一种粳稻花药分化培养基配方.pdf

本发明提供了一种粳稻花药分化培养基，该培养基的配方由一定比例的KNO3、NH4NO3、C8H7O2K、KH2PO4、CaCl2?2H2O、MgSO4?7H2O、Na2-EDTA、FeSO4?7H2O、MnSO4?4H2O、ZnSO4?7H2O、H3BO3、KI、CuSO4?5H2O、Na2MoO4?2H2O、CoCl2?6H2O、肌醇、甘氨酸、脯氨酸、叶酸、丙氨酸、赖氨酸、维生素B1、维生素B6、3-吡啶甲酸、蔗糖、植物凝胶、NAA、KT、调环酸钙、山梨醇、水解蛋白和生物素所组成。本发明所述的培养基具有高效率地提高粳稻花药愈伤组织绿苗分化率的优点，可以显著提高粳稻花药培养效率。

权利要求书1.  一种粳稻花药分化培养基，该培养基的配方如下：KNO3 1800～2000mg/L，NH4NO3 1550～1750mg/L，C8H7O2K 2200～2600mg/L，KH2PO4 160～180mg/L，CaCl2?2H2O 430～450mg/L，MgSO4?7H2O 360～380mg/L，Na2-EDTA 36～39mg/L，FeSO4?7H2O 26.5～28.5mg/L，MnSO4?4H2O 21～24mg/L，ZnSO4?7H2O 8～9mg/L，H3BO3 5.4～7.0mg/L，KI 0.75～0.85mg/L，CuSO4?5H2O 0.02～0.03mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.2～0.3mg/L，CoCl2?6H2O 0.02～0.03mg/L，肌醇 90～110mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，脯氨酸160～200mg/L，叶酸 0.35～0.45mg/L，丙氨酸 1.1～1.3mg/L，赖氨酸 1.3～1.5mg/L，维生素B1 0.35～0.45mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，3-吡啶甲酸 0.45～0.55mg/L，蔗糖 23～27g/L，植物凝胶 5～6g/L；NAA 0.45～0.55mg/L，KT 1.8～2.2mg/L，调环酸钙0.6～0.8mg/L，山梨醇 23～27g/L，水解蛋白 0.9～1.1g/L，生物素 0.07～0.09mg/L，PH 5.8-6.0。

说明书一种粳稻花药分化培养基配方
技术领域
本发明涉及一种粳稻花药分化培养基，具体涉及一种高效率地提高粳稻花药愈伤绿苗分化率的分化培养基配方，属于农业科学技术领域。
背景技术
花药培养育种，是将花药培育成单倍体植株，再将染色体自然或人工加倍得到纯合二倍体的一种育种方法，因此花药培养育种也叫单倍体育种。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，1968年水稻花药培养获得了成功。随后，利用该技术选育水稻品种受到各国育种家的普遍重视。水稻花药培养育种主要特点表现为缩短育种周期，提高选择效率，加速有效性状转移等。水稻花药培养育种已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术育种相结合，发展形成了一套育种技术体系，在传统农业向高技术农业的转化中发挥着纽带作用。
我国于20世纪70年代开始花药培养育种，选育出了一大批水稻新品种，创造了巨大的社会效益和经济效益。1975年中国科学院北京植物研究所、黑龙江省农业科学院作物育种研究所和松花江地区农业科学研究所水稻实验站组成的单倍体育种协作组首次育成了粳稻品种“单丰1号”。1976年中国科学院遗传所和天津市农科所又育成了“花育1号”和“花育2号”，我国实现了花培育种从理论到应用的突破。常规育种与花药培养技术结合起来育成了大量水稻新品种通过审定，比较有代表性的有20世纪80年代的中国农科院的“中花”系列，其中中花8号、中花9号和中花10号年种植面积曾达到2万hm。90年代的江西农科院选育的“赣籼”系列，黑龙江省农业科学院水稻研究所选育出了龙粳系列品种，2000年后又有不同的中花品种和龙粳品种被成功选育。经过30多年来全国各地育种研究队伍的潜心研究，目前我国已有一大批通过花培育种的品种产生，并且大面积推广应用，我国水稻花药培养育种的应用研究在国际上一直保持领先地位。
水稻花培育种有许多优势，但其培养效率并不是很理想，主要原因在于花培诱导率、绿苗分化率低，即花药培养力低。花药培养力的高低由愈伤组织诱导率和分化率所决定。不同的研究者针对提高粳稻花培效率进行了研究，其中通过对培养基进行优化，可使不同材料的粳稻的花药培养力有不同程度的提高。包括培养基的改良、附加成分的增减、培养条件的改善等等，其目的都在于提高愈伤组织的诱导率和绿苗的分化率。其中培养基是花药培养的物质基础，直接关系到培养物的生长与分化，培养基组分是影响花培效率的一个最重要的因素。
通过多年粳稻花药培养的摸索和实践，我们不断优化培养基配方，并且不断尝试加入一些提高粳稻绿苗分化率的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出了一种显著提高粳稻绿苗分化率的分化培养基配方。我们的研究结果对于进一步推广和应用水稻单倍体育种和理论研究无疑有较大的现实意义和实用价值。
发明内容
本发明提供了种粳稻花药分化培养基，该培养基的配方如下：
KNO3 1800～2000mg/L，NH4NO3 1550～1750mg/L，C8H7O2K 2200～2600mg/L，KH2PO4 160～180mg/L，CaCl2?2H2O 430～450mg/L，MgSO4?7H2O 360～380mg/L，Na2-EDTA 36～39mg/L，FeSO4?7H2O 26.5～28.5mg/L，MnSO4?4H2O 21～24mg/L，ZnSO4?7H2O 8～9mg/L，H3BO3 5.4～7.0mg/L，KI 0.75～0.85mg/L，CuSO4?5H2O 0.02～0.03mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.2～0.3mg/L，CoCl2?6H2O 0.02～0.03mg/L，肌醇 90～110mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，脯氨酸160～200mg/L，叶酸 0.35～0.45mg/L，丙氨酸 1.1～1.3mg/L，赖氨酸 1.3～1.5mg/L，维生素B1 0.35～0.45mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，3-吡啶甲酸 0.45～0.55mg/L，蔗糖 23～27g/L，植物凝胶 5～6g/L；
NAA 0.45～0.55mg/L，KT 1.8～2.2mg/L，调环酸钙0.6～0.8mg/L，山梨醇 23～27g/L，水解蛋白 0.9～1.1g/L，生物素 0.07～0.09mg/L，PH 5.8-6.0。
本发明所述的培养基具有高效率地提高粳稻花药愈伤组织绿苗分化率的优点，可以显著提高粳稻花药培养效率。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映本发明所述培养基的特点。
具体实施方式
实施例1
配制如下配方的培养基：
KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，C8H7O2K 2400mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2?2H2O 440mg/L，MgSO4?7H2O 370mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，FeSO4?7H2O 27.5mg/L，MnSO4?4H2O 22.5mg/L，ZnSO4?7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4?5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.25mg/L，CoCl2?6H2O 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸180mg/L，叶酸 0.4mg/L，丙氨酸 1.2mg/L，赖氨酸 1.4mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，3-吡啶甲酸0.5mg/L，蔗糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L；
NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙0.7mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 1.0g/L，生物素 0.08mg/L，PH 5.9。
选取粳稻品种通科粳和黑壳紫粳的花药愈伤组织作为供体，当诱导培养后的花药愈伤组织长到2毫米大小时，转到分化培养基上诱导绿苗，培养条件控制为：温度26℃、湿度75%、光照3000lx l4h/暗10h。愈伤组织形成后（长到2mm左右），计算愈伤组织分化率。绿苗分化率（%）=分化绿苗数/转移的愈伤块数×100%。
实施例2
配制如下配方的培养基（C8H7O2K添加浓度的优选）：
KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2?2H2O 440mg/L，MgSO4?7H2O 370mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，FeSO4?7H2O 27.5mg/L，MnSO4?4H2O 22.5mg/L，ZnSO4?7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4?5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.25mg/L，CoCl2?6H2O 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸180mg/L，叶酸 0.4mg/L，丙氨酸 1.2mg/L，赖氨酸 1.4mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，3-吡啶甲酸0.5mg/L，蔗糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L；
NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙0.7mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 1.0g/L，生物素 0.08mg/L，PH 5.9。
C8H7O2K的添加浓度设置以下8种：0；400mg/L；800mg/L；1200mg/L；1600mg/L；2000mg/L；2800mg/L；3200mg/L。
同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算绿苗分化率。
实施例3
配制如下配方的培养基（脯氨酸添加浓度的优选）：
KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，C8H7O2K 2400mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2?2H2O 440mg/L，MgSO4?7H2O 370mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，FeSO4?7H2O 27.5mg/L，MnSO4?4H2O 22.5mg/L，ZnSO4?7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4?5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.25mg/L，CoCl2?6H2O 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，叶酸 0.4mg/L，丙氨酸 1.2mg/L，赖氨酸 1.4mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，3-吡啶甲酸0.5mg/L，蔗糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L；
NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙0.7mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 1.0g/L，生物素 0.08mg/L，PH 5.9。
脯氨酸的添加浓度为以下8种：0；30mg/L；60mg/L；90mg/L；120mg/L；150mg/L；210mg/L；240mg/L。
同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算绿苗分化率。
实施例4
配制如下配方的培养基（丙氨酸添加浓度的优选）：
KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，C8H7O2K 2400mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2?2H2O 440mg/L，MgSO4?7H2O 370mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，FeSO4?7H2O 27.5mg/L，MnSO4?4H2O 22.5mg/L，ZnSO4?7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4?5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.25mg/L，CoCl2?6H2O 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸180mg/L，叶酸 0.4mg/L，赖氨酸 1.4mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，3-吡啶甲酸0.5mg/L，蔗糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L；
NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙0.7mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 1.0g/L，生物素 0.08mg/L，PH 5.9。
丙氨酸的添加浓度设置以下6种：0；0.3mg/L；0.6mg/L；0.9mg/L；1.5mg/L；1.8mg/L。
同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算绿苗分化率。
实施例5
配制如下配方的培养基（赖氨酸添加浓度的优选）：
KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，C8H7O2K 2400mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2?2H2O 440mg/L，MgSO4?7H2O 370mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，FeSO4?7H2O 27.5mg/L，MnSO4?4H2O 22.5mg/L，ZnSO4?7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4?5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.25mg/L，CoCl2?6H2O 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸180mg/L，叶酸 0.4mg/L，丙氨酸 1.2mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，3-吡啶甲酸0.5mg/L，蔗糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L；
NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙0.7mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 1.0g/L，生物素 0.08mg/L，PH 5.9。
赖氨酸的添加浓度设置为以下10种：0；0.2mg/L；0.4mg/L；0.6mg/L；0.8mg/L；1.0mg/L；1.2mg/L；1.6mg/L；1.8mg/L；2.0mg/L。
同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算绿苗分化率。
实施例6
配制如下配方的培养基（调环酸钙添加浓度的优选）：
KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，C8H7O2K 2400mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2?2H2O 440mg/L，MgSO4?7H2O 370mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，FeSO4?7H2O 27.5mg/L，MnSO4?4H2O 22.5mg/L，ZnSO4?7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4?5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.25mg/L，CoCl2?6H2O 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸180mg/L，叶酸 0.4mg/L，丙氨酸 1.2mg/L，赖氨酸 1.4mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，3-吡啶甲酸0.5mg/L，蔗糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L；
NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 1.0g/L，生物素 0.08mg/L，PH 5.9。
调环酸钙的添加浓度设置为以下10种：0；0.1mg/L；0.2mg/L；0.3mg/L；0.4mg/L；0.5mg/L；0.6mg/L；0.8mg/L；0.9mg/L；1.0mg/L。
同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算绿苗分化率。
实施例7
配制如下配方的培养基（水解蛋白添加浓度的优选）：
KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，C8H7O2K 2400mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2?2H2O 440mg/L，MgSO4?7H2O 370mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，FeSO4?7H2O 27.5mg/L，MnSO4?4H2O 22.5mg/L，ZnSO4?7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4?5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.25mg/L，CoCl2?6H2O 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸180mg/L，叶酸 0.4mg/L，丙氨酸 1.2mg/L，赖氨酸 1.4mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，3-吡啶甲酸0.5mg/L，蔗糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L；
NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙0.7mg/L，山梨醇 25g/L，生物素 0.08mg/L，PH 5.9。
水解蛋白添加浓度设置以下8种：0；0.2 g/L；0.4g/L；0.6g/L；0.8g/L；1.2g/L；1.4g/L；1.6g/L。
同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算绿苗分化率。
实施例8
配制如下配方的培养基（山梨醇添加浓度的优选）：
KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，C8H7O2K 2400mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2?2H2O 440mg/L，MgSO4?7H2O 370mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，FeSO4?7H2O 27.5mg/L，MnSO4?4H2O 22.5mg/L，ZnSO4?7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4?5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.25mg/L，CoCl2?6H2O 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸180mg/L，叶酸 0.4mg/L，丙氨酸 1.2mg/L，赖氨酸 1.4mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，3-吡啶甲酸0.5mg/L，蔗糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L；
NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙0.7mg/L，水解蛋白 1.0g/L，生物素 0.08mg/L，PH 5.9。
山梨醇添加浓度设置以下8种：0；5g/L；10g/L；15g/L；20g/L；30g/L；35g/L；40g/L。
同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算绿苗分化率。
实施例9
配制如下配方的培养基（生物素添加浓度的优选）：
KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，C8H7O2K 2400mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2?2H2O 440mg/L，MgSO4?7H2O 370mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，FeSO4?7H2O 27.5mg/L，MnSO4?4H2O 22.5mg/L，ZnSO4?7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4?5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4?2H2O 0.25mg/L，CoCl2?6H2O 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸180mg/L，叶酸 0.4mg/L，丙氨酸 1.2mg/L，赖氨酸 1.4mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，3-吡啶甲酸0.5mg/L，蔗糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L；
NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙0.7mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 1.0g/L，PH 5.9。
生物素添加浓度设置以下6种：0；0.02mg/L；0.04mg/L；0.06mg/L；0.1mg/L；0.12mg/L。
同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算绿苗分化率。
培养基对比实验
将实施例2-9分别与实施例1进行对比，对比的结果如下表所示：








从表1-8可以看出，使用本发明所提供的培养基比使用其它任何对比培养基对粳稻花药愈伤组织的绿苗分化效率更高，表明本发明提供的培养基配方是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，多年来我们亦围绕本发明的组合配比做了小范围单因子改变优化组合试验，大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。使用本发明所提供的培养基将粳稻品种通科粳、黑壳紫粳的愈伤组织绿苗分化率提高到了48.6%和57.3%，充分说明了本发明提供的培养基是一种优良的粳稻花药分化培养基。
实施例10
为了比较本发明所提供的培养基与前人采用的培养基对粳稻花药愈伤组织绿苗分化效果的差异，我们从相关文献查找了3个粳稻花药愈伤组织分化培养基配方，配制成花药愈伤分化培养基，同样选取粳稻品种通科粳和黑壳紫粳作为花药愈伤组织供体分化绿苗，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织绿苗分化率。
其它3个分化培养基为：
SK-ⅱ培养基：MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+0.5mg/L KT，pH为5.9（对比文件来自于孟祥祯等《杂交稻花药培养中不同培养基的效率》）；
MS培养基：MS基本培养基+30g/L蔗糖+4.2g/L琼脂+0.5mg/L NAA+2mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+0.1mg/L IBA+100mg/L 肌醇+2mg/L MET+0.5g/L LH，pH为5.8（对比文件来自于李鑫等《北方粳稻花药培养力遗传特性分析》）；
NB培养基：NB基本培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH为5.8（对比文件来自于汪庆等《高花药培养效率粳稻杂交组合的筛选》）。
培养基对比实验
将实施例10与实施例1进行对比，对比的结果如下表所示：

从不同培养基的绿苗分化效果来看，本发明培养基对粳稻花药愈伤组织平均绿苗分化率为53.0%，SK-ⅱ、MS、NB培养基则为34.9%、37.0%、31.4%，可以发现本发明对粳稻花药愈伤组织的绿苗分化率要显著高于其他3种花药分化培养基。
以上10个实施例可以说明本发明提供的培养基配方的组分配比是最优组合，本发明提供的培养基对粳稻花药愈伤组织的绿苗分化效果比前人的粳稻花药分化培养基具有显著的提高。我们的研究结果对于进一步推广和应用粳稻单倍体育种和理论研究无疑有较大的现实意义和实用价值。
本领域技术人员可以根据本发明公开的内容和所掌握的本领域技术对本发明内容作出替换或变型，但是这些替换或变型都不应视为脱离本发明构思的，这些替换或变型均在本发明要求保护的权利范围内。