针对活化TH1细胞的重组免疫毒素RANTES－DT390的质粒及制备方法与应用.pdf

一种针对活化Th1细胞的新型重组免疫毒素质粒，以趋化因子Rantes为导向分子、白喉毒素的活性片段DT390为毒素分子，通过基因重组构建而成。该免疫毒素质粒的制备方法包括重组质粒的构建、重组质粒转染的工程菌的制备等步骤。该免疫毒素质粒具有严格的靶向性，可以通过Rantes的导向作用，以DT390特异性攻击活化的Th1细胞，诱导特异性免疫耐受，从而避免了无选择性地杀伤所有T细胞。特别适用于自身免疫性疾病和器官移植排斥反应的防治，亦可应用于某些肿瘤的治疗。

1、  一种针对活化Th1细胞的重组免疫毒素基因，其特征在于它具有序列表中SEQ IDNO.1所述的核苷酸序列。

2、  一种针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒，其特征在于它含有权利要求1所述的核苷酸序列。

3、  一种权利要求2所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：
(1)通过RT-PCR反应，获得Rantes基因；
(2)将上述扩增的Rantes基因片段插入到含有DT390片段的真核质粒中构建重组质粒，再将重组质粒转染至感受态细菌中进行扩增，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；
(3)利用限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析；
(4)通过蛋白合成抑制实验测定重组免疫毒素质粒的表达活性。

4、  根据权利要求3所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒的制备方法，其特征在于构建重组质粒可选用的真核质粒载体为SRα或pSecTag2。

5、  权利要求2所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒在制备治疗或预防自身免疫性疾病的药中的应用。

针对活化Th1细胞的重组免疫毒素Rantes-DT390 的质粒及制备方法与应用
                                 技术领域
本发明涉及一种特异攻击并杀伤活化的Th1细胞的新型重组免疫毒素质粒及其制备方法。
                                 背景技术
免疫毒素(Immunotoxins，ITs)是将生物毒素与导向载体(抗体或细胞因子)连接起来构成的杂合分子，又称生物导弹或导向毒素。最早的免疫毒素(即第一代免疫毒素)是载体与毒素分子的化学偶联物，这类免疫毒素免疫原性强、分子量大、渗透性差、在靶部位很难形成有效的浓度、稳定性及均一性较差，毒副作用较强、难以大规模生产，从而限制了其应用。随着现代生命科学的不断发展，近年来人们通过基因重组技术对免疫毒素进行了改进，导向载体已由以前的单克隆抗体变成了基因工程抗体和一些配体等，生物毒素的品种更加多样，在不影响其毒性作用的同时减小了其分子量大小。这种新工艺产生的新型免疫毒素稳定性强、渗透性好、具有更好的导向特异性、且制备时简单易行、可短期内大量制备，在很大程度上弥补了第一代免疫毒素稳定性差、半衰期短、免疫原性强等不足，极大地推动了免疫毒素在相关领域的深入研究。
有关免疫毒素在生物医学的应用，主要都集中于对某些恶性肿瘤及与免疫相关的人类疾病的导向治疗。在恶性肿瘤的研究中，如血液系统肿瘤(白血病、复发性淋巴瘤等)、黑色素瘤、小细胞肺癌、脑瘤等疾病，利用免疫毒素治疗已取得了很大的进展，有些已经进入临床I、II、III期试验。这些免疫毒素的作用靶点主要是选择针对T细胞表面抗原或细胞因子受体，如CD3、CD4、IL-2等，在接受这些免疫毒素的治疗后，相应的自身免疫性疾病或GvHD病情虽有减退，但毒副作用也较显著，甚至使临床治疗被迫终止。产生毒副作用的主要原因之一是由于这类免疫毒素所选择的导向分子特异性欠佳，往往导致杀伤许多其他无关细胞。自身免疫性疾病(Autoimmune Disease)是一类免疫相关的疾病，产生这类疾病的主要原因是由于各种刺激因素导致免疫系统对自身抗原发起攻击，造成自身组织损伤和功能障碍。目前地治疗措施主要是采用各种非特异的免疫抑制剂，但往往使患者免疫系统受到普遍性抑制而导致感染、肿瘤的发生及骨髓抑制等，且不能有效地防止疾病的复发。因而促使相关领域的研究者从免疫治疗的角度，寻求一种特异、安全、有效的治疗方法：如MHC阻断法、CD₄分子阻断法、TCR阻断法、细胞因子治疗、T细胞接种以及口服抗原诱导耐受等等，但这些方法或因特异性不高、疗效不稳定，或因技术难度大、难以克服的毒副作用等而不能顺利地过渡到临床(见：Waldor MK，et al.Science.1985，227：415；Chen Y，etal.Nature.1995，376：177；Weiner HL，Immunology Today.1997，18：355；HolldaySD，et al.Environmental Health Perspectives.108 Suppl 3：463-73，2000 Jun；Palmisano GL，et al.Clinical & Experimental Immunology.135(2)：259-66，2004Feb；)，因而自身免疫性疾病的治疗至今仍然是困扰临床的一大难题。
随着基础免疫学的研究进展，人们认识到识别自身抗原的自身反应性T细胞，实际上是由CD₄⁺TH1细胞所承担的，而CD₄⁺TH2仅具有一定的调节作用(见：Lib lau RS，et al.Immunol.Today；1995，16：34；Costa GL，et al.J.Immunol.2000，164：3581)。由此提示，如果能利用特异性更高的免疫毒素只将这些活化的自身反应性TH1细胞杀死，而不影响TH2细胞，则有可能弥补上述缺陷，可治疗自身免疫性疾病。
                              发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种新型的特异攻击Th1细胞的重组免疫毒素质粒，为临床治疗自身免疫性疾病提供一种新方案，为重组免疫毒素的应用开辟一条新途径。
本发明所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒含有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。此种质粒由Rantes cDNA碱基序列(来自gene bank)和白喉毒素的活性片段DT390 cDNA碱基序列(来自gene bank)连接而成。Rantes是近年发现的一种新型细胞因子，在免疫应答的过程中，活化的T细胞将表达多种受体，如细胞因子IL-2、IL-12、IL-18的受体以及多种化学趋化因子CCR-5，CXCR-3等的受体。这些T细胞的膜受体中，现已证实Rantes受体的表达仅限于活化的Th1细胞，而Th2细胞没有表达，并且这种膜受体的表达是稳定和持续的(见：Karlsson I，et al.Journal of Virology，2004Nov，78(21)：11807-15；Emingil G，et al.Journal of Clinical Periodontology.2004Oct，31(10)：829-34.)。因此，Rantes受体不仅可以作为识别Th1细胞和Th2细胞的标志，也为相关的免疫治疗提供了一个理想的靶位。本发明选用Rantes为导向分子，白喉毒素的活性片段DT390为毒素分子，构建Rantes-DT390重组免疫毒素质粒，转染入体内，表达重组免疫毒素，可特异攻击并杀伤活化的Th1细胞，诱导自身免疫耐受，从而解决了原有免疫毒素特异性欠佳、需要提纯的问题，实现有效治疗自身免疫性疾病的目的。因此，本发明所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒可在制备治疗或预防自身免疫性疾病的药中应用。
本发明所述针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒的制备方法依次包括以下步骤：
1、通过RT-PCR反应，获得Rantes基因；
2、将上述扩增的Rantes基因片段插入到含有DT390片段的真核质粒中，即构建成重组质粒。再转染至感受态细菌中进行扩增，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；
3、限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析，以保证重组质粒中Rantes插入片段的正确性；
4、通过蛋白合成抑制实验测定重组免疫毒素质粒的表达活性。
上述制备方法中，构建重组质粒可选用的真核质粒载体为SRα或pSecTag2。
本发明所述的新型免疫毒素质粒及其制备方法具有以下有益效果：
1.选择新型细胞因子Rantes为导向分子，由于Rantes受体只表达在活化的Th1细胞表面，Th2细胞表面没有表达，因而由Rantes导向的重组免疫毒素只针对Th1细胞，从而使导向攻击更特异、更有效，减少临床应用的毒副作用。
2.毒素分子选用的是白喉毒素的活性片段DT390，是细菌毒素的跨膜结构域和酶性结构域，去除了DT分子的细胞结合区，可进一步减少非特异性结合和降低不良反应。
3.通过质粒转染活体肌肉细胞的方法，将免疫毒素Rantes-DT390的质粒直接导入动物肌肉，使免疫毒素Rantes-DT390在骨骼肌内高效表达而起到治疗作用。
4.免疫毒素质粒是通过DNA重组技术来获得的，它可直接转染细胞而表达重组免疫毒素，勿需进一步提纯免疫毒素蛋白质。同时避免了原来化学偶联免疫毒素复杂的制备工艺和难以标化的缺点，使其更易产业化。
5.免疫毒素Rantes-DT390亦可用于移植排斥反应及某些肿瘤的防治。
                           附图说明
图1是本发明所述针对活化Th1细胞的重组免疫毒素Rantes-DT390质粒的一种示意图，真核质粒载体为SRα；
图2是本发明所述重组免疫毒素Rantes-DT390对活化T细胞的蛋白合成抑制试验结果图；
图3是本发明所述重组免疫毒素Rantes-DT390治疗组与对照组的临床评分图；
图4是流式细胞仪测定本发明所述重组免疫毒素Rantes-DT390对活化T、Th1、Th2和B细胞的细胞毒实验结果图。
图中，1-1-DT390、1-2-Rantes、1-3-SRα真核质粒、3-1-未治疗组、3-2-治疗组。
                             具体实施方式
实施例1：重组免疫毒素真核质粒的制备
载体选用含有DT390的SRα真核质粒(由美国Wisconsin大学PhD.Hu Huaizhong提供，invitrogen公司)，具体步骤如下：
1、小鼠Rantes基因的预处理(以下试剂均购于promega公司)
(1)用Trizol试剂按以下步骤提取小鼠肝总RNA
1)小鼠肝组织100mg。
2)加1mlTrizol。
3)匀浆。
匀浆要彻底，后转至EP管，组织匀浆量＞100mg时分装，1ml/每EP管。
4)颠倒混匀10下，室温5分钟。
5)加氯仿1/5体积(0.2ml，必须按总体积的1/5)。
6)颠倒混匀10下，室温5分钟。
7)离心12000g，4℃，15分钟。
8)转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中。
9)加等体积异丙醇(约400μl)，混匀室温10分钟。
10)离心12000g，4℃，10分钟。
11)弃上清。
12)加冰预冷的75％乙醇(用DEPC水配)1ml。
13)离心7500g，4℃，5分钟。
14)弃上清，空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)。
15)溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)(可在55-60℃水中，＜10分钟，助溶)。
(2)逆转录反应依次按以下步骤进行：
1)按下表配备试剂(稀释10倍后用)。
试剂          浓度(μg/μl)    体积(μl)
RNA                            11.5
Oligo(dT)₁₅    0.05            2
2)混匀，离心，70℃，5min。
3)立即冰水浴，稍离心。
4)按下表配备试剂
试剂              浓度       体积(μl)    终浓度
M-MLV Buffer      5×                    4            1×
dNTP              10mM        1            0.5mM
RNasin            40U/μl     0.5          20U
M-MLV             200U/μl    1            200U
ddH₂O                        13.5
5)混匀，离心，42℃，60min。
6)95℃，10min(破坏MLV)。
7)4℃保存
(3)cDNA的PCR反应
反应体系：
试剂                 浓度                 体积(μl)
Taq Buffer           10×                                    2
MgCl₂               25mM                 1.2
dNTP                 10mM                 0.2
上游引物             12.5pmol/μl         0.5
下游引物             12.5pmol/μl         0.5
cDNA模板                                  2
ddH₂O                                   13.3
Taq酶                2.5U/μl             0.3
PCR扩增的引物：
上游：5′-CAT GCC ATG GGC CTC ACC ATA TGG CTC GGA C-3′
下游：5′-CCG GAA TTC CTA GCT CAT CTC CAA ATA GTT-3′
PCR反应条件：
94℃预变性3min，94℃变性35sec、58℃复性30sec、72℃延伸55sec，34个循环后72℃延伸10min。
(4)扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析
2、重组免疫毒素SRα真核表达质粒的预处理
(1)用限制性内切Nco I及EcoRI双酶切SRα真核质粒，反应体积20μl(其中含有NcoI酶1μl、EcoRI酶1μl、10×NEbuffer₂ 2μl、SRα真核质粒10μl、ddH₂O6μl)，37℃过夜(内切酶均购自New England公司)；
(2)反应后用1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯照射下，按胶回收试剂盒(购自Omiga公司)的方法回收大片段。
3、Rantes与SRα真核表达质粒的连接及转化
(1)将上述步骤中所获得的载体片段及插入片段粗略定量后，按插入片段：载体分子摩尔数比＝3～10∶1的连接反应原则进行连接实验；
(2)反应体系如下表，整个反应过程在PCR仪中16℃过夜。连接反应时应分别设立无插入片段和无载体的对照管。使上述扩增的Rantes基因片段插入到含有DT390片段的SRα真核质粒中，Rantes基因片段与DT390片段通过Nco I酶切位点连接，与SRα真核质粒通过EcoR I酶切位点连接，连接酶为T4DNA，所构建成的重组质粒见图1。
试剂                        体积(μl)
ddH2O                       11
10×buffer                  2
Rantes                      2
SRα                                                  4
T4DNA ligase                1
Total Volume                20
(3)将连接产物分别转化大肠杆菌JM109的感受态细胞。连接产物的转化方法按《分子克隆操作指南》进行，主要步骤如下：
A、取连接产物4μl加入感受态细胞30μl置于1.5ml Ep管中，阴性对照为感受态细胞30μl置于1.5ml Ep管中；
B、置于冰上30min，每隔几分钟轻弹；
C、42℃水浴30Sec；
D、冰上放置3min；
E、加0.3ml SOC培养基(10ml SOC+50μl 2mol/L Mgcl₂)，置于冰上；
F、37℃，250rpm振摇1小时；
G、取50μl转化细胞+5μl 0.1g/ml Amp，均匀涂布于含Amp的平板，置37℃孵箱培养过夜。
4、限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析，以保证重组质粒中Rantes插入片段的正确性。测序结果表明，重组质粒中含有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
5、重组免疫毒素(Rantes-DT390)真核质粒在NIH3T3细胞中的表达
(1)在转染前24h，将NIH3T3细胞(购自invitrogen公司)接种于六孔培养板中，每孔细胞约1×10⁶，置于37℃5％CO₂孵箱培养；
(2)待细胞长满至约80-90％融合后，分别以SRα空质粒及Rantes-DT390 SRα质粒转染真核细胞NIH-3T3，具体操作按Qiagen公司脂质体转染试剂盒中的说明书进行；
(3)质粒转染后72h，收集细胞。将变性后的蛋白质marker和转染后细胞裂解上清液在5％的浓缩胶和10％的分离胶中进行SDS-PAGE电泳；
(4)电泳完备后，将凝胶上的蛋白质电转移到硝酸纤维素滤膜上，电转移后的膜用封闭液(约10％的PBS脱脂奶粉)封闭处理2h，再加入Rantes多克隆抗体应用液作用1h，充分洗涤后再加入酶标二抗兔抗羊IgG，作用1h。最后加底物显色。
实施例2：体外重组免疫毒素Rantes-DT390的生物活性测定
1、蛋白合成抑制试验
(1)在无菌操作台上取小鼠脾脏，获得脾细胞悬液，接种于细胞培养瓶(约10×10⁶个细胞/ml)，加入conA(10ug/ml)混合培养；
(2)培养3天后，收获细胞，计数并调整细胞浓度为1×10⁶个细胞/ml；
(3)转入96孔细胞培养板(培养液为不含亮氨酸的DMEM培养基)，分别将上述转染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/20、1/50稀释的浓度加入，50μl/孔，各浓度设立三复孔；
(4)继续培养24h，加入3H亮氨酸10μl(5μci/ml)，2h后收集细胞，液闪测定并计算蛋白合成抑制率(有关结果如图2所示)。由此表明，重组免疫毒素Rantes-DT390对活化T细胞具有较强的细胞抑制效应。
2、流式细胞仪测定其细胞毒性
(1)在无菌操作台上取小鼠脾脏，用RPMI1640培养基制成脾细胞悬液，与conA(10ug/ml)混合培养；
(2)培养3天后，加入上述转染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/20、1/50稀释的浓度，50μl/孔，各浓度设立三复孔；
(3)继续培养24h，收集细胞，流式细胞仪测定免疫毒素Rantes-DT390分别对活化T、Th1、Th2细胞和B细胞的细胞毒性(CD4⁺：T细胞膜表面标记；IFN-γ：Th1细胞内标记；IL-4：Th2细胞内标记；CD19⁺：B细胞膜表面标记)；
(4)流式细胞仪测定结果显示，T细胞及Th1细胞数目下降40％-60％，而对Th2及B细胞无此影响(如图4所示)。由此表明重组免疫毒素Rantes-DT390具有良好的靶向特异性。
实施例3：重组免疫毒素Rantes-DT390真核质粒对自身免疫性疾病动物模型EAE(experimental allergic encephalomyelitis)的初步治疗效果
1、EAE(Experimental Allergic Encephalomyelitis)动物模型的建立：根据常规方法用C57BL/6小鼠建立EAE模型。
(1)用C57BL/6小鼠建立EAE动物模型，将自提的MBP粗提液与FCA(内含结核分枝杆菌5mg/ml)等体积混和，使用3ml注射器反复推拉成为油包水的乳剂，采用腹腔注射的方法。
(2)免疫剂量：每只小鼠注射MBP∶FCA(1∶1)混和液0.4ml，百日咳杆菌菌液∶PBS(1∶50)混和液0.2ml(内含百日咳杆菌0.6-1.8×106个)。
(3)对照组每只小鼠腹腔注射百日咳杆菌菌液与PBS混和液0.2ml(内含百日咳杆菌0.6-1.8×106个)。
(4)免疫时间：第1天、第7天免疫两次。
2.重组质粒对EAE模型的初步治疗
(1)用Rantes-DT390重组质粒对EAE动物模型进行治疗试验
治疗时间：在MBP免疫小鼠后第1天、第3天分别治疗2次；
治疗方法：使用阳离子脂质体包被的Rantes-DT390重组质粒，采用试验小鼠大腿肌肉注射的方式；
治疗剂量：50μg/只。
(2)观察治疗后治疗组及未治疗组的症状表现，根据临床评分标准进行打分(Kono分级法)，具体为：0分：没有任何临床症状；1分：动物尾部无力；2分：动物尾部无力+前肢或后肢中等无力；3分：前肢或后肢严重无力，人为翻身后不能恢复；4分：肢体麻痹，人为翻身后不能恢复；5分：濒死状态(有关结果如图3所示)。
                         SEQUENCE LISTING
<110>四川大学
<120>针对活化Th1细胞的重组免疫毒素Rantes-DT390的质粒及制备方法与应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1386
<212>DNA
<213>小鼠
<400>1
ggcgctgatg atgttgttga ttcttctaaa tcttttgtga tggaaaactt tgctagctac    60
cacgggacta aacctggtta tgtagattcc attcaaaaag gtatacaaaa gccaaaatct    120
ggtacacaag gaaattatga cgatgattgg aaagggtttt atagtaccga caataaatac    180
gacgctgcgg gatactctgt agataatgaa aacccgctct ctggaaaagc tggaggcgtg    240
gtcaaagtga cgtatccagg actgacgaag gttctcgcac taaaagtgga taatgccgaa    300
actattaaga aagagttagg tttaagtctc actgaaccgt tgatggagca agtcggaacg    360
gaagagttta tcaaaaggtt cggtgatggt gcttcgcgtg tagtgctcag ccttcccttc    420
gctgagggga gttctagcgt tgaatatatt aataactggg aacaggcgaa agcgttaagc    480
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agctag                                                               1386