact tctacgtgat    2280
ttcgtttcga cgatctcgag gcgccgcggc gtgacgtgac gtcgacgaca acc atg       2336
                                                           Met
                                                           1
gca ggc ggt ggc ggc aag tcc gta gcg gcg gcg ctg gcc atg gcc tgc      2384
Ala Gly Gly Gly Gly Lys Ser Val Ala Ala Ala Leu Ala Met Ala Cys
            5                   10                  15
ttc ctc ctc atc ctc gcc gcc ttc gct ccc ccg gcg gcg gcg gcg ccg      2432
Phe Leu Leu Ile Leu Ala Ala Phe Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro
        20                  25                  30
ccg gac atc atg tcg atc atc agg tac aac gcg gag cac ggg gtg cgg      2480
Pro Asp Ile Met Ser Ile Ile Arg Tyr Asn Ala Glu His Gly Val Arg
    35                  40                  45
ggg ctg gag cgg acg gag gcc gag gcg cgc gcc gcg tac gac ctg tgg      2528
Gly Leu Glu Arg Thr Glu Ala Glu Ala Arg Ala Ala Tyr Asp Leu Trp
50                  55                  60                  65
ttg gcg cgg cac cgg cgc ggc ggc ggc ggc ggc tcg cgc aac ggg ttc      2576
Leu Ala Arg His Arg Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Gly Phe
                70                  75                  80
atc ggc gag cac gag cgc cgg ttc cgc gtg ttc tgg gac aac ctc aag      2624
Ile Gly Glu His Glu Arg Arg Phe Arg Val Phe Trp Asp Asn Leu Lys
            85                  90                  95
ttc gtc gac gcc cac aac gcc cgc gcc gac gag cgc ggc ggg ttc cgc      2672
Phe Val Asp Ala His Asn Ala Arg Ala Asp Glu Arg Gly Gly Phe Arg
        100                 105                 110
ctc ggg atg aac cgc ttc gcc gac ctc acc aac ggc gag ttc cgc gcc    2720
Leu Gly Met Asn Arg Phe Ala Asp Leu Thr Asn Gly Glu Phe Arg Ala
    115                 120                 125
acc tac ctc ggc acc acg ccc gcc ggc agg ggg cgc cgc gtc ggg gag    2768
Thr Tyr Leu Gly Thr Thr Pro Ala Gly Arg Gly Arg Arg Val Gly Glu
130                 135                 140                 145
gcg tac cgc cac gac ggc gtc gag gcg ctg ccg gac tcc gtg gac tgg    2816
Ala Tyr Arg His Asp Gly Val Glu Ala Leu Pro Asp Ser Val Asp Trp
                150                 155                 160
agg gac aag ggc gcc gtc gtc gcc ccc gtc aag aac cag ggc cag tgc    2864
Arg Asp Lys Gly Ala Val Val Ala Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys
            165                 170                 175
ggt agc tgc tgg gcg ttc tcg gcg gtc gcc gcc gtg gag ggc atc aac    2912
Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Val Ala Ala Val Glu Gly Ile Asn
        180                 185                 190
aag atc gtc acc ggc gag ctg gtg tcg ctg tcg gag cag gag ctg gtg    2960
Lys Ile Val Thr Gly Glu Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val
    195                 200                 205
gag tgc gcg agg aac ggg cag aac agc ggc tgc aac ggt ggg atc atg    3008
Glu Cys Ala Arg Asn Gly Gln Asn Ser Gly Cys Asn Gly Gly Ile Met
210                 215                 220                 225
gac gac gcg ttc gcc ttc atc gcc cgg aac ggc ggc ctc gac acg gag    3056
Asp Asp Ala Phe Ala Phe Ile Ala Arg Asn Gly Gly Leu Asp Thr Glu
                230                 235                 240
gag gac tac ccg tac acg gcc atg gac ggc aag tgc aac ctc gcc aag    3104
Glu Asp Tyr Pro Tyr Thr Ala Met Asp Gly Lys Cys Asn Leu Ala Lys
            245                 250                 255
agg agc cgc aag gtg gtg tcc atc gac ggc ttc gag gac gtg ccc gag    3152
Arg Ser Arg Lys Val Val Ser Ile Asp Gly Phe Glu Asp Val Pro Glu
        260                 265                 270
aac gac gag ctg tcg ctc cag aag gcc gtg gcg cac cag ccc gtc agc    3200
Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Lys Ala Val Ala His Gln Pro Val Ser
    275                 280                 285
gtc gcc atc gac gcc ggc ggc cgc gag ttc cag ctc tac gac tcc ggc    3248
Val Ala Ile Asp Ala Gly Gly Arg Glu Phe Gln Leu Tyr Asp Ser Gly
290                 295                 300                 305
gtg ttc acc ggc cgg tgc ggc acc aac ctg gac cac ggc gtg gtg gcg    3296
Val Phe Thr Gly Arg Cys Gly Thr Asn Leu Asp His Gly Val Val Ala
                310                 315                 320
gtg ggg tac ggc acg gac gcc gcc acc ggc gcc gcc tac tgg acg gtg    3344
Val Gly Tyr Gly Thr Asp Ala Ala Thr Gly Ala Ala Tyr Trp Thr Val
            325                 330                 335
cgc aac tcg tgg ggg ccc gac tgg ggc gag aac ggc tac atc cgc atg    3392
Arg Asn Ser Trp Gly Pro Asp Trp Gly Glu Asn Gly Tyr Ile Arg Met
        340                 345                 350
gag cgc aac gtc acc gcg cgc acc ggc aag tgc ggc atc gcc atg atg    3440
Glu Arg Asn Val Thr Ala Arg Thr Gly Lys Cys Gly Ile Ala Met Met
    355                 360                 365
gcg tcc tac ccg atc aag aag ggg ccc aac ccg aag ccg tcg ccg ccg    3488
Ala Ser Tyr Pro Ile Lys Lys Gly Pro Asn Pro Lys Pro Ser Pro Pro
370                 375                 380                 385
tct ccg gcg cca tcg ccg ccg cag caa tgc gac cgg tac agc aag tgc    3536
Ser Pro Ala Pro Ser Pro Pro Gln Gln Cys Asp Arg Tyr Ser Lys Cys
                390                 395                 400
ccg gcg ggg acc acc tgc tgc tgc aac tac ggg atc agg aac cac tgc    3584
Pro Ala Gly Thr Thr Cys Cys Cys Asn Tyr Gly Ile Arg Asn His Cys
            405                 410                 415
atc gtg tgg gga tgc tgc ccc gtc gag ggc gcc acc tgc tgc aag gat      3632
Ile Val Trp Gly Cys Cys Pro Val Glu Gly Ala Thr Cys Cys Lys Asp
        420                 425                 430
cac tcc acc tgc tgc ccc aag gag tat ccc gtc tgc aac gcc aag gct      3680
His Ser Thr Cys Cys Pro Lys Glu Tyr Pro VaI Cys Asn Ala Lys Ala
    435                 440                 445
cgc act tgc tcc aag gttttaaatt taaattttat gtttactttt aatttttaga      3735
Arg Thr Cys Ser Lys
450
gttgatttta gcgtttttat aagtaatttc tttttcatca ttgacttttt tttaagttgt    3795
taagaacata tgtaaaagtt acattggccg ctaatacgtg ttatgtctgt gtgtgttatg    3855
tgctcacacg ttgccatgtt ttttccttga cag agc aag aac agc ccg tac aat     3909
                                     Ser Lys Asn Ser Pro Tyr Asn
                                     455                 460
atc agg act ccg gcg gcg atg gca cga agt gtt ccg gaa caa cct gat      3957
Ile Arg Thr Pro Ala Ala Met Ala Arg Ser Val Pro Glu Gln Pro Asp
            465                 470                 475
tca atc tct ttt gta gtt ttg aat agg gaa gat cta gta tagaagcctt       4006
Ser Ile Ser Phe Val Val Leu Asn Arg Glu Asp Leu Val
        480                 485                 490
atctttgtta ctgttaccga gtcctttatt attatcgctc tttttttttc gcaagatgta    4066
taaagtccta aacagttact gttactatta ctgaagttat tatctatctt tggatatgag    4126
ttctcccaag tacagcatca cgtgttgtta cagctctatc gtttgttttt tagggtgtgt    4186
ttagtttacg aaaaaaaaat tggtatcaca tcgaacgttt gatcgacgtt gaaaggggtt    4246
ttcggatacg aatgaaaaaa ctaatttcat aactcgcttg gaaaccgcga gacgaattta    4306
ttaagtctaa ttaatccgtc attagcacat gttggttact gtagcattta tgactaatca    4366
tggactaatt aggctcaaaa gattcgtctc acgatttcca tgtaaactgt gcaattagtt    4426
ttttaatcta tatttaacgc ccgatgcatg tgtccaaaga ttcgatgtaa tatttttaga    4486
gaaaaaaatt gggaactaaa ttattaataa acgttacagc tgacaaatgg gattgtagct    4546
tttgactgag t                                                         4557
<210>2
<211>454
<212>PRT
<213>Oryza sativa
<400>2
Met Ala Gly Gly Gly Gly Lys Ser Val Ala Ala Ala Leu Ala Met Ala
1               5                   10                  15
Cys Phe Leu Leu Ile Leu Ala Ala Phe Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala
            20                  25                  30
Pro Pro Asp Ile Met Ser Ile Ile Arg Tyr Asn Ala Glu His Gly Val
        35                  40                  45
Arg Gly Leu Glu Arg Thr Glu Ala Glu Ala Arg Ala Ala Tyr Asp Leu
    50                  55                  60
Trp Leu Ala Arg His Arg Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Gly
65                  70                  75                  80
Phe Ile Gly Glu His Glu Arg Arg Phe Arg Val Phe Trp Asp Asn Leu
                85                  90                  95
Lys Phe Val Asp Ala His Asn Ala Arg Ala Asp Glu Arg Gly Gly Phe
            100                 105                 110
Arg Leu Gly Met Asn Arg Phe Ala Asp Leu Thr Asn Gly Glu Phe Arg
        115                 120                 125
Ala Thr Tyr Leu Gly Thr Thr Pro Ala Gly Arg Gly Arg Arg Val Gly
    130                 135                 140
Glu Ala Tyr Arg His Asp Gly Val Glu Ala Leu Pro Asp Ser Val Asp
145                 150                 155                 160
Trp Arg Asp Lys Gly Ala Val Val Ala Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln
                165                 170                 175
Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Val Ala Ala Val Glu Gly Ile
            180                 185                 190
Asn Lys Ile Val Thr Gly Glu Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Glu Leu
        195                 200                 205
Val Glu Cys Ala Arg Asn Gly Gln Asn Ser Gly Cys Asn Gly Gly Ile
    210                 215                 220
Met Asp Asp Ala Phe Ala Phe Ile Ala Arg Asn Gly Gly Leu Asp Thr
225                 230                 235                 240
Glu Glu Asp Tyr Pro Tyr Thr Ala Met Asp Gly Lys Cys Ash Leu Ala
                245                 250                 255
Lys Arg Ser Arg Lys Val Val Ser Ile Asp Gly Phe Glu Asp Val Pro
            260                 265                 270
Glu Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Lys Ala Val Ala His Gln Pro Val
        275                 280                 285
Ser Val Ala Ile Asp Ala Gly Gly Arg Glu Phe Gln Leu Tyr Asp Ser
    290                 295                 300
Gly Val Phe Thr Gly Arg Cys Gly Thr Asn Leu Asp His Gly Val Val
305                 310                 315                 320
Ala Val Gly Tyr Gly Thr Asp Ala Ala Thr Gly Ala Ala Tyr Trp Thr
                325                 330                 335
Val Arg Asn Ser Trp Gly Pro Asp Trp Gly Glu Asn Gly Tyr Ile Arg
            340                 345                 350
Met Glu Arg Asn Val Thr Ala Arg Thr Gly Lys Cys Gly Ile Ala Met
        355                 360                 365
Met Ala Ser Tyr Pro Ile Lys Lys Gly Pro Asn Pro Lys Pro Ser Pro
    370                 375                 380
Pro Ser Pro Ala Pro Ser Pro Pro Gln Gln Cys Asp Arg Tyr Ser Lys
385                 390                 395                 400
Cys Pro Ala Gly Thr Thr Cys Cys Cys Asn Tyr Gly Ile Arg Asn His
                405                 410                 415
Cys Ile Val Trp Gly Cys Cys Pro Val Glu Gly Ala Thr Cys Cys Lys
            420                 425                 430
Asp His Ser Thr Cys Cys Pro Lys Glu Tyr Pro Val Cys Asn Ala Lys
        435                 440                 445
Ala Arg Thr Cys Ser Lys
    450
<210>3
<211>36
<212>PRT
<213>Oryza sativa
<400>3
Ser Lys Asn Ser Pro Tyr Asn Ile Arg Thr Pro Ala Ala Met Ala Arg
1               5                   10                  15
Ser Val Pro Glu Gln Pro Asp Ser Ile Ser Phe Val Val Leu Asn Arg
            20                  25                  30
Glu Asp Leu Val
        35
<210>4
<211>490
<212>PRT
<213>Oryza sativa
<400>4
Met Ala Gly Gly Gly Gly Lys Ser Val Ala Ala Ala Leu Ala Met Ala
1               5                   10                  15
Cys Phe Leu Leu Ile Leu Ala Ala Phe Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala
            20                  25                  30
Pro Pro Asp Ile Met Ser Ile Ile Arg Tyr Asn Ala Glu His Gly Val
        35                  40                  45
Arg Gly Leu Glu Arg Thr Glu Ala Glu Ala Arg Ala Ala Tyr Asp Leu
    50                  55                  60
Trp Leu Ala Arg His Arg Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Gly
65                  70                  75                  80
Phe Ile Gly Glu His Glu Arg Arg Phe Arg Val Phe Trp Asp Asn Leu
                85                  90                  95
Lys Phe Val Asp Ala His Asn Ala Arg Ala Asp Glu Arg Gly Gly Phe
            100                 105                 110
Arg Leu Gly Met Asn Arg Phe Ala Asp Leu Thr Asn Gly Glu Phe Arg
        115                 120                 125
Ala Thr Tyr Leu Gly Thr Thr Pro Ala Gly Arg Gly Arg Arg Val Gly
    130                 135                 140
Glu Ala Tyr Arg His Asp Gly Val Glu Ala Leu Pro Asp Ser Val Asp
145                 150                 155                 160
Trp Arg Asp Lys Gly Ala Val Val Ala Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln
                165                 170                 175
Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Val Ala Ala Val Glu Gly Ile
            180                 185                 190
Asn Lys Ile Val Thr Gly Glu Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Glu Leu
        195                 200                 205
Val Glu Cys Ala Arg Asn Gly Gln Asn Ser Gly Cys Asn Gly Gly Ile
    210                 215                 220
Met Asp Asp Ala Phe Ala Phe Ile Ala Arg Asn Gly Gly Leu Asp Thr
225                 230                 235                 240
Glu Glu Asp Tyr Pro Tyr Thr Ala Met Asp Gly Lys Cys Asn Leu Ala
                245                 250                 255
Lys Arg Ser Arg Lys Val Val Ser Ile Asp Gly Phe Glu Asp Val Pro
            260                 265                 270
Glu Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Lys Ala Val Ala His Gln Pro Val
        275                 280                 285
Ser Val Ala Ile Asp Ala Gly Gly Arg Glu Phe Gln Leu Tyr Asp Ser
    290                 295                 300
Gly Val Phe Thr Gly Arg Cys Gly Thr Asn Leu Asp His Gly Val Val
305                 310                 315                 320
Ala Val Gly Tyr Gly Thr Asp Ala Ala Thr Gly Ala Ala Tyr Trp Thr
                325                 330                 335
Val Arg Asn Ser Trp Gly Pro Asp Trp Gly Glu Asn Gly Tyr Ile Arg
            340                 345                 350
Met Glu Arg Asn Val Thr Ala Arg Thr Gly Lys Cys Gly Ile Ala Met
        355                 360                 365
Met Ala Ser Tyr Pro Ile Lys Lys Gly Pro Asn Pro Lys Pro Ser Pro
    370                 375                 380
Pro Ser Pro Ala Pro Ser Pro Pro Gln Gln Cys Asp Arg Tyr Ser Lys
385                 390                 395                 400
Cys Pro Ala Gly Thr Thr Cys Cys Cys Asn Tyr Gly Ile Arg Asn His
                405                 410                 415
Cys Ile Val Trp Gly Cys Cys Pro Val Glu Gly Ala Thr Cys Cys Lys
            420                 425                 430
Asp His Ser Thr Cys Cys Pro Lys Glu Tyr Pro Val Cys Asn Ala Lys
        435                 440                 445
Ala Arg Thr Cys Ser Lys Ser Lys Asn Ser Pro Tyr Asn Ile Arg Thr
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Pro Ala Ala Met Ala Arg Ser Val Pro Glu Gln Pro Asp Ser Ile Ser
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Phe Val Val Leu Asn Arg Glu Asp Leu Val
                485                 490
<210>5
<211>2215
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>5
catacctgtt caactgcagc gatattagaa catccagttc cagccatcac caatttaacc    60
gatatatgat catactttga tctgtctgaa gatttcttca ggtcctttgc ttttgtttga    120
gcattattgc ttgtgctagc tacattggca tctgcctgta atttcataac ggataaaatt    180
aagattagta acagagcaag ttgagctaca acaggatctc actgtccttc cagggacaca    240
aaacaaccaa cagtttacaa tttggacagt gagaaacctt gataataact ggcattgcag    300
gaccttgaca tggatcttcc ctcagtctga cactattgta gtgctcaccc tgatgatacg    360
atctatattg gaatcaaaac aaaggaacat gagaatgtat gtccttttac tgccagtatt    420
agcatattag tttaaaacag cagaacacac attaacttac aaatgaatca tactggtagc    480
ttcacgatca gaaaagtttc ttatgtacca tcgtggtgag ttaagctgca aatcattcag    540
taatggtaca ggcatcaatc aaatgttaca gtacgttctc ttctatagaa gaaaggctat    600
aatatgaaaa tgagtacgaa aaataacaga gaaccatcag gggatatata agcagcacat    660
tgatctatat cacccatgtg tttcaaaata cagactaggc aaggctcaac tgcctagcgt    720
gttattcata ggttgaagaa atcatactgc aaagcttgta ttgaaaatta ccatgtggat    780
gcatatgttt tttctcttga gaatagaagc tgcttgcaac tccatatgac cagcccaagt    840
cccatcctca agcatagagt cacaatattt ctcaaacggt tcctcgtcct caatgaatgg    900
ctcaaaatcc acacggtgct cctgtaagat gcatacaaga aagattatga agtgtaaata    960
ggccaatgct tgcttgcagc atgtctttta gataaaagaa caacccagcc tggcagcctg    1020
tactctacgc ccagatcaga tgtacacagc caaagtttgc agcatgtgca ataccttatt    1080
gattcaatgg caccctaatt acagttctta agtcacagtg ttacaagatg tttcttggtc    1140
atagccaaag cttgcagtat ttctaatacc ttattgattc aatggcaccc taactacagt    1200
tattaagtca cagtgttaca agatgtttgt tttggtcatc tcatctgatg cataccttaa    1260
tgtattgcac aatcattgca cggtacttca tgtgctcttc ctcgttgcct tcgagctggt    1320
cgcccattgc cctgcagact acgatgagta accatataac acaagactgc ataatgcata    1380
tactattcct cctttcataa actaacagta ctctaacata tcgtacaaca tcgattagcc    1440
tcttcttgta aaaagtggca agaatttgag taatggaatc gaaaagaaga cctaaagaag    1500
cagttgccat ccgcactaac ttcgataatc ttcaacccca gcgagtccag ctgcgcccgg    1560
aactccgtca tgtcggcctt cttcgcgaac ttcttctcct cctaacaaat caatcaccaa    1620
aaggaaaaaa aaacgagaaa atatattagc taaagctcaa ttccccttcc accaaaaacg    1680
atccaatctc cagctgactg aggcgcgggg tattactgca tcacgcttcg gcttccgggc    1740
tttgggcgcc gccacggcta ccttcttctt gttccgagcc attacgacac gtgcggtagt    1800
agtggagtct cgcctagatt tccccgcggc ggcggcggcg gcgaggggga ggggaggcgg    1860
aatcgcagat agtatcaaat cgtactctac cagaagcccg gagaagaaat cggatgggaa    1920
aaggaagagg agaagagaag agaagtcgtc aggtgatatt tcgtgggcca aatgggccgg    1980
gccgtaacac ctcaatcccc aatctgctac ggcccgtgtg tgaacgtgac acgtcatcct    2040
atttagaatc gaataccgaa cctgaacgtg acacgtcaga tttaggagta gaaacgagta    2100
cactctacac gatacagatc caatacgaga ccgacacgtc gtcagcgacc aagtaaaatt    2160
cggtcacgaa ccgtacgcca ccaacctgta taaattcatc gaccgccaag cctct         2215