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一种尿多酸肽组合物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种尿多酸肽组合物的制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
国内外对尿和尿的提取物的医学研究已有几世纪的历史，由于尿及其提取物中含有治疗和预防癌症的分化诱导剂、分化帮助剂和抗恶病质剂，所以尿的提取物已作为一种很有前途的治疗癌症的药物加以应用。
比如ZL 99122051.x公开了一种由新鲜人尿经科学提炼精制而成的抗癌物质—尿多酸肽组合物，其中主要含有马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸和吲哚乙酸四种有机酸及一系列多相性小分子肽以及无机盐，其中四种有机酸的总含量为9.81～23.58mg/ml，总肽含量约为20.7～26.7％；无机元素的总含量为3077.24～8152.01μg/ml；分子量小于一万，该制剂对肿瘤有分化诱导、分化帮助和抗过多排泄的协同作用，且毒性低，在临床上可用了多种晚期恶性肿瘤的治疗。
ZL 99122050.1公开了尿多酸肽组合物的制备方法，将新鲜尿酸化，过滤除去酸化尿中的大颗粒；超滤除去酸化尿中分子量较大的有机物质，将超滤后的酸化尿加入吸附柱内，吸附其中的有效成分；用软水洗涤未被吸附剂吸附但残留在吸附剂中的无机物及亲水性有机物用醇洗脱吸附在吸附柱上的有效成分；收集有色流出液，浓缩后，干燥得到干品；加水溶解，用碱调整pH至中性，低温静置析出浓缩过程中形成的杂质，经除热源、除病毒等工艺进一步纯化。
ZL 99122049.8公开了一种由新鲜人尿提炼精制而成的抗癌物质——尿多酸肽组合物，其中主要含有马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸和吲哚乙酸四种有机酸及多相性小分子肽以及无机盐，该组合物对肿瘤有分化诱导、分化帮助和抗过多排泄的协同作用，且毒性低，能促进癌细胞走向正常分化或使癌细胞凋亡，临床上可用于多种晚期恶性肿瘤的治疗及防止癌症复发，结果表明该药物对多种肿瘤有治疗效果且无毒性，具有很高选择性，大大提高了对癌症的治愈效果。
虽然，上述专利公开了尿提取物的组成、含量，提取工艺及其治疗效果，但随着生物技术的不断发展，为了更进一步减少提取物中的杂质和病毒，保证有效成分能充分发挥药效，还需对尿提取物的提取工艺、灭活病毒工艺地验证、活性成分和结构及其在治疗方面做进一步研究，比如如何进一步去除提取物中的大分子杂质、有害病毒，减少热原，确定小分子多肽的分子量范围及其序列。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿多酸肽组合物的制备方法，该方法克服了现有技术中的不足，选择一条适宜的提取工艺及科学的灭活病毒工艺，有效地去除了病毒和大分子杂质，制备的组合物中多肽的分子量小，生物活性高，毒副作用小，对肿瘤分化诱导、分化帮助有更好的作用，并减低了患者过度排泄低分子代谢物质。
为了实现本发明目的，采用的技术方案为：
本发明所述的一种尿多酸肽组合物的方法，包括如下步骤：
将新鲜人尿经酸化，过滤，吸附，洗脱后，其特征在于，将收集的洗脱液经过低pH值乙醇病毒灭活后，再经减压浓缩，过滤得尿多酸肽组合物。
具体地说，包括如下步骤：
1)将收集的新鲜人尿液调节酸度至pH在2～3之间，过滤除去酸化尿液中直径大于20微米的杂质，再经超滤截留大分子杂质，得滤液；
2)然后将滤液经吸附柱吸附后，用纯化水洗涤吸附柱内，杂质再并用乙醇洗脱吸附柱，收集得洗脱液；
3)所述的洗脱液进行低pH值乙醇病毒灭活；
4)再经减压浓缩，过滤后得尿多酸肽组合物。
其中，步骤1)中调节尿液pH在2～3之间，调节尿液的酸度可以用盐酸、硫酸以及适合本发明的其他酸。
本发明将尿液酸化是为了保持新鲜尿中有效成分的稳定性，抑制细菌的繁殖。同时研究人员经过研究发现，尿液的pH值优选控制在2.0～3.0之间，这样尿液中的有机酸均呈离子状态，更易于提取过程中吸附的完成。
所述的过滤可采用20μm孔径的过滤器，以滤除酸化尿液中大于20μm颗粒杂质。
所述的超滤是为了除去酸化尿中分子量较大的有机物质，截留分子量大于1万的有机杂质，常采用超滤膜，超滤的压力控制为5～15Mpa，比如管式膜及医药领域常用的超滤设备。
步骤2)中所述的吸附采用吸附柱吸附，吸附柱中的吸附剂可以选用C18柱、XAD-7、XAD-8或XAD-16以及适合本发明的其他吸附剂，优选XAD-16柱和XAD-7，最优选XAD-16。
在吸附柱使用前，用醇和纯化水分别洗涤吸附剂，装吸附柱，以一定的流速将超滤后的酸化尿加入吸附柱内，用吸附剂吸附滤液中的有效成分；酸化尿中有大量的无机盐离子和有机物，在进入吸附剂后未被吸附的积存于柱内，用软水洗涤未被吸附但残留在吸附剂中的无机物及亲水性有机物，纯化有效成分；用醇洗脱吸附在吸附剂上的有效成分；收集洗脱液。这样经过吸附洗脱过程，就使被吸附的有效成分解吸附，有效成分进入洗脱液。
相对于20公斤新鲜尿液，吸附剂的用量为5～20公斤，优选为10～20公斤；上述浸泡吸附剂的醇的用量为15～25升，浸泡时间为5～20分钟；优选用量为18～25升，浸泡时间为10～20分钟；洗涤吸附剂的醇和纯化水的用量为15～25升，醇与去离子水的比例为1～2∶2～4；酸化尿加入吸附柱的流速为0.1～2L/min，优选为1～2L/min；洗涤用纯化水的用量为5～30L，优选为15～30L；洗脱速度为0.1～3L/min，优选为0.1～2L/min；洗脱液醇的用量为5～20L，优选为10～20L；洗脱速度为0.1～3L/min，优选为0.5～2L/min；上述洗脱可以使用乙醇、甲醇、丙醇以及适合本发明的其它醇类，优选乙醇。
步骤3)中低pH值乙醇病毒灭活为：调节洗脱液中乙醇浓度为70％～80％，并调pH值至4.0～5.5，在20℃～27℃下，放置4～8小时。
所用的乙醇以95％～99％药用乙醇为佳，调pH值可用1～2mol/L盐酸、硫酸以及适合本发明的其他酸，优选为盐酸。
由于本发明的尿多酸肽组合物是从尿液中提取的多组分物质，因此必须进行病毒灭活来去除各种病毒，但必须考虑在去除病毒的同时，保证不影响组合物的活性。本发明的尿多酸肽组合物采用低pH值乙醇病毒灭活来去除脂包膜病毒(包括艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、Sindbis病毒和狂犬病毒等)，这样不仅保证了生物制品的质量要求，而且也扩大了尿液的采集范围。
本发明研究人员从现有灭活病毒的方法中进行分析研究和对比实验，摸索适合本发明的灭活方法。常用五种灭活病毒的方法分别为：1.巴斯德消毒法(巴氏消毒法)：60℃、10小时；2.有机溶剂/去污剂(S/D)处理法；3.低pH孵放法；4.干热法：80℃加热72小时；5.膜过滤方法。首先，80℃加热72小时不适合本产品，会破坏本产品的活性，而用S/D的方法，但有机溶剂有残留，影响产品质量；选用经典的60℃、10小时灭病毒方法去除病毒，但60℃、10小时灭活病毒方法对设备要求较高，温度较难控制，大量生产后，每批处理50吨尿液须超大的样品容器，费工费时，且周期过长，成本过高，并存在安全隐患，最重要的是对产品的活性有影响，所以现有灭活病毒的方法都不理想。
针对以上的情况，本发明研究人员摸索出一种低pH值乙醇灭活病毒法，其方法为：加入乙醇至溶液乙醇浓度为70％～80％，并调pH值至4.0～5.5，在20℃～27℃下，放置4～8小时。而且低pH值乙醇消毒法与巴氏消毒法进行了抗癌活性影响的对比试验，得出低pH值乙醇消毒法优于巴氏消毒法，并且简便省时，降低成本，不破坏有机酸及多肽的活性，同时还可以有效去除脂包膜病毒。
步骤4)中所述的减压浓缩为：先用1～3mol/L的氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠以及适合本发明的碱调pH值5.5～6.5，所用的碱优选为氢氧化钠；然后抽真空升温，真空度控制为0.08～0.1MPa，温度不超过40℃，加热时间为8～10小时，浓缩至溶液固体总量为200～300mg/ml。
所述的过滤可采用滤膜过滤的方法，所述的滤膜采用孔径为0.45～5微米的滤膜。
过滤后或过滤前需调整pH值，可用1～3mol/L的氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠或1～3mol/L的盐酸、硫酸以及适合本发明的其他碱或酸调pH值5.5～7.5。
经过过滤后即得尿多酸肽组合物。
采用本发明的制备方法所得的一种尿多酸肽组合物，其有效成分主要包括马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、4-羟基苯乙酸、5-羟基吲哚乙酸及20～30种小分子多肽活性成分，小分子多肽活性成分的分子量为400～6000D。
其中优选的小分子多肽活性成分分子量为400～2800D之间。
经分析，其中所述多肽活性成分中两个主要肽的序列的一字符号为：
AVEGPSSALGPLGP
丙氨酸-缬氨酸-谷氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸-丝氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸，14个肽；
LGPSTPGPPPNGGA
亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-天门冬酰胺-甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸，14个肽。
本发明研究人员测定出尿多酸肽组合物中主要两个肽的序列对尿提取液的医药研究及对其人工合成多肽有效成分打下了基础。
本发明所述的尿多酸肽组合物，按组合物为100ml计，其中多肽的含量为100mg～800mg；马尿酸含量为200mg～500mg，苯乙酰谷氨酰含量为250mg～600mg，4-羟基苯乙酸含量为30mg～80mg，5-羟基吲哚乙酸含量为5mg～50mg。
其中用ES质谱法测定四种有机酸的分子量为：马尿酸180，苯乙酸谷氨酰胺265，4-羟基苯乙酸152，5-羟基吲哚乙酸193。
本发明所述的尿多酸肽组合物的含氮量为14～45mg/ml。
所述的尿多酸肽组合物的pH值为5.5～7.5；优选为5.5～6.5。
本发明所述的尿多酸肽组合物可按照药剂学上的方法加入不同的辅剂进行加工，制成不同的剂型产品。
本发明所述的尿多酸肽组合物可制成注射液、注射用粉针剂、片剂或胶囊等，优选为注射液。
比如注射剂可采用注射液的制备方法，先将尿液提取物用注射用水稀释，并调pH值至6.5～7.5，再经除热源、除菌、过滤、除病毒即得尿多酸肽注射液。
具体地说，用注射用水稀释至含总固体30～50mg/ml的溶液，用1～3mol/L的氢氧化钠或盐酸调pH值6.5～7.5，然后用除热源膜除热源，并经除菌滤膜灭菌和除病毒滤膜过滤，最后即得尿多酸肽注射液。
所述的除热源膜为Millipore的除热源膜，所述的滤膜采用孔径为0.20～0.30微米的滤膜，除病毒滤膜可采用20～50纳米NFP Filters的滤膜。
由本发明所述的尿多酸肽组合物制成的尿多酸肽注射液采用了两次灭活方式，即在洗脱后采用低pH值乙醇灭活法去除脂包膜病毒，而在制备成品之前采用除病毒膜来去除细小病毒，这样有效地保留了组合物的生物活性，而且可彻底除去尿液中的病毒，以满足生物制品的要求。
本发明所述的其他剂型可采用本领域人员常用技术进行制备，比如注射用粉针剂可采用冷冻干燥或喷雾干燥的方法。
本发明所述的尿多酸肽组合物治疗和预防癌症的主要有效成分包括：分化诱导剂，分化帮助剂和抗恶病质剂，其药理分析已在ZL 99122049.8中公开。
分化诱导剂是异常甲基转移复合酶的特殊对抗剂，尿多酸肽组合物最重要的有效成分，为小分子多肽和有机酸，是具有很高选择性的抗癌物质。
分化帮助剂是甲基转移复合酶各成员酶的抑制剂，有很强的增进分化诱导剂的诱导作用，尿多酸肽组合物中4-羟基苯乙酸、5-羟基吲哚乙酸和马尿酸是MAT的竞争性抑制剂，在分化疗法中是不可或缺的角色，分化帮助剂一方面可以促进分化，另一方面又可以防止分化诱导剂引起的细胞伤害使分化顺利完成，复发就可以明显降低；而且可以减低分化诱导剂的需求量。
其中苯乙酸谷氨酰胺可以保护化学监察的能力，以预防癌症的发生，同时还有改善癌症病人过度排泄低分子代谢产物的功能，尿多酸肽组合物在临终病人临床应用的结果也证明可以显著增加化疗的疗效，并且减轻副作用，提高病人的生活质量。尿多酸肽组合物有明显抑制癌细胞转移的作用，本身又没有毒性，无疑是手术后防止复发的理想药物。
本发明的尿多酸肽组合物将异常甲基转移复合酶的癌因子抵消掉，使癌细胞无法正常分化，只能像正常细胞进行终末分化。
本发明采用了从人尿液中提取有效成分的新的制备方法，采用新的采用低pH值乙醇病毒灭活方法，不仅保持了提取物的活性，还有效地消除了病毒(脂包膜病毒以及其他细小病毒)和热源，去除了大分子杂质，降低了该组合物的毒副作用，提高了对肿瘤分化诱导、分化帮助的作用，并减低了患者过度排泄低分子代谢物质，促进癌细胞正常终末分化、凋亡，是理想的抗肿瘤药物。同时本发明经过提取所得的尿多酸肽组合物控制了小分子多肽的分子量范围，可获得6000D以下分子量的多肽，确定了两种主要肽的序列，四种有机酸成分的分子量和各组分的含量。
经过进行药效、毒理、临床等药学研究，表明本发明的尿多酸肽组合物由于通过采用新的制备提取工艺，去除大分子杂质以及各种病毒，产品更加安全、无毒性，而且对肝癌、肺癌、血癌等细胞的生长有明显抑制作用，可抑制癌细胞中酶的活性，能有效抑制癌细胞内转移和复发，是一种有效的分化诱导制剂；通过对比分析发现，本发明的尿多酸肽组合物的临床安全可靠性更高，生物活性、抗癌活性及抑瘤率比ZL 99122049.8公开的组合物提高了5-10％。
附图说明
图1为纯化水洗涤投量与pH值之间关系
图2为乙醇蒸发时内胆真空度与时间曲线
图3为乙醇蒸发时内胆温度与时间曲线
图4为马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺对照品HPLC色谱图
图5为马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺供试品HPLC色谱图
图6为4-羟基苯乙酸、5-羟基吲哚乙酸对照品HPLC色谱图
图7为4-羟基苯乙酸、5-羟基吲哚乙酸供试品HPLC色谱图
图8为液-质联用测定注射液中三种有机酸的分子量
图9为液-质联用测定注射液中5-羟基吲哚乙酸的分子量
图10为样品的离子色谱图[20022611 Sm(SG，2×6)]
图11为I区的总质谱图[20022611 408(16.707)Cm(372:428)]
图12为离子色谱图[20022611 408(16.707)M3]
图13-图17为离子色谱图[20022611 408(16.707)局部放大图
图18为II区的总质谱图[20022611 864(32.201)Cm(832:1161)]
图19为图谱[20022611 864(32.201)M3]
图20为图谱[20022611 1438(51.806)M3]
图21为I II区的总质谱图[20022611 1438(51.806)Cm(1324:1444)]
图22为m/z 626.36的序列测定结果
图23为m/z 626.36多肽序列
图24为m/z 609.84的序列测定结果
图25为m/z 609.84的多肽序列
图26为空白样品紫外吸收图谱
图27为标准样品紫外吸收图谱
图28为吸收度曲线
图29为本样品的紫外吸收图谱
图30含75％乙醇样品的光谱吸收曲线
图31去除乙醇样品的光谱吸收曲线
具体实施方式
下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
                        实验例1
本实验例涉及本发明吸附条件的试验。
1.尿液pH值的确定
根据吸附剂的特性：对非离子状态的物质吸附性强，又因为我们产品的主要成分是四种有机酸及小肽类物质。根据四种有机酸的pKa值，将尿液的pH值调至2.0～3.0时，使有机酸均呈离子状态，易于吸附。
2.酸化尿的投料比
XAD-16吸附剂试验前用乙醇浸泡24小时，然后装成3个截面积为0.018m²(20cm，高60cm)的吸附柱，柱体积约为5L。
酸化尿批号分别为990301、990302、990303，投料量为5L、10L、20L、30L、40L、50L。
软水洗涤量为30L。
95％乙醇洗脱投料20L。
收集乙醇洗脱液，观察、记录洗脱液的颜色，并用紫外分光光度法测A430处的吸收值，得出以下数据。
            表1酸化尿不同投料量对95％乙醇洗脱液A430吸收度的影响

酸化尿投料量   〔L〕    三批乙醇洗脱液的颜色及A430吸收度    990301    990302  990303    5    无色0.083    无色0.057  无色 0.074    10    无色0.214    无色0.195  无色 0.201    20    无色0.296    无色0.289  无色 0.312    30  淡黄色0.365  淡黄色0.353淡黄色 0.378    40  淡黄色0.374  淡黄色0.366淡黄色 0.381    50  淡黄色0.382  淡黄色0.368淡黄色 0.389
对上述数据分析：当酸化尿体积高于30L时，吸收值变化极小，说明在加酸化尿到30L时XAD-16已达到饱和吸附，因此，可得出结论，酸化尿投料量与XAD-16吸附剂体积比为6∶1为最佳。
3.纯化水投料比
纯化水的投料比，根据纯化水对杂质的洗涤效果来确定。我们以测定洗涤排放液中含″氯化物″的量及其pH值变化趋势，来反映其洗涤效果，并设计了如下实验方案：
选上述试验的3个XAD-16柱预处理后，先加入30L酸化尿，然后选择纯化水10L、20L、30L、40L、50L五种投料量分别洗涤吸附柱，各取最终洗涤排放液，按《纯化水质量标准》申“氯化物”检测方法，检查排放液中“氯化物”的量。共试验3个批次，每个批次试验3次，结果见表2。
另选择纯化水洗涤投量为50L时，每排放2.5L测定其pH值，试验3个批次，结果见图1。
            表2  不同体积的纯化水洗涤排放液中“氯化物”检查结果纯化水体积    (L)           990304           990305           990306  第1次  第2次  第3次  第1次  第2次  第3次  第1次  第2次  第3次    10  浑浊  浑浊  浑浊  浑浊  浑浊  浑浊  浑浊  浑浊  浑浊    20  微显浑  浊  微显浑  浊  微显浑  浊  微显浑  浊  微显  浑浊  微显  浑浊  微显  浑浊  微显  浑浊  微显  浑浊    30  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清    40  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清    50  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清  澄清
分析上述数据可知，当洗涤排放液达25.0L时，其pH值变化趋势已相当平缓，杂质己基本洗完全。而当纯化水投料量达到30L时，所洗出的氯化物等杂质已相当低，故将纯化水的投料量与XAD-16吸附柱体积比为6∶1为最佳。
4.乙醇投料比
乙醇投料比，以不同投料量乙醇洗脱时尿多酸肽浓缩液中固体总重量的多少，并综合考虑乙醇用量两项指标来确定。选用上述试验中XAD-16吸附柱，预处理后，加入30L酸化尿，先用30L纯化水洗涤XAD-16吸附柱，再分别投入95％药用乙醇5.0L、7.5L、10.0L、12.5L、15.0L，洗脱被吸附的有效成分，收集提取液进行减压浓缩，测定浓缩液的总固体量及体积，计算浓缩液中的固体总重量。共试验3个批次，每个批次进行3次，计均值后，得出以下数据，见表3。
表3  不同体积乙醇洗脱对尿多酸肽浓缩液中固体总重量的影响   乙醇用量〔L〕    三批尿多酸肽溶液中固体总重量(g)    990401    990402    990403    5.0    20.6    20.2    21.9    7.5    25.1    24.8    24.2    10.    26.4    26.2    25.9    12.5    26.7    26.5    26.3    15.0    26.9    26.6    26.6
分析上述数据可知，乙醇用量约为吸附剂体积的两倍时，足以洗脱被吸附的有效物质。乙醇投料量超过7.5L后，浓缩液中固体总重量增加不明显，因此乙醇的投料量与XAD-16吸附柱体积之比为1.5∶1是最佳的。
5.XAD-16吸附剂重复使用次数
我们对XAD-16吸附剂使用次数进行了如下试验，XAD-16吸附剂处理好后，加入酸化尿30L，用纯化水30L洗涤，再用95％药用乙醇7.5L洗脱。选3组吸附剂，分别进行300次试验，收集第50，100，150，200，250，300次的洗脱液，减压浓缩至相同体积。测定各次制得浓缩液的总固体量及对HBL-100细胞群抑制百分比，得出如下数据。
        表4 XAD-16吸附剂重复使用次数对几种指标的影响    项目    总固体量    mg/ml    对HBL-100细胞群抑制    ％    吸附剂编号    01    02    03    01    02    03    吸    附    剂    使    用    次    数    1    281    269    277    100    98    99    50    286    282    283    99    99    99    100    279    279    269    99    100    100    150    282    268    252    100    99    98    200    256    247    248    98    100    100    220    219    210    210    88    90    90    250    183    171    183    84    80    82
对表4分析可知，当XAD-16在设定工艺下，使用200次时，浓缩液的总固体量与使用1、50、150次时相差不大，超过200次后，抗癌活性有所下降，总固体量大大减低。由此可见，在规定工艺条件下，XAD-16的使用次数定为200次。用到200次后即可淘汰。
6.总固体对酸化尿得率
计算总固体对酸化尿的得率，连续考察十批，结果见表5。
                        表5  总固体总量对酸化尿得率表    批号  酸化尿投料量    L  浓缩液体积    L    总固体量    mg/ml    得率％    (g/l)    020401    7680    24.4    209    66.4    020402    7920    21.7    229    62.7    020103    7200    20.8    222    64.1    020404    7200    21.6    203    60.9    020405    7680    22.8    210    62.3    020406    7680    24.8    203    65.6    020407    7680    23.6    200    61.5    020408    7200    18.6    256    66.1    020409    7200    22.5    206    64.4    020410    7200    17.7    260    63.9   平均值    7464    21.85    219.8    64.3
总结：对表5分析可知，在规定工艺下，总固体总量对酸化尿的得率平均值为64.3％(g/L)，其中最高为66.4％(g/L)，最低为60.9％(g/L)。
因此将总固体对酸化尿的得率定为60.0～67.0％(g/L)。
7.吸附剂的再生
当吸附剂循环使用时，洗脱用的有机溶剂即可将柱上的物质洗尽，然后用水进行洗涤至氯(CL-)阴性时，pH值与纯化水接近即可。当吸附剂循环使用一段时间后，发现残留物将吸附剂污染为黄褐色时，则需要用酸碱再生处理。先用0.5MNaOH浸泡12h后，水洗至中性，再用0.5MHCl浸泡12h后，水洗至中性。
                            实验例2
本实验例涉及去除病毒方法的研究。
因尿多酸肽溶液是从尿液中提取的多组份物质，所以病毒灭活是我们工艺研究的重要部分，目前通用的灭活病毒的方法有五种：
(一)巴斯德消毒法(巴氏消毒法)：60℃、10小时；
(二)有机溶剂/去污剂(S/D)处理法；
(三)低pH孵放法；
(四)干热法：80℃加热72小时；
(五)膜过滤方法。
本发明研究人员对五种灭活病毒的方法进行分析研究和对比实验。首先80℃加热72小时不适合本产品，会破坏本产品的活性，而用S/D的方法，但有机溶剂有残留，影响产品质量；选用经典的60℃、10小时灭病毒方法去除病毒，但60℃、10小时灭活病毒方法对设备要求较高，温度较难控制，大量生产后，每批处理50吨尿液须超大的样品容器，费工费时，且周期过长，成本过高、并存在安全隐患；经过分析，发现现有灭活病毒的方法都不理想。针对这种情况并通过反复验证，本发明研究人员摸索出一种低pH值乙醇消毒法，其方法为：加入乙醇至溶液乙醇浓度为70％～80％，并调pH值至4.0～5.5，在20℃～27℃下，放置4～8小时。而且低pH值乙醇消毒法与巴氏消毒法进行了抗癌活性影响的对比试验，得出低pH值乙醇消毒法优于巴氏消毒法，并且简便省时，降低成本，不破坏有机酸及多肽的活性。
A工艺：提取液调pH值4.0-5.5、乙醇浓度为70-80％，于20℃～27℃下，放置4～8小时，灭活病毒。
B工艺：提取液调pH值为6.0-6.5，于60℃、10小时灭活病毒。
两种灭活病毒工艺考察，按《尿多酸肽溶液质量标准草案》进行考察，共试验10批，结果见表6。
                表6两种病毒灭活工艺对抗癌活性的影响    项目对人乳癌细胞株HBL-100的体抑制率对人肝癌Smmu7721的体外抑制试验IC50(mg/ml)    标准规定    不得小于90％    应小于2.0    执行工艺    A工艺    B工艺    A工艺    B工艺批号    020901    98％    96％    1.7    1.8    020902    97％    99％    1.6    1.6    020903    99％    96％    1.7    1.5    020904    100％    94％    1.4    1.7    020905    95％    85％    1.9    1.8    020906    99％    94％    1.8    1.6    021001    96％    96％    1.5    1.6    021002    96％    87％    1.8    1.8    021003    100％    100％    1.7    1.5    021004    100％    97％    1.6    1.9
从表6分析数据可知，A工艺对两种抗癌活性测定10批的合格率均100％。B工艺对人乳癌细胞株HBL-100的抗癌活性有两批不合格(85％、87％，规定应不得小于90％)合格率仅为80％；对人肝癌细胞Smmu7721抗癌活性10批中有1批不合格(2.1)，合格率为90％。由此可见，A工艺优于B工艺。
用A灭活工艺生产的尿多酸肽注射液，分别在中国军事医学科学院五所和九所进行HbsAg、HCV、HIV-1、HIV-2检查，结果均为阴性，用国产试剂盒与进口试剂盒分别进行HbsAg、HCV抗体、HIV-1、HIV-2抗体和梅毒螺旋抗体检测，全部为阴性。
本发明尿多酸肽注射液采用两次灭活工艺，先用低pH值乙醇灭活病毒法，再在灌装前采用除病毒的滤膜进行灭活处理。此70％～80％的乙醇和除病毒膜两步灭活工艺已在中国军事医学科学院五所和九所进行了灭活工艺的验证，结果HIV-1加到含70％～80％乙醇的尿多酸肽提取液中，浸泡4～8小时后，滴度下降5.23～5.25个log，且经细胞培养盲传三代未出现细胞病变；伪狂犬病毒的灭活效果≥5.38～6.00logTCID50；Sindbis病毒的灭活效果≥5.63～5.88logTCID50。将75％乙酵处理6小时的三批样品，盲传三代，未出现细胞病变。
另外为除去细小病毒(B19等)，增加用Viresolve^TM NFP Filters型号的Millipore滤膜，除去18～24nm的细小病毒。世界卫生组织推荐除病毒的滤膜应为35nm或更小。用Viresolve NFP型号的膜除病毒的工艺验证结果，HIV的滴度下降4.50～5.23个log，且经细胞培养盲传三代未出现细胞病变；经验证此除病毒膜可除去4.8～5.6logTCID50脊髓灰质炎病毒。
                        实验例3
本实验例涉及对真空浓缩的试验研究。
在双锥回转真空干燥机中加入500L乙醇提取液，开启真空及热水循环泵，开始加热，控制真空度为0.08～0.1MPa，外夹套水温不超过62℃，加热时间约10小时。每30分钟记录一次内胆温度、压力，达到蒸发终点时，内胆温度快速下降，浓缩结束。共进行3个批次。结果见图2和图3。
以上3批真空浓缩(批号分别为：020401、020402、020403)分析数据可知：控制真空度为0.08～0.1MPa，外夹套水温不超过62℃，可保证内胆温度不超过40℃。当内胆温度快速下降时，浓缩结束，加热时间为8-10小时。
                            实验例4
本实验例涉及尿多酸肽注射液过滤前后抗癌活性、多肽含量及有机酸含量的考察。
1.尿多酸肽注射液过滤前后抗癌活性考察
取除菌过滤后的滤液三批和该三批除病毒后的尿多酸肽注射液，按照《尿多酸肽注射液质量标准草案》抗癌活性测定项下的方法进行测定，结果见表7。
                    表7除病毒过滤前后抗癌活性的比较    批号030301    批号030302    批号030303  过滤前  mg/ml  过滤后  mg/ml  过滤前  mg/ml  过滤后  mg/ml  过滤前  mg/ml  过滤后  mg/ml  0.76  0.78  1.32  1.36  1.35  1.40
从表7中看出，除病毒过滤前后三批抗癌活性无显著性差异，说明工艺中使用的Millpore公司的Viresolve^TM NFP Filters型号的除病毒膜不影响注射液抗癌活性。
2.三批尿多酸肽注射液过滤前后多肽含量考察
取除菌过滤后的滤液三批和该三批除病毒后的尿多酸肽注射液，按照《尿多酸肽注射液质量标准草案》含量测定项下多肽的测定方法进行测定，结果见表8。
                    表8除病毒过滤前后多肽含量的比较    批号030301    批号030302    批号030303  过滤前  mg/ml  过滤后  mg/ml  过滤前  mg/ml  过滤后  mg/ml  过滤前  mg/ml  过滤后  mg/ml  1.83  1.85  2.08  2.06  2.52  2.46
从表中看出，除病毒过滤前后三批多肽含量无显著性差异，说明工艺中使用的Millipore公司的Vireso lve^TMNFP Filters型号的除病毒膜不影响注射液中多肽含量。
3.三批尿多酸肽注射液过滤前后四种有机酸含量考察
取除菌过滤后的滤液三批和该三批除病毒后的尿多酸肽注射液，按照《尿多酸肽注射液质量标准草案》含量测定项下四种有机酸酌测定方法进行测定，结果见表9。
            表9  除病毒过滤前后四种有机酸含量的比较四种有机酸名称    批号030301    批号030302    批号030303    过滤前    mg/ml    过滤后    mg/ml    过滤前    mg/ml    过滤后    mg/ml    过滤前    mg/ml    过滤后    mg/ml马尿酸    2.44    2.44    2.84    2.84    2.73    2.74苯乙酰谷氨酰酸    2.28    2.26    2.80    2.72    2.60    2.55苯乙酸    2.48    2.50    2.74    2.74    2.96    2.93吲哚乙酸    0.05    0.06    0.06    0.06    0.08    0.08
从表9中看出，除病毒过滤前后三批四种有机酸的含量测定结果基本一致，说明工艺中使用的Millipore公司的Viresolve^TM NFP Filters型号的除病毒滤膜不影响四种有机酸的含量。
                            实验例5
本实验例涉及尿多酸酞组合物中各成分的结构确证。
本发明尿多酸酞组合物为从健康人尿中提取的含四种有机酸(马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、4-羟基苯乙酸、5-羟基吲哚乙酸)及一系列小分子肽等活性成分，结构确证试验主要对上述两大类物质进行确证。四种有机酸用高效液相色谱法试验，采用加样确认并分离测定以及质谱法测定分子量；小分子肽采用液-质联用，测定肽的分子量范围，并确定了其中两个主要肽的序列。
1.尿多酸酞中四种有机酸结构确证(HPLC法)
1.1仪器  分析型HPLC，日本岛津公司LC-10ATVP，检测器，SPD-10AVP。色谱柱，DikMA公司，Luna 5μ18(Z)，250×4.6mn(dm)。
1.2对照品  4-羟基苯乙酸；5-羟基吲哚乙酸；马尿酸；苯乙酰谷氨酰胺等购自Sigma公司。
1.3色谱条件  流动相：甲醇∶水∶冰醋酸＝250∶750∶5流速：1ml/min；进样量：20μl；检测波长：260nm。
1.4对照品溶液的制备
精密称取5-羟基吲哚乙酸对照品20mg，置50ml量瓶中，加水约40ml，超声30分钟便溶解，加水稀释到刻度，作为储备液。
精密称取马尿酸对照品45mg，苯乙酰谷胺酰对照品60mg，4-羟基苯乙酸对照品45mg，置同一50ml量瓶中，加水约40ml，超声30分钟使溶解，再精密量取5-羟基吲哚乙酸对照品储备液5.0ml，置上述50ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
1.5供试品溶液的制备
取本品适量，加水稀释制成每1ml中含8mg的溶液，即得。
1.6测定法
取上述对照品溶液和供试品溶液各20μl注入色谱仪，记录色谱图，用外标法以峰面积计算4种有机酸的含量。
1.7测定结果见表10和图4～图7。
        表10四种有机酸在HPLC色谱图中保留时间比较    对照品    Rt(min)马尿酸12.398苯乙酰谷氨酰胺    13.265 4-羟基本乙酸    41.465 5-羟基吲哚乙酸    51.065尿多酸肽注射液    Rt(min)12.398    13.398    41.598    50.132
从图4～图7看出各有机酸的保留时间基本一致，可证明本品含以上四种有机酸。
2.尿多酸肽四种有机酸结构确证(质谱法)
用ES质谱法测定四种有机酸的分子量，见图8、图9。
从图8、图9中得到四种有机酸的分子量：
马尿酸180，苯乙酸谷氨酰胺265，4-羟基苯乙酸152，5-羟基吲哚乙酸193，分别与四种有机酸的理论值一致。
3.电喷雾质谱仪测定肽组分序列和分子量
检测条件正离子检测方式，毛细管电压3000V，Cone电压50V，Collision电压30V，Mep检测器电压2000V。
肽序例分析软件为Micromass公司的Biolynx。
分析方法电喷雾质谱仪分析方法
测试结果
从I区的总质谱图看出，约含20个多肽，其中相对含量较高者约5个[见2022611408(16.707)M3]，它们的分子离子峰[M+H]+分别为1218.69、1240.67、1251.69、1322.74、1452.81(分子量＝分子离子峰-1.0078)。
从II区的总质谱图看出：在m/z＞700时仅发现一个明显的离子峰[M+H]+＝1251.73。
对I区5个较大肽中，选两个强度较大的离子进行串联质谱分析，测定其多肽序列。
结论：尿多酸肽中含有20-30种多肽，它们的分子量400～6000D，优选分子量为400-2800D。其中两个主要肽的序列为
AVEGPSSALGPLGP
丙氨酸-缬氨酸-谷氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸-丝氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸，14肽
LGPSTPGPPPNGGA
亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-天门冬酰胺-甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸，14肽
4.总结论
4.1用HPLC法及液一质联用色谱法两种方法确证了尿多酸肽中四种有机酸和肽组分的存在，且肽组分的分子量400～6000D，优选分子量为400-2800 D。见图10。
四种有机酸的结构确证结果见表11。
                    表11四种有机酸对照品与样品Mw对比  理论值    Mw  马尿酸  179.2苯乙酰谷氨酰胺    264  4-羟基苯乙酸    152.2 5-羟基吲哚乙酸     193.3  实测值    Mw   180    265     152      193
4.2电喷雾质谱法确证了尿多酸肽中肽组分，本品共含有20余种多肽，其分子量400～6000D，优选分子量为400～2800D，并用串联质谱测定了其中两个主要多肽组分的序列为：
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丙氨酸-缬氨酸-谷氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸-丝氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸，14肽
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亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-天门冬酰胺-甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸，14肽。
表12用Folin-酚法测定肽含量结果    试验次数    1    2    3总固体(mg)    417    586.8    665.4总肽量(mg)    17.56    28.29    30.07多肽含量(％)    4.21    4.82    4.52
从表12看出每100mg尿多酸肽组合物中多肽平均含量为4.52％。
                            实验例6
本实验例涉及尿多酸酞组合物中肽组分及其部分肽的序列测定。
样品名称：尿多酸肽组合物(批号20020801)
样品状态：咖啡色冻干粉
检测项目：寻找肽组分并测定部分肽的序列
检测标准及其它技术要求：
(1)电喷雾质谱仪分析方法细则。
(2)检测条件：正离子检测方式。毛细管电压3000V，cone电压50V，Collision电压30V.MCP检测器电压2200V。
(3)肽序列分析软件为Micromass公司的Biolynx。
检测环境：温度：22℃
检测仪器名称及型号：Q-TOF2 ESI-MS/MS(Micromass)
仪器测量误差为0.01％。
分析方法与测试结果：
一、分析方法
(一)样品的预处理：
1.称取供试品(尿多酸肽组合物，咖啡色冻干粉)约10.0mg于10ml具塞刻度试管中。
2.加入5.0ml三氯甲烷，充分震荡并超声提取3分钟(KQ-100超声波清洗器，江苏昆山淀山湖检测仪器厂)。静置10分钟，用洁净吸管将三氮甲烷小心吸出弃去。
3.加入5.0ml石油醚，其余步骤同2。
4.重复步骤2和步骤3。
5.加入5.0ml无水乙醇，其余步骤同2。重复3次。残余物自然晾干待用(约30分钟)。
(二)肽成分的寻找与识别
上述处理过的样品溶解于5ml 1％甲酸去离子水中，离心后取1μL进行“毛细管高效液相色谱纳升电喷雾—四级杆飞行时间串联质谱”自动化分析。
(三)部分肽成分的序列测定
上述处理过的样品溶解于5ml 1％甲酸去离子水中，离心后取5μL进行“纳升电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱”分析。选择1-2个主峰进行序列测定。
二、结果
1.上述处理过的样品的离子色谱图见图10[20022611 Sm(SG，2×6)]，其可分为三个区域：
I区的保留时间为14min～19min
II区的保留时间为30min～45min；
III区的保留时间为45min～55min。
2.I区的总质谱图见图11[20022611 408(16.707)Cm(372:428)](上部，右上角为对应的色谱图)，
在m/z＞900时，未发现明显的离子峰。用专门软件MaxEnt3转换后的图谱见图12[20022611408(16.707)M3](下部)。在m/z＝900～2300范围，发现明显的离子峰，且主要集中在m/z＝900～1500范围内；而在m/z＝300～900范围内仍有部分离子峰，它们是带单电荷的分子，其中可能包含部分肽。比较转换前后的质谱图可以看出：供试品的离子色谱I区中约含有20多个肽，其中相对含量较高者约5个(见[20022611 408(16.707)M3]等局部放大图5张)(见图13-17)，它们的分子离子峰[M+H]+分别为1218.69，1240.67，1251.69，1322.74，1452.81(分子量＝分子离子峰-1.0078)。
3.II区的总质谱图见图18[20022611 864(32.201)Cm(832:1161)](上部，右上角为对应的色谱图)，
在m/z＞700时，末发现明显的离子峰。用专门软件MaxEnt3转换后的图谱见图19[20022611864(32.201)M3]P0(下部)。在m/z＞700时，仅发现一个明显的离子峰[M+H]+＝1251.73；而在m/z＜700范围内离子峰与转换前基本一致，它们主要是带单电荷的有机分子。比较转换前后的质谱图可以看出：供试品的离子色谱II区中肽组分很少。
4.III区的总质谱图见图20[20022611 1438(51.806)Cm(1324:1444)](下部，右上角为对应的色谱图)，在m/z＞700时，未发现明显的离子峰。用专门软件MaxEnt3转换后的图谱见图21[20022611 1438(51.806)M3](上部)。转换前后的质谱图几乎一致，因此，供试品的离子色谱III区中肽组分很少。
5.选择两个强度较大的离子进行串联质谱分析：
m/z 626.36的序列测定结果见图22 20022615a，序列报告见图23 20022615a-wkh-1，序列为：
AVEGPSSALGPLCGP。单同位素质量为1250.7043Da，计算值为1250.6506Da，偏差为0.05Da。m/z 609.84的序列测定结果见图24 20022615b，序列报告见图25 20022615b-wkh-1，序列为：
LGPSTPGPPPNGGA。单同位素质量为1217.6644Da，计算值为1217.6040Da，偏差为0.06Da。
三、结论
本发明的尿多酸肽组合物中含有20-30种多肽，它们的分子量400～6000D，其中两个主要肽的序列为：
AVEGPSSALGPLCGP
LGPSTPGPPPNGGA
                    实验例7
本实验例涉及总肽含量的测定。
样品状态：深棕色粉末
检测项目：总肽含量
检测标准及其它技术要求：紫外和可见吸收光谱方法通则
检测环境：温度：16℃，湿度：31％
检测仪器名称及型号：HP-8453紫外可见分光光度计，DAD二极管阵列检测器
波长准确度：±0.6nm，吸光度准确度：±0.05AU，分辨率：1nm
分析测试结果：
样品的前处理
1.1 精密称取适量半成品3份，分别置于带塞子的离心管中，加入10mL三氯化碳，超声10分钟，待静置分层后，用吸管小心吸去液体。
1.2 在上述离心管中加入mL石油醚，超声10分钟，以2000rpm转速，离心2分钟，弃去上清液。
1.3 再加入10mL无水甲醇，超声10分钟，以2000rpm转速，离心2分钟，弃去上清液。
1.4 重复三次1.3项下的操作。
1.5 用氮气吹干离心管中的样品。
2   标准溶液的制备
称取10.6mg牛血清蛋白(Sigma公司)，用水定容至50mL容量瓶，制成标准溶液，其浓度为0.212mg.mL。
3   试剂制备
3.1 4％碳酸钠溶液：称取碳酸钠2.0g，用水定容至50mL容量瓶，摇匀。
3.2 1％碳酸铜溶液：称取硫酸钠20.0mg，用水定容至2mL容量瓶，摇匀。
3.3 0.2mol·L^-1氢氧化钠溶液：称取0.40g氢氧化钠，用水定容至50mL容量瓶，摇匀。
3.4 2％酒石酸钾钠溶液：称取酒石酸钾钠40.0mg，用水定容至2mL容量瓶，摇匀。
3.5 碱性铜试液：临用前配制。取4％碳酸钠溶液和0.2mol·L^-1氢氧化钠溶液各50mL，1％硫酸铜溶液和2％酒石酸钾钠溶液各1mL，摇匀。
3.6 Folin-酚试液：2.0mol·L^-1，购于北京经科公司，临用前用水稀释至1.0mol·L^-1。
4   标准曲线的制备
吸取标准溶液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL，分别置于10试管中，加水至1.00mL，再分别加入碱性铜试液5.00mL，摇匀，室温放置10分钟。依次加入酚试液0.05mL，摇匀。置30℃水浴中保温30分钟，取出放冷至室温，以未加入标准溶液管作空白，在750nm波长处测定吸收度，以蛋白浓度C(mg·mL^-1)为横坐标，吸收度A为纵坐标制作标准取线(见图26-28)：C＝0.3209×A，r＝0.999。
半成品的测定
将1.5项下处理的样品，用水定容至2.00mL容量瓶，取出0.50mL用水稀释至2.00mL，再取出0.30mL加水至1.00mL，其余操作同4项。由HP-8453工作站给出浓度C值，见图29(04003065)。
6   结果计算

其中C：浓度(mg·mL^-1)，V1：Folin—酚反应时的体积(6.50mL)，V2：从定容的容量瓶中取出的溶液体积(0.50mL)，V3：组合物定容后的体积(2.00mL)，V4：将V2稀释后的溶液体积(0.50mL)，V5：将V4中取出的溶液体积(0.30mL)

表13  编号    1    2    3  吸收度A  浓度从C(mg·mL^-1)  组合物中总肽重量(mg)  组合物重量(mg)  含量％  平均含量％  标准偏差    0.31562    0.10128    17.555    417.0    4.21    0.50861    0.16321    28.289    586.8    4.82    4.52    0.31    0.54066    0.17349    30.07    665.4    4.52
                        实验例8
本实验例涉及尿多酸肽组合物的质量控制。
本实验例尿多酸肽组合物从减压浓缩，用1.2μm滤膜滤过后得到的浓缩液。每100ml中多肽的含量为100mg～800mg；马尿酸含量为200mg～500mg，苯乙酰谷氨酰含量为250mg～600mg，4-羟基苯乙酸含量为30mg～80mg，5-羟基吲哚乙酸含量为5mg～50mg。
【性状】本品为深棕色澄明液体。
【鉴别】在含量测定项下记录的色谱图中，四种有机酸峰的保留时间应与各自相应的对照品峰的保留时间一致。
【检查】pH值取本品，依法测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，pH值应为6.5～7.5。
溶液的澄清度与颜色  取本品适量，用水稀释100倍，溶液应澄清。所显颜色照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在430nm波长处测定，吸收度值不得过0.6。
总固体量  精密量取本品2ml，置于已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，在105℃干燥至恒重，其总固体量应为200-300mg/ml。
含氮量  精密量取本品1ml，依法测定(中国药典2000年版二部附录VII D)，本品的含氮量应不低于14mg/ml。
多肽组分测定  照高效液色谱法(中国药典2000年版二部附录V D)测定。所得色谱图中3个主要肽的相对百分含量应不低于50.0％。
不溶性微粒  取本品1瓶，依法检查(中国药典2000年版二部附录IX C)，应符合规定。
细菌内毒素  取本品，依法检查(申国药典2000年版附录XI E)，每1ml中含内毒素量应小于0.5EU(鲎试剂灵敏度为0.0625EU/ml)。
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录VD)测定。
色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸(250∶750∶5)为流动相；流速1ml/min；检测波长为260nm。理论板数以马尿酸峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备
精密称取5-羟基吲哚乙酸对照品20mg，置50ml量瓶中，用0.05mol/L的氢氧化化钠溶液溶解并稀释至刻度，作为贮备液。
精密称取马尿酸对照品45mg，苯乙酰谷氨酰胺对照品60mg，4-羟基苯乙酸对照品45mg，置同一50ml量瓶中，加0.05mol/L的氢氧化钠溶液约40ml溶解，再精密量取吲哚乙酸对照品贮备液5.0ml，置同一50ml量瓶中，同法稀释至刻度，混匀，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备
取本品适量，加0.05mol/L的氢氧化钠溶液稀释制成每1ml中含8mg的溶液，即得。
测定法取上述对照品溶液和供试品溶液各20μl注入色谱仪，记录色谱图，用外标法以峰面积计算四种有机酸的含量。
【活性测定】以下两种细胞株任选一种进行测定即可。
测定法：Hep-G2肝癌细胞株或CL.1-0肺癌细胞株
按尿多酸肽注射液质量标准草案方法测定，IC50应≤2.0mg/ml。
                    实验例9
本实验例涉及HIV灭活验证。
1.材料
1.1 尿多酸肽组合物(含73-75％酒精)：批号021001、021101、021102。
1.2 人免疫缺陷病毒：HIV-1 IIIB株
1.3 MT4细胞
1.4 细胞培养液：RPMI 1640补加10％新生小牛血清
1.5 96孔细胞培养板
2.方法
取含73-75％酒精的尿多酸肽组合物0.9ml，加HIV-1(TCID50＝7.25)0.1ml，分别于0、1/4、1、2、6小时取样0.1ml，立刻用细胞培养液做10倍系列稀释，加到已含有MT4悬液的96孔板中，吸附1小时后换液，吸出0.1ml上清液，补充0.1ml新鲜细胞培养液。设空白对照(样品加病毒)，阳性对照(培养液加病毒)，阴性对照(样品加培养液)。用MT4细胞微量培养法测定HIV的滴度，以细胞病变(CPE)作为判别病毒存在的指标。对不出现细胞病变的样品用细胞培养盲传三代，继续观察细胞病变的情况。
3.结果
对021001批样品进行三次重复检测，021101和021102批样品各进行一次检测，结果见表14，对不出现病变的样品连续盲传三代，结果见表15。
                    表14  三批样品病毒滴定的结果    样品批号    验证次数    HIV滴度(TCID₅₀)    0hr    1/4hr    1hr    2hr    6hr    021001    第一次    5.55    ＜2.00    ＜2.00    ＜2.00    ＜2.00    第二次    5.23    ＜2.00    ＜2.00    ＜2.00    ＜2.00    第三次    5.00    ＜2.00    ＜2.00    ＜2.00    ＜2.00    021101    第一次    5.55    ＜2.00    ＜2.00    ＜2.00    ＜2.00    021102    第一次    5.23    ＜2.00    ＜2.00    ＜2.00    ＜2.00    阳性对照    7.25    7.23    7.25    7.23    7.25
                        表15盲传三代的结果(CPE)  样品批号  验证次数  取样  时间    第一代    第二代    第三代  10² 10³  10²  10³  10²  10³  021001  第一次  1/4hr   -  -   -   -   -   -  1hr   -  -   -   -   -   -  2hr   -  -   -   -   -   -  6hr   -  -   -   -   -   -  第二次  1/4hr   -  -   -   -   -   -  1hr   -  -   -   -   -   -  2hr   -  -   -   -   -   -  6hr   -  -   -   -   -   -  第三次  1/4hr   -  -   -   -   -   -  1hr   -  -   -   -   -   -  2hr   -  -   -   -   -   -  6hr   -  -   -   -   -   -  021101  第一次  1/4hr------  1hr------  2hr------  6hr------  021102  第一次  1/4hr------  1hr------  2hr------  6hr------
注：-表示细胞无病变。
4.结论
从上述结果可以看出，HIV-1加到含73-75％酒精的尿多酸肽组合物中，浸泡6小时后，滴度下降5.23-5.25个Log，且经细胞培养盲传三代未出现细胞病变。
                            实验例10
本实验例涉及尿多酸肽提取工艺中乙醇灭活病毒及膜过滤除病毒的效果评价
1.目的：
在于评价尿多酸肽生产工艺中75％乙醇对Sindbis(拟HCV)和伪狂犬病毒(拟HBV)的灭活效果及膜过滤去除脊髓灰质炎病毒(拟HAV)的效果。
2.实验材料：
(1)指示病毒：以Sindbis病毒和伪狂犬病毒作为脂包膜病毒的指示病毒，脊髓灰质病毒作为无脂包膜病毒的指示病毒。上述病毒均为中国药品监督管理局2002.5颁发的《病毒灭活规程》中所规定的指示病毒。
(2)细胞株：Vero细胞、BHK21细胞。它们均由含10％胎牛血清的MEM培养基培养。
(3)含75％乙醇尿多酸肽样品和用于膜过滤的尿多酸肽半成品：经乙醇解吸附后，尿多酸肽样品中的乙醇含量用气相色谱法检测，根据测定结果把乙醇浓度调整到75％，PH为4.5。用于膜过滤的尿多酸肽半成品为本发明所述的经微孔滤膜过滤的半成品。以上样品均由厂家提供。
(4)无水乙醇(分析纯)：北京化学试剂厂生产。
(5)滤膜：Millipore公司生产的Viresolve NFP柱状滤膜，在实验前一天连接好各种接头和胶管，按厂家要求用5-10升蒸馏水冲洗滤膜。然后包装高压消毒备用。由于此种滤膜价格昂贵，为了降低成本，本实验采用一个滤膜过滤三批样品。方法是过滤完一批样品后，用0.2NNaOH和0.2N HCl分别浸泡该滤膜2小时，再分别用蒸馏水冲洗至中性。晾干后重新包装，高压蒸汽消毒再用于处理另一批样品。
(6)蠕动泵：保定兰格公司生产的BT00-100M蠕动泵，配有YZ 1515W泵头，过滤压力为1-2bar。
3.实验方法：
(1)对照样品
取500ml含75％左右乙醇的尿多酸肽样品。经放置蒸发器蒸去乙醇(余下15-20％左右的体积)，用注射用灭菌生理盐水恢复到原体积。实验时用10％的碳酸氢钠溶液调PH4.5-5.0(为生产工艺中的PH值)，用针头滤器过滤除菌。此蒸去乙醇恢复到原体积的尿多酸肽样品与含75％左右乙醇的尿多酸肽样品光谱吸收曲线一致。取此蒸去乙醇恢复到原体积的尿多酸肽(PH4.5-5.0)样品9ml+1ml指示病毒(滴度7-7.5log)，混匀，立即取0.2ml+1.8ml培养液(含10％胎牛血清)做1∶10稀释，即为0时对照。其余样品放25℃±1℃的温箱中孵育6h，然后取0.2ml速度+1.8ml培养液(含10％胎牛血清)作为6h对照。样品经稀释后，立即加入已接种细胞的96孔培养板中，培养72h后观察细胞病变情况。做三批重复。
(2)处理样品：
取含75％左右乙醇的尿多酸肽样品6ml+1ml指示病毒+3ml无水乙醇混匀(乙醇终浓度为75％)，放25℃±1℃的温箱中，分别于5、15、30、60、120、240、360min取样0.2ml+1.8ml培养液(含10％胎牛血清)做1∶10稀释，以终止乙醇的持续作用。样品经稀释后，立即加入已接种细胞的96孔培养板中，培养72h后观察细胞病变情况。做三批重复。
(3)终止对照：
取2ml含75％左右乙醇的尿多酸肽样品加入18ml培养液(含10％胎牛因清)中，做1∶10稀释，即为终止液。用此终止液1∶100倍稀释病毒(与样品处理组的病毒稀释度相同)并置25℃±1℃温箱中孵育，分别于0h和6h取样后直接加入已接种细胞的96孔板中，测终止对照的病毒滴度。每批实验均同时做终止对照。
(4)膜过滤法：取厂家提供的尿多酸肽半成品900ml，加入100ml脊髓灰质炎病毒(7.5LgTCID₅₀)，混匀后以蠕动泵做动力在1-2bar压力下推动样品通过Millipore公司生产的Viresolve NFP柱状滤膜过滤除病毒。于样品过滤前后分别取样用含10％胎牛血清的培养液作1∶10稀释立即接种于长满单层细胞的96孔培养板，经72h培养后观察细胞病变情况。做三批重复。
(5)盲传：每批经75％乙醇处理样品及经膜过滤后的样品均做细胞盲传三代。
(6)病毒滴定：
采用微量法。将上述各组中不同时间所取的样品经10倍系列稀释后，立即加入已接种细胞的96孔板中，放5％CO₂培养箱中，37℃孵育72h，镜下观察细胞病变(CPE)情况。同时用1％结晶紫染色细胞板，保存结果。病毒滴度按Karber氏方法计算。
注：对照样品、处理样品、终止对照及膜过滤前后样品的第一个稀释度由于分别含有尿多酸肽和乙醇，必须用含10％胎牛血清的培养液进行稀释，以保证加入细胞板以后有足够营养供细胞生长三天之需，否则会出现细胞生长不良的现象，其余的稀释度用维持液即可。
4.结果
(1)75％乙醇对尿多酸肽中伪狂犬病毒的灭活效果(表16和表17)：
                表16 75％乙醇对尿多酸肽中伪狂犬病毒的灭活效果组别    孵育时间    (min)                 Lg TCID₅₀样品1(021101)样品2(021102)样品3(021103)处理组    5    ＜-0.5    ＜-0.5    ＜-0.5处理组    15    ＜-0.5    ＜-0.5    ＜-0.5处理组    30    ＜-0.5    ＜-0.5    ＜-0.5处理组    60    ＜-0.5    ＜-0.5    ＜-0.5处理组    120    ＜-0.5    ＜-0.5    ＜-0.5处理组    240    ＜-0.5    ＜-0.5    ＜-0.5处理组    360    ＜-0.5    ＜-0.5    ＜-0.5样品对照    0    5.50    5.13    4.88样品对照    360    4.13    0.88    1.13终止对照    0    5.63    5.25    5.25终止对照    360    5.13    4.25    4.13
注：样品对照360min病毒滴度偏低是由于样品对照PH值调整误差所致。由此可见伪狂犬病毒对酸(低PH)比较敏感。
        表17 75％乙醇对尿多酸肽中伪狂犬病毒灭活360min后的盲传结果   样品批号盲传一代(4天) 盲传二代(8天) 盲传三代(12天)    021101    (-)    (-)    (-)    021102    (-)    (-)    (-)    021103    (-)    (-)    (-)    细胞对照    (-)    (-)    (-)
(2)75％乙醇对尿多酸肽中Sindbis病毒的灭活效果(表18和表19)：
            表18 75％乙醇对尿多酸肽中Sindbis病毒的灭活效果    组别    孵育时间    (min)                     Lg TCID₅₀样品1(021101)样品2(021102)样品3(021103)处理组5＜-0.5＜-0.5＜-0.5处理组15＜-0.5＜-0.5＜-0.5处理组30＜-0.5＜-0.5＜-0.5处理组60＜-0.5＜-0.5＜-0.5处理组120＜-0.5＜-0.5＜-0.5处理组240＜-0.5＜-0.5＜-0.5处理组360＜-0.5＜-0.5＜-0.5样品对照05.385.135.25样品对照3605.004.754.75  终止对照  0  5.63  5.00  5.13  终止对照  360  5.13  4.88  4.88
  表19 75％乙醇对尿多酸肽中Sindbis病毒灭活360min后的盲传结果    样品批号  盲传一代(4天)  盲传二代(8天)  盲传三代(12天)    021101    (-)    (-)    (-)    021102    (-)    (-)    (-)    021103    (-)    (-)    (-)    细胞对照    (-)    (-)    (-)
(3)膜过滤法除病毒效果：
                表20  膜过滤法去除脊髓灰质炎病毒的效果    样品批号    滤前Lg TCID₅₀    滤后Lg TCID₅₀    细胞盲传1代    021101    5.50    -0.13    (+)    021102    5.63    0.25    (+)    021103    5.63    0.75    (+)
注：盲传实验中细胞对照均为阴性。
5.结论
(1)尿多酸肽生产工艺中75％乙醇可灭活所试验的Sindbis和伪狂犬指示病毒。在25℃±1℃条件下，指示病毒经75％乙醇作用5min以上，伪狂犬病毒的灭活效果≥5.38-6.00LgTCID₅₀，Sindbis病毒的灭活效果≥5.63-5.88 LgTCID₅₀，将75％乙醇处理6小时的各批样品盲传三代，均未见致细胞病变作用(CPE)。终止对照实验表明，75％乙醇经10倍稀释后不再对所加入的指示病毒具有灭活作用。
(2)试验中所观察的Viresolve NFP滤膜可去除4.8-5.6 LgTCID₅₀脊髓灰质炎病毒，但细胞盲传1代后均有细胞病变(CPE)出现，说明膜过滤法虽然能去除一定量的病毒，但不能完全去除所加入的指示病毒。
另外，表20的结果也显示，新滤膜第一次使用除病毒结果较好，经过两次NaOH和HCl处理后的、滤膜再用于除病毒过滤，则除病毒的效果略有下降，但仍可达到去除4.88 LgTCID₅₀脊髓灰质炎病毒。因此建议：在生产过程中为保证除病毒效果，除病毒滤膜只能用一次，不得重复使用。
                                实施例1
将1mol/L盐酸溶液约500ml加入20kg新鲜人尿液中，调节pH为3，用1平方米板框滤器及20μm的滤布，滤除酸化尿液中大于20μm颗粒杂质；用截留分子量一万的管式膜超滤，控制压力为5Mpa，除去酸化尿中分子量大于1万的有机杂质，收集低分子滤液；然后用XAD-16作为吸附剂，用量为10公斤，先用20升乙醇浸泡吸附剂10分钟，制成吸附柱，再用去离子水洗去乙醇，再依次用15升乙醇和25升去离子水洗涤吸附柱一次，随后将低分子滤液以1L/分钟的流速加入柱中，约20分钟加完，用20L纯化水以1L/分钟的流速洗涤XAD-16吸附柱；再用10L的乙醇以1L/分钟的流速进行洗脱，使被吸附的有效成分解吸附，收集洗脱液；
然后用95％的药用乙醇调节乙醇浓度至73％，用1mol/L盐酸调pH值4.0，在25℃士2℃放置6小时，以灭活病毒；随后用2mol/L的氢氧化钠调pH值6.5，泵入搪瓷罐中，开始抽真空升温，使内胆温度不超过40℃，维持约8小时浓缩至200mg/ml；用2mol/L的氢氧化钠微调pH值7.0，用孔径为1.2μm的滤膜减压过滤除去杂质，滤过液经质量标准检查得尿多酸肽组合物。
经分析，本实施例尿多酸肽组合物，有效成分包括马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、4-羟基苯乙酸、5-羟基吲哚乙酸及一系列小分子多肽活性成分，其中小分子多肽活性成分中有26种多肽，其最大的分子量为2800D左右，最小分子量为800D左右；两个主要肽序列符号分别为：AVEGPSSALGPLGP(alavalgluglyproserseralaleuglyproleuglypro)，14个肽；LGPSTPGPPPNGGA(leuglyproserthrproglyproproproasnglyglyala)，L4个肽。
按尿液提取物为l00mg计，其中，按尿液提取物为100ml计，其中多肽的含量为600mg；马尿酸含量为300mg，苯乙酰谷氨酰含量为250mg，4-羟基苯乙酸含量为80mg，5-羟基吲哚乙酸含量为30mg。其中用ES质谱法测定四种有机酸的分子量为：马尿酸180，苯乙酸谷氨酰胺265，4-羟基苯乙酸152，5-羟基吲哚乙酸193。
                                实施例2
同实施例1，不同的是，再将尿多酸肽组合物制备成注射液；即将所得的尿多酸肽组合物用注射用水稀释至含总固体40mg/ml的溶液，用2mol/L的盐酸调pH值7.5；再用Millipore的除热源膜除热源；用孔径为0.22μm的滤膜，除菌过滤；用30nm Millipore的滤膜，除去病毒；最后用灌封机分装为100ml/瓶的尿多酸肽注射液。
                                实施例3
将1mol/L盐酸溶液约550ml加入20kg新鲜人尿液中，调节pH为2.5，用1平方米板框滤器及20μm的滤布，滤除酸化尿液中大于20μm颗粒杂质；用管式膜超滤，控制压力为8Mpa，除去酸化尿中大分子量的有机杂质，收集滤液；然后用XAD-16作为吸附剂，用量为15公斤，先用25升乙醇浸泡吸附剂15分钟，制成吸附柱，再用去离子水洗去乙醇，再依次用20升乙醇和20升去离子水洗涤吸附柱一次，随后将低分子滤液以1.5L/分钟的流速加入柱中，约20分钟加完，用20L纯化水以1.5L/分钟的流速洗涤XAD-16吸附柱；再用15L的乙醇以1L/分钟的流速进行洗脱，使被吸附的有效成分解吸附，收集洗脱液；
然后用95％的药用乙醇调节乙醇浓度至75％，用1mol/L盐酸调pH值4.5，在25℃士2℃放置8小时，以灭活病毒；随后用2mol/L的盐酸调pH值6.0，泵入搪瓷罐中，开始抽真空升温，使内胆温度不超过40℃，维持约10小时浓缩至250mg/ml；用2mol/L的氢氧化钠微调pH值6.5，用孔径为1.2μm的滤膜减压过滤除去杂质，滤过液经质量标准检查得尿多酸肽组合物。
经分析，本实施例尿多酸肽组合物，有效成分包括马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、4-羟基苯乙酸、5-羟基吲哚乙酸及一系列小分子多肽活性成分，其中小分子多肽活性成分中有30种多肽，其最大的分子量为4000D左右，最小分子量为400D左右；
按尿液提取物为100mg计，其中，按尿液提取物为100ml计，其中多肽的含量为800mg；马尿酸含量为200mg，苯乙酰谷氨酰含量为400mg，4-羟基苯乙酸含量为50mg，5-羟基吲哚乙酸含量为5mg。
                                实施例4
同实施例3，不同的是，再将尿多酸肽组合物制备成冻干粉针剂，将所得的尿多酸肽组合物用注射用水稀释至含总固体30mg/ml的溶液，用3mol/L的盐酸调pH值7.0；再用Millipore的除热源膜除热源；用孔径为0.22μm的滤膜，除菌过滤；用20nm Millipore的滤膜，除去病毒；最后灌装(装量2.5ml/支)，半加塞后冻干，制成尿多酸肽冻干粉针剂产品。
                                实施例5
将1mol/L盐酸溶液约500ml加入20kg新鲜人尿液中，调节pH为2，用1平方米板框滤器及20μm的滤布，滤除酸化尿液中大于20μm颗粒杂质；用截留分子量一万的管式膜超滤，控制压力为15Mpa，除去酸化尿中分子量大于1万的有机杂质，收集分子量低于10000的低分子滤液；然后用XAD-16作为吸附剂，用量为20公斤，先用20升乙醇浸泡吸附剂20分钟，制成吸附柱，再用去离子水洗去乙醇，再依次用15升乙醇和25升去离子水洗涤吸附柱一次，随后将低分子滤液以11/分钟的流速加入柱中，约20分钟加完，用20L纯化水以1L/分钟的流速洗涤XAD-16吸附柱；再用10L的乙醇以1L/分钟的流速进行洗脱，使被吸附的有效成分解吸附，收集洗脱液；
然后用95％的药用乙醇调节乙醇浓度至73％，用1mol/L盐酸调pH值5.0，在25℃士2℃放置10小时，以灭活病毒；随后用2mol/L的氢氧化钠调pH值6.3，泵入搪瓷罐中，开始抽真空升温，使内胆温度不超过40℃，维持约8小时浓缩至200mg/ml；用规格为101的滤纸，减压过滤除去杂质，用2mol/L的氢氧化钠微调pH值5.5，用孔径为1.2μm的滤膜减压过滤除去杂质，滤过液经质量标准检查得尿多酸肽组合物。
经分析，本实施例尿多酸肽组合物，有效成分包括马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、4-羟基苯乙酸、5-羟基吲哚乙酸及一系列小分子多肽活性成分，其中小分子多肽活性成分中有20种多肽，其最大的分子量为6000D左右，最小分子量为1000D左右；
按尿液提取物为100mg计，其中，按尿液提取物为100ml计，其中多肽的含量为100mg；马尿酸含量为500mg，苯乙酰谷氨酰含量为600mg，4-羟基苯乙酸含量为30mg，5-羟基吲哚乙酸含量为50mg。
                            实施例6
将30克尿多酸肽半成品和80克淀粉混匀制粒，过20目筛整粒，干燥，加2克硬脂酸镁压制成片，即得尿多酸肽组合物片剂。
以上所给出的实施例是为了进一步说明本发明的具体实施例方案，本发明的特征、优点和其它细节，不是用来限制本发明的保护范围；任何在本发明构思上所作的变化都应该在本发明的范围之中。