石斑鱼性反转基因蛋白及核苷酸序列和应用.pdf

本发明公开了一种石斑鱼性反转相关基因序列、含有该基因的载体和重组株及其用途，该基因cDNA长608bp，有一个252bp(54－305)的开放阅读框，编码83个氨基酸，5’非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元；3’非编码区长303bp，有多聚腺苷酸加尾信号(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。含有该基因的载体、重组株和原核表达的融合蛋白在石斑鱼的生殖调控、性腺分化和性别逆转及在饲料添加制备人工饵料以增强石斑鱼的繁殖和人工控制性别中的应用。

1、  一种石斑鱼性反转基因的蛋白，其具有与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2、  一种石斑鱼性反转基因的核苷酸，其具有与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3、  根据权利要求1或2所述的包含该基因的重组载体为pGEX-KG-SIRF1。

4、  根据权利要求1或2所述的包含该基因重组载体的重组株Ecoli BL21pLysS pGEX-KG-SIRF1。

5、  一种石斑鱼性反转基因的原核表达的融合蛋白，其特征在于用1mmol/L的IPTG诱导表达重组株Ecoli BL21 pGEX-KG-SIRF1，25℃诱导9小时可获得表达融合蛋白GST-SIRF1。

6、  根据权利要求5所述的一种石斑鱼性反转基因的原核表达的融合蛋白GST-SIRF1在石斑鱼的生殖调控中的应用。

7、  根据权利要求5所述的一种石斑鱼性反转基因的原核表达的融合蛋白GST-SIRF1在石斑鱼的性腺分化中的应用。

8、  根据权利要求5所述的一种石斑鱼性反转基因的原核表达的融合蛋白GST-SIRF1在石斑鱼的性别逆转中的应用。

9、  根据权利要求5所述的一种石斑鱼性反转基因的原核表达的融合蛋白GST-SIRF1在饲料制备人工饵料中的应用。

10、  根据权利要求5所述的一种石斑鱼性反转基因的原核表达的融合蛋白GST-SIRF1在石斑鱼的繁殖和人工控制性别中的应用。

石斑鱼性反转基因蛋白及核苷酸序列和应用
                         技术领域
本发明涉及一种石斑鱼性反转相关基因的序列，更具体涉及一种从石斑鱼垂体的SMART cDNA文库中筛选出的性反转相关因子1(sex inversion relatedfactor 1，sirf1)的序列、氨基酸序列，本发明还涉及该基因的载体和重组株的用途。
                         背景技术
石斑鱼(E.coioides)为海洋珊瑚礁鱼类，属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，是一种名贵的海水鱼类，销售市场稳定、价格昂贵，同时石斑鱼也是人工繁殖与育苗技术难度最大的海产鱼类之一，至今养殖种苗的供应仍依赖捕捞野生天然苗。近年来，日本、东南亚各国、我国台湾、华南沿海都进行了大规模的人工养殖。随着海洋鱼类人工规模化养殖不断发展，天然苗种已不能满足养殖生产的需要，人工育苗成为其持续发展的关键技术。尽管已进行了一些初步的繁殖生物学研究，但对人工育苗的理论基础---生殖调控的研究才刚刚起步、基础十分薄弱。据张其永等2000年统计，我国已成功繁殖培育出幼苗鱼苗的石斑鱼种类有赤点石斑鱼、鲑点石斑鱼、点带石斑鱼等。但实际上它们离能够较稳定地进行种苗批量生产的目标尚有相当的差距。
石斑鱼人工繁殖与育苗的难度主要来自以下几个方面：(1)石斑鱼雌雄同体，雌性先熟，然后性转化；(2)受精卵质量差，孵化率低；(3)仔鱼个体纤细，对开口饵料的要求严格；以及稚、幼鱼的自相残杀习性、病害等问题。尤其是石斑鱼个体发育中普遍存在“先雌后雄”的性转变过程，雄亲鱼均高龄化(一般6龄以上)，长时间的性逆转过程，不仅消耗大量饵料，而且等生长到雄性精巢可以释精时，种群数量已十分稀少而难以捕获。即使捕获到雄性亲鱼，因雌雄亲鱼性成熟不同步配对，导致受精率较低。目前育苗的方法是用外源的性类固醇激素(17a-甲基睾酮)给食、注射或埋植进行强制逆转培育雄性亲鱼。但在完全不了解其性别逆转的分子机制的前提下，盲目地用过多的外源类固醇激素必然会带来很多弊端。譬如，不仅费工费时，而且转化效果差，性转变后，雄鱼精子活力不强，而停药后，会产生性别复原问题。埋植激素后会导致手术鱼不摄食或摄食减弱，影响鱼正常发育。
                         发明内容
本发明的目的在于提供一种石斑鱼性反转基因蛋白及核苷酸序列，筛选方法简便，该基因可用于提高石斑鱼繁殖力，培育雄性亲鱼。
本发明还涉及一种石斑鱼性反转相关因子1(sirf1)的基因序列在石斑鱼生殖调控、性腺分化和性别逆转中的应用。
本发明还涉及一种含有石斑鱼性反转相关因子1(sirf1)地载体在石斑鱼生殖调控、性腺分化和性别逆转中的应用。
本发明还涉及一种含有石斑鱼性反转相关因子1(sirf1)的载体的重组株在石斑鱼生殖调控、性腺分化和性别逆转中的应用。
本发明还涉及一种由含有石斑鱼性反转相关因子1(sirf1)的载体的重组株表达的蛋白在石斑鱼生殖调控、性腺分化和性别逆转中的应用。
本发明还涉及一种石斑鱼性反转相关基因的原核表达的融合蛋白GST-SIRF1在饲料制备人工饵料中的应用。
本发明还涉及一种石斑鱼性反转相关基因的原核表达的融合蛋白GST-SIRF1在石斑鱼的繁殖和人工控制性别中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：本发明所述的基因石斑鱼性反转相关因子1(sirf1)是从石斑鱼垂体的SMART cDNA质粒文库中筛选到的一个基因。其特征是基因cDNA序列和编码蛋白的氨基酸序列(如下)。该基因的cDNA长608bp，有一个252bp(54-305)的开放阅读框，编码83个氨基酸，5’非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元；3’非编码区长303bp，有多聚腺苷酸加尾信号(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中进行氨基酸同源搜索，发现与本实验室克隆到的一个原肠期特异转录的胚胎发育调控因子ger1具有90％的同源性。采用基因的特异引物扩增sirf1编码C端73个氨基酸的cDNA片段，经一系列纯化、酶切、连接入pGEX-KG载体中，获得含有该基因的表达载体pGEX-KG-sirf1。将构建好的表达载体转化BL21(DE3)pLysS(Novagen)，筛选获得可诱导表达融合蛋白的重组株EcoliBL21(pGEX-KG-SIRF1)。
性反转相关因子1(sirf1)基因的cDNA序列(SEQ ID No.1)
GACACTCGATTGTTTTCCTCCTCTGAGACGGACAGCAGAGAGCCACAGCC
AAGATGAGACTGTACCTTGCAATTGCCGTGCTGATGCTGGCTTTGGTCGCAT
ACACAGAGGCCCAGGAGGAGACCTTCGAGCAGAAGTTCGCCAAGTTTACC
GAGCAGGTGACTCAGGTGGGCCAAAACCTGGGTGAAAGGCTCAAGACCG
GCTTTGATGATATCCAAACCAGCGACTTTGCAACCAATTCAAAGGCCCGTG
TCAATGACTTTTTTGAGTGGGTGAAGACAAAACTTGAAGACCTCAACAACT
AAACAAGTCCCAGTCTCCAGCCTACAACCTGCCGTCTGACCGCTGACCTCT
TCACACAAGTCATCGCTCTGCTCACCACGCAAAATGGTTGTGTTGCCTCTC
TGTCAGTGTTTTTTGTAGATTAATTTAAGTGTAATCTTTTGGGGGGAAACAA
TGTGAAAAAGTGCAATAAAGACATCAAAAGAAAACATTTTATTATTATTATT
TATATATCCATTTTAATCACTGGAAATAATATAAGAATTAAGTGTACTGAATA
AAAAAAGTAAACAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
性反转相关因子1(sirf1)基因编码蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.2)
MRLYLAIAVLMLALVAYTEAQEETFEQKFAKFTEQVTQVGQNLGERLKTGFD
DIQTSDFATNSKARVNDFFEWVKTKLEDLNN
该基因编码83个氨基酸，前面21个氨基酸肽段为信号肽，其性反转相关因子1(sirf1)基因编码蛋白的氨基酸序列见序列表。通过Signal P程序对其蛋白存在信号肽的可能性进行了分析，发现其N-端的21个氨基酸肽段为信号肽，提示该蛋白为分泌型蛋白(图1)。
运用RT-PCR技术考察了其在石斑鱼肝脏、肾脏、脾脏、胰脏、心、肌、垂体、下丘脑、端脑、小脑、中脑、延脑的mRNA水平，考察了其在处于卵子发生期、卵母细胞成熟期和变性期不同阶段石斑鱼个体的脑垂体、下丘脑及成熟卵巢和处于变性期的性腺的表达图谱，结果表明：该基因在六种脑组织和性腺中大量转录(图2、3)。硬骨鱼类与其它脊椎动物相似，“下丘脑—垂体—性腺”是调节生殖活动的重要内分泌系统。该基因的表达谱完全符合鱼类生殖的内分泌调节体系中的“下丘脑—垂体—性腺”组成的三级主干结构，这表明该基因在调控石斑鱼的生殖和性腺分化中具有重要功能。
采用基因的特异引物扩增sirf1编码C端73个氨基酸的cDNA片段，经一系列纯化、酶切、连接入pGEX-KG载体中，获得含有该基因的表达载体pGEX-KG-sirf1。将构建好的表达载体转化BL21(DE3)pLysS(Novagen)，筛选获得可诱导表达融合蛋白的重组株Ecoli BL21(pGEX-KG-SIRF1)。通过上述过程制备含有该基因的载体和重组株，原核表达该蛋白(图4)并免疫家兔制备多克隆抗体，用以研究该基因在性腺中的定位，以推断其功能。
首先采用甲基睾丸酮人工诱导赤点石斑鱼性反转，通过42天的诱导，所有个体均成功被诱导为雄性个体，并能少量产精。对激素组和对照组性腺切片的组织学观察表明，经过42天投喂正常饲料的对照组所有个体的性腺为退化的卵巢；而投喂混有甲基睾丸酮的激素组所有个体的性腺为完全成熟的精巢。每隔一周收集激素组性腺进行SIRF1的荧光免疫组化分析。冰冻切片和FITC标记的荧光染色结果表明，性反转前的性腺表现为卵巢，SIRF1蛋白定位于颗粒细胞中(图5)；性反转一周的性腺为退化的卵巢，SIRF1蛋白主要定位于颗粒细胞中(图6)。性反转2周和3周的性腺，精小叶已形成，退化卵子重排在精小叶中，该蛋白表达量大，主要存在于精小叶壁的内侧细胞中(图7、8)；在性反转4周的性腺中，该蛋白表达量减弱，仅在少数精小叶壁的内侧细胞中有表达(图9)；在性反转5周和6周的性腺中，检测不到该蛋白的表达(图10)。鉴于已知在雌性个体中，由颗粒细胞分泌雌性激素刺激卵子的发育；在雄性个体中，精小叶壁的内侧细胞分泌雄性激素，而且该类细胞对类固醇(雌性激素雌二醇和雄性激素睾酮均为类固醇物质)的测定呈阳性反应。考虑到该蛋白受雄性激素甲基睾丸酮诱导后大量在精小叶壁内侧细胞表达，在成熟精巢的精小叶壁内侧细胞中检测不到该蛋白的存在，由此推测它有可能在受到甲基睾丸酮的诱导后，大量表达，并刺激其它雄性激素分泌，与性反转相关。通过制备含有该基因的载体和重组株，制备原核蛋白，用于研究该基因在石斑鱼性腺分化和性别逆转中的作用。
鉴于sirf1基因是新基因，目前人类对此基因的认识和了解仅限于本发明人所作的科学工作研究。由于该基因在脑组织和性腺中有大量转录，同时该蛋白在卵巢中定位于颗粒细胞中，在处于由雌向雄性转变性腺中，定位于精小叶壁的内侧细胞中，考虑到已知这两类细胞是分泌性激素的细胞，而该蛋白也是一个分泌型小肽，这表明该基因是调控石斑鱼的由雌向雄性转变的一个重要调控基因，在精小叶的形成中起重要作用。
本发明的优点：通过制备含有该基因的载体、重组株、表达的原核蛋白，用于研究该基因在石斑鱼的生殖调控、性腺分化和性别逆转中的作用。通过制备原核蛋白，可作为饲料添加剂制备人工饵料，以增强石斑鱼的繁殖力和人工控制性别。
                          附图说明
图1为Signal P程序分析显示出的基因sirf1的信号肽位置
图1是通过Signal P程序对SIRF1蛋白存在信号肽的可能性进行了分析，发现其N-端的21个氨基酸肽段极可能为信号肽，其信号肽酶的可能切割位点位于第21位和22位氨基酸之间，提示该蛋白为分泌型蛋白。
图2为RT-PCR检测基因sirf1在石斑鱼组织中的表达
图2表明该基因在六种脑组织中大量转录，在其他6种组织中检测不到转录本的存在。
图3为RT-PCR检测基因sirf1在处于卵子发生期(1)、卵母细胞成熟期(2)、变性期(3)不同阶段石斑鱼个体的脑垂体、下丘脑及成熟卵巢和处于变性期的性脲中的表达
图3表明在不同发育阶段的垂体、下丘脑和性腺中都可检测到大量转录本的存在。
图4为SIRF1蛋白的原核表达，检测诱导表达了GST-SIRF1基因的大肠杆菌菌体的结果
图4表明高效诱导表达了大小约为33KD的GST-SIRF融合蛋白(箭头所示)
图5为SIRF1蛋白在赤点石斑鱼性反转前性腺中切片杂交实验(明亮绿色为阳性信号)，其中A为两个不同个体的卵巢切片；B从左至右依次为成熟卵子、开始败育卵子和完全败育的卵子；C为B的苏木精—曙红(HE)染色。
图5表明SIRF1蛋白定位于颗粒细胞中。
图6为SIRF1蛋白在赤点石斑鱼喂以甲基睾丸酮1周后性腺中切片杂交实验(明亮绿色为阳性信号)
图6表明SIRF1蛋白定位于颗粒细胞中。
图7为SIRF1蛋白在赤点石斑鱼喂以甲基睾丸酮2周后性腺切片杂交实验(明亮绿色为阳性信号)，其中A为荧光染色；B为HE染色。此时，精小叶已初步形成，退化的卵子重排在精小叶中。
图7表明SIRF1蛋白定位于精小叶壁的内侧细胞中。
图8为SIRF1蛋白在赤点石斑鱼喂以甲基睾丸酮3周后性腺切片杂交实验(明亮绿色为阳性信号)，其中A、B为精小叶纵切面，C、D为精小叶横切面；A、C为荧光染色，B、D为HE染色。此时，精巢组织与卵巢组织的比例约为7∶3。
图8表明SIRF1蛋白定位于精小叶壁的内侧细胞中。
图9为SIRF1蛋白在赤点石斑鱼喂以甲基睾丸酮4周后性腺切片杂交实验(明亮绿色为阳性信号)，其中A为荧光染色；B为HE染色。此时，精巢组织与卵巢组织的比例约为8∶2。
图9表明只有少数精小叶壁的内侧细胞中可检测到SIRF1蛋白。
图10为SIRF1蛋白在赤点石斑鱼喂以甲基睾丸酮5周后性腺中切片杂交实验(明亮绿色为阳性信号)，其中A为荧光染色；B为HE染色。此时，为成熟精巢组织。
图10表明检测不到SIRF1蛋白。
                       具体实施方式
1、RNA的提取和SMART cDNA质粒文库的构建
下丘脑总RNA用SV Total RNA Isolation System(Promega)提取，步骤具体如下：取约15斤石斑鱼1尾，麻醉放血，开颅取出下丘脑，加入175μl的抽提缓冲溶液，充分匀浆后，加入350μl RNA稀释缓冲液，混匀后70℃封阻3分钟，14 000×g离心10min。转移上清，加入200μl 95％乙醇，吹打混匀后转移至离心柱，14 000×g离心1min，加入600μl RNA洗涤液，14 000×g离心1min。加入50μlDNA酶I 20-25℃消化15min后加200μl DNA酶终止溶液，14 000×g离心1min。加入600μl SVRNA洗涤液，14 000×g离心1min后，再次加入250μl RNA洗涤液，高速离心2min。用250μl无RNA酶水洗脱总RNA两次。取0.5-5μl电泳检测总RNA浓度和质量。其余总RNA于-70℃冻结实，真空冻干机超低温冻干浓缩，溶解于20-30μl水中，取0.5μl电泳检测mRNA浓度和质量。
SMART cDNA的合成用SMART cDNA library construction Kit(Clontech)试剂盒，具体操作如下：合成所用的3个引物序列为：(1)CDS引物(10μmol/L)5’-AAGCA GTGGTAACAACGCAGAGTACT₍₃₀₎N_-1N-3’；(2)Smart II寡核苷酸(10μmol/L)5’-AAG CAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3’；(3)PCR引物(10μmol/L)5’-AAGCAG TGGTAACAACGCAGAGT-3’。
取下丘脑总RNA  50ng，按文库构建方法合成第一链cDNA：加入CDS引物和Smart II寡核苷酸各1μl，72℃保温2min后，冰上速冷2min；然后在终体积为10μL的反应体系中，加入5×第一链反应缓冲液(250mmol/L Tris-HCl，pH8.3；375mmol/L KCl；30mmol/L MgCl₂)2μl、DTT(20mmol/L)1μl、dNTP(10mmol/L)1μl和PowerScript逆转录酶1μl，42℃保温1h合成第一链cDNA。取2μl第一链cDNA加入dNTP 2μl、PCR引物4μl、和2μl 50×Advantage 2 cDNA PolymeraseMix，于100μl反应体系中进行如下PCR循环：95℃预变性1min后，以95℃5s、65℃5s、68℃6min反应13个循环，72℃延伸10min。反应结束后，取5μL电泳检测。此PCR产物用于构建质粒文库。合成的SMART cDNA连接入pEGM^-T载体中(Promega)，并转化入DH5α感受态细胞中。
2、质粒文库的随机筛选及测序
铺平板(内含100μg/mL Amp以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，37℃培养过夜。挑取白色菌斑于预先分装有100μL Amp-LB的Eppendorf管中，37℃培养2h以上。取1μL菌液作模板，以M13+和M13-为引物(M13+：CAGGAAACAGCTATGAC；M13-：GTAAACGACGGCCAGT)，PCR鉴定插入片段大小。将插入片段大于500bp的克隆进行测序(上海，生工)。在随机筛选并测序的90个克隆中，共检测到该基因的1个克隆(编号分别为3-49)。该基因的cDNA长608bp，有一个252bp(54-305)的开放阅读框，编码83个氨基酸，5’非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元；3’非编码区长303bp，有多聚腺苷酸加尾信号(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中进行氨基酸同源搜索，发现与本实验室克隆到的一个原肠期特异转录的胚胎发育调控因子ger1具有90％的同源性。
3、组织和胚胎总RNA的提取和RT-PCR反应
提取了石斑鱼的各种组织(包括肝脏、肾脏、脾脏、胰脏、心、肌、垂体、下丘脑、端脑、小脑、中脑、延脑)的RNA，提取了处于卵子发生期、卵母细胞成熟期变性期不同阶段石斑鱼个体的脑垂体、下丘脑及成熟卵巢和处于变性期的性腺的RNA。总RNA的提取用SV total RNA isolation system(Promega)提取。具体步骤见操作手册。各取0.2μg的总RNA，用M-MLV逆转录酶(Gibco BRL)和寡聚(dT)_8-12反转录合成第一链cDNA。取第一链cDNA稀释10倍后1μl作模板用该基因的特异引物(3-49-F：GAATTCATATGAGACTGTACCTTGCAATTG；3-49-R：GCTCGAGTTAGTTGTTGAGGTCTTCAAG)进行PCR。反应体系的总体积为20μl，内含1μl模板DNA，0.2μM引物，0.5单位Taq酶，0.1μM dNTP和1×Taq酶反应缓冲液。PCR反应在Perkin-Elmer DNA GeneAmp PCR System9600扩增仪上进行，反应程序为：在94℃预变性4分钟后，进行28个扩增循环，每个循环包括94℃变性40秒，62℃复性50秒，72℃延伸50秒。最后一次循环结束后72℃延伸7分钟。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离。用α-tubulin基因(上游引物：5’-GTGCACTGGTCTTCA GGGGTT-3’，下游引物：5’-GGGAAGTGGATGCGTGGGTAT-3’)作为对照。
α-tubulin引物做PCR，确证各个组织逆转录的效率都符合要求而且cDNA的量都相差不多。而该基因的表达图谱显示：该基因在六种脑组织和性腺中大量转录(图2、3)。硬骨鱼类与其它脊椎动物相似，“下丘脑—垂体—性腺”是调节生殖活动的重要内分泌系统。该基因的表达谱完全符合鱼类生殖的内分泌调节体系中的“下丘脑—垂体—性腺”组成的三级主干结构，这表明该基因是调控石斑鱼的由雌向雄性转变的一个重要调控基因。
4、sirf1基因重组载体和重组株的构建
采用基因的特异引物(正向引物为5′--3′，反向引物为GCTCGAGTTAGTTGTTGAGGTCTTCAAG)扩增sirf1编码C端73个氨基酸的cDNA片段(扩增条件与RT-PCR相同)，正向引物中含有EcoR I酶切位点和起始密码ATG，反向引物中含有Xol I酶切位点和终止密码TAG。
将PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳分离后，在紫外灯下切下所要的特异DNA带，并将之置于1.5ml指管中。DNA片段的纯化参照Biostar GlassmilkDNA Purification Kit(BioStar International，Canada)使用手册进行。所使用的试剂全由试剂盒提供。步骤如下：每个指管中加入3倍体积的NaI后，55℃水浴5-10分钟以充分溶化凝胶。加入5μl玻璃奶，充分混合后室温放置5分钟，此时DNA与玻璃奶结合。高速离心5秒以沉淀玻璃奶和DNA形成的混合物。弃去上清后，加入0.5ml预冷的漂洗液重悬。高速离心后弃去上清，重复漂洗二次。将所得沉淀室温干燥10分钟后，加入10μl无离子水悬浮沉淀，室温放置5-10分钟，此时DNA溶解在水中。高速离心30秒，小心吸取上清，可直接用于连接。
连接反应的总体积为10μl，内含大约50ng的纯化DNA，50ng pGEM^-T载体(Promega)，1μl T4 DNA连接酶(3 Weiss units/μl，Promega)，4℃水浴过夜。连接产物转入含有DH5α的高效感受态细胞的指管中。将指管轻轻振荡以混合连接产物与细胞后，置于冰上20分钟。将指管置于42℃的水浴中热休克细胞40-50分钟后，立刻回置冰上2分钟。往指管中加入1ml LB培养基37℃振荡(150rpm)培养1小时。离心沉淀细胞，加入100μl LB培养基重悬细胞，并将其均匀涂于含有LB/ampicillin(50μg/ml)的平皿上。37℃培养平皿过夜。
挑选白色的克隆置于含有氨卞青霉素的4.5ml LB培养基的指管中，37℃振荡(150rpm)培养过夜。质粒DNA的提取和纯化参照Min-M^TM Plasmid Miniprep(Viogene)的使用手册进行。所使用的试剂全由试剂盒提供。4000g离心5分钟收获细胞。加入250μl溶液I重悬细胞，250μl溶液II裂解细胞，370μl溶液III中和反应液后，10,000g离心5分钟。吸取上清置于纯化柱中(柱子放置在一1.5ml指管中)，10,000g离心纯化柱5秒。加入0.5ml漂洗缓冲液I于柱中，100,00g离心30秒，弃去指管中的废液。加入0.7ml漂洗缓冲液II于柱中，10,000g离心30秒，取出柱子，放置于一新的1.5ml指管中。加入50μl无离子水于柱中，垂直放置30秒后，10,000g离心1分钟。
将含有该基因片段的质粒DNA和pGEX-KG载体分别用EcoR I(Biolabs)和Xol I(Biolabs)双酶切37℃消化。将酶切产物在1％琼脂糖凝胶中电泳分离后，在紫外灯下切下所要的特异DNA带，并将之置于1.5ml指管中。DNA片段的纯化参照Biostar Glassmilk DNA Purification Kit(BioStar International，Canada)使用手册进行。将线性化的质粒DNA和pGEX-KG载体在T4 DNA连接酶(Promega)作用下4℃连接。连接反应的总体积为10μl，内含大约50ng的纯化DNA，50ng pGEM^-T载体(Promega)，1μl T4 DNA连接酶(3 Weiss units/μl)，4℃水浴过夜。获得含有该基因的表达载体pGEX-KG-sirf1。将构建好的表达载体转化BL21(DE3)pLysS(Novagen)，挑含有表达载体的单克隆接种至含有50μg/ml氨卞青霉素37℃培养过夜，次日以1∶100的比例转接至新鲜含有50μg/ml氨卞青霉素的LB培养液中，培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为1mmoL的IPTG在37℃诱导表达3-6h。离心收集菌体，加入200μl of 2X Laemmli proteinsample buffer(per 10 milliliters，combine：2.5ml 0.5M Tris，pH6.8，4ml 10％SDS，2ml glycerol，1mlβ-mercaptoethanol，0.01％(w/v)bromophenol blue)重新悬浮，超声波破碎至不再混浊，12000g离心收集上清。12.5％SDS-PAGE电泳45分钟检测20μl样品，用考马思亮蓝染色。表达出的sirf1融合蛋白经鉴定是可溶蛋白，获得重组株Ecoli BL21(pGEX-KG-SIRF1)。
5、sirf1基因多克隆抗体的制备
将表达的重组蛋白切胶回收，SDS-PAGE电泳检验其纯度。纯化的蛋白制备多克隆抗体，第一次用量为200μg，与等体积弗氏完全佐剂充分混匀乳化，在家兔的背部皮下多点注射，每点注射约0.2mL。以后每隔2周加强免疫3次，每次用量为150μg，后3次以弗氏不完全佐剂乳化样品。在第4次注射后10天自心脏抽取血液。将兔血于37℃放置1h后再在4℃放置过夜，4,000×g离心10min，吸取上层的多抗血清，分装后于-80℃冻存。
6、SIRF1基因的冰冻切片和杂交实验
将石斑鱼的性反转进程中的性腺用30％蔗糖浸泡3小时后进行冰冻切片，厚度为7μm。将切片经4％多聚甲醛固定30分钟后，用3×PBS洗2次，每次10分钟；再用1×PBS洗3次，每次10分钟；漂洗结束后经乙醇逐级脱水后保存于-20℃中待用。将切片先滴加PBS于4℃湿盒复水30分钟后，用5％奶粉封闭1个小时。PBS冲洗几次后用1％的一抗结合4℃过夜，用免疫前家兔的正常血清作对照。第二天用PBST(PBS加0.1％吐温20)摇洗5次，每次10分钟；10％正常羊血清封闭1个小时，再加荧光标记(FITC)的二抗(1∶100，华美)室温避光处理1小时后，用PBS漂洗5次，每次10分钟。荧光显微镜下观测结果。
冰冻切片和FITC标记的荧光染色结果表明，性反转前的性腺表现为卵巢，SIRF1蛋白定位于颗粒细胞中(图5)；性反转一周的性腺为退化的卵巢，SIRF1蛋白主要定位于颗粒细胞中(图6)。在性反转2周和3周的性腺中，该蛋白表达量大，主要存在于精小叶壁的内侧细胞中(图7、8)；在性反转4周的性腺中，该蛋白表达量减弱，仅在少数精小叶壁的内侧细胞中有表达(图9)；在性反转5周和6周的性腺中，检测不到该蛋白的表达(图10)。
鉴于已知在雌性个体中，由颗粒细胞分泌雌性激素刺激卵子的发育；在雄性个体中，精小叶壁的内侧细胞分泌雄性激素，而且该类细胞对类固醇(雌性激素雌二醇和雄性激素睾酮均为类固醇物质)的测定呈阳性反应。考虑到该蛋白受雄性激素甲基睾丸酮诱导后大量在精小叶壁内侧细胞表达，在成熟精巢的精小叶壁内侧细胞中检测不到该蛋白的存在，由此可知在受到甲基睾丸酮的诱导后，该蛋白大量表达，并刺激其它雄性激素分泌，该基因是调控石斑鱼的由雌向雄性转变的一个重要调控基因，在精小叶的形成中起重要作用。
                                序列表
<110>中国科学院水生生物研究所
<120>石斑鱼性反转基因蛋白及核苷酸序列和应用
<160>2
<210>1
<211>608
<212>DNA
<213>石斑鱼(Epinephelus coioides)
<220>
<221>mRNA
<222>(1，608)
<220>
<221>CDS
<222>(54)...(305)
<400>1
gacactcgat tgttttcctc ctctgagacg gacagcagag agccacagcc aag atg aga 59
Met Arg
1
ctg tac ctt gca att gcc gtg ctg atg ctg gct ttg gtc gca tac aca    107
Leu Tyr Leu Ala Ile Ala Val Leu Met Leu Ala Leu Val Ala Tyr Thr
5 10 15
gag gcc cag gag gag acc ttc gag cag aag ttc gcc aag ttt acc gag    155
Glu Ala Gln Glu Glu Thr Phe Glu Gln Lys Phe Ala Lys Phe Thr Glu
20 25 30
cag gtg act cag gtg ggc caa aac ctg ggt gaa agg ctc aag acc ggc    203
Gln Val Thr Gln Val Gly Gln Asn Leu Gly Glu Arg Leu Lys Thr Gly
35 40 45
ttt gat gat atc caa acc agc gac ttt gca acc aat tca aag gcc cgt    251
Phe Asp Asp Ile Gln Thr Ser Asp Phe Ala Thr Asn Ser Lys Ala Arg
50 55 60
gtc aat gac ttt ttt gag tgg gtg aag aca aaa ctt gaa gac ctc aac    299
Val Asn Asp Phe Phe Glu Trp Val Lys Thr Lys Leu Glu Asp Leu Asn
65 70 75
aac taa acaagtccca gtctccagcc tacaacctgc cgtctgaccg ctgacctctt    355
Asn  *
80
cacacaagtc atcgctctgc tcaccacgca aaatggttgt gttgcctctc tgtcagtgtt 415
ttttgtagat taatttaagt gtaatctttt ggggggaaac aatgtgaaaa agtgcaataa 475
agacatcaaa agaaaacatt ttattattat tatttatata tccattttaa tcactggaaa 535
taatataaga attaagtgta ctgaataaaa aaagtaaaca atcaaaaaaa aaaaaaaaaa 595
aaaaaaaaaa aaa  608
<210>2
<211>83
<212>PRT
<213>石斑鱼(Epinephelus coioides)
<220>
<221>CHAIN
<222>(22，83)
<220>
<221>SIGNAL
<222>(1)...(21)
<400>2
Met Arg Leu Tyr Leu Ala Ile Ala Val Leu Met Leu Ala Leu Val
1 5 10 15
Thr Ala Tyr Glu Ala Gln Glu Glu Thr Phe Glu Gln Lys Phe Ala
20 25 30
Lys Phe Thr Glu Gln Val Thr Gln Val Gly Gln Asn Leu Gly Glu
35 40 45
Arg Leu Lys Thr Gly Phe Asp Asp Ile Gln Thr Ser Asp Phe Ala
50 55 60
Thr Asn Ser Lys Ala Arg Val Asn Asp Phe Phe Glu Trp Val Lys
65 70 75
Thr Lys Leu Glu Asp Leu Asn Asn
80