微拟球藻同质型乙酰辅酶羧化酶1的编码基因及其应用.pdf

本发明涉及一种从微拟球藻转录组数据库中分离的编码同质型乙酰辅酶A羧化酶的核苷酸序列。它是具有SEQ ID：1所示的核苷酸序列且具有编码SEQ ID：2所示的氨基酸序列。本发明包括编码乙酰辅酶A羧化酶的核苷酸序列与表达载体连接而成的进行真核表达的重组表达载体以及含有本发明重组表达载体的酵母细胞及其后代细胞。用上述的核苷酸序列直接或与不同表达载体连接，转入到酵母、油料作物或植物中，环境胁迫条件下，研究微拟球藻中乙酰辅酶A羧化酶基因的表达。

权利要求书1.  一种来着海洋绿藻微拟球藻的从头脂肪酸合成途径的关键酶ACC1的核苷酸序列，其特征在于：SEQ ID：1所示的核苷酸序列，该基因全长7101bp，编码一条由2367个氨基酸组成的蛋白，该蛋白由生物素羧化酶(Biotin carboxylase，BC)、生物素羧基载体蛋白(Biotin carboxyl carrier protein，BCCP)以及生物素羧基载体蛋白(Carboxyltransferase，CT)三个功能域组成。2.  一种氨基酸序列，其特征在于它是SEQ ID：1所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。3.  一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒所构建的重组表达载体。4.  按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于它是pAUR123-NgACC1。5.  一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于它是选自于下列一种宿主细胞：(a)它是用权利要求1所述的核苷酸序列转化的宿主细胞及其后代细胞，(b)它是权利要求4所述的重组表达载体转化的宿主细胞及其后代细胞。6.  权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2所述的氨基酸序列应用于高油脂微藻及油料作物的改造。

说明书微拟球藻同质型乙酰辅酶羧化酶1的编码基因及其应用
一、技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种从微拟球藻中克隆参与脂肪酸合成代谢的关键酶乙酰辅酶A羧化酶1(NgACC1)基因及其应用。
二、背景技术：
乙酰辅酶羧化酶是一类以生物素为辅基，以HCO3-为羧基供体的羧化酶，在ATP供能、Mg2+存在下，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰单酰辅酶A。丙二酸单酰辅酶A即是从头合成脂肪酸途径中的C2单位的供体，又在脂肪酸的氧化中作为线粒体穿梭系统的调节因子。ACC主要分为异质型和同质型两大类，异质型ACC又称多亚基型，存在于细菌、双子叶植物和非禾本科单子叶植物中(Cronan JE Jr，Waldrop GL.Multi-subunit acetyl-CoA carboxylases.Prog Lipid Res，2002，41(5)：407-435)，由4个亚基组成，即生物素羧化酶(Biotin carboxylase，BC)、生物素羧基载体蛋白(Biotin carboxyl carrier protein，BCCP)以及生物素羧基载体蛋白(Carboxyltransferase，CT)的2个亚基α-CT和β-CT异质型：同质型即多功能型，其BC、BCCP、CT功能域依次存在于一条多肽链上。动物、酵母、藻类及高等植物中含有此类(Choi-Rhee E，Cronan JE.The biotin carboxy lase-biotin carboxyl carrier protein complex of Escherichia coli acetyl-CoA carboxylase.Journal of Biological Chemistry.2003，278(33)：30806-30812)。此外，同质型ACC又可分为两个亚型：ACC1和ACC2，其中ACC1催化合成的丙二酰单酰辅酶A用于胞质溶胶中脂肪酸的合成。
在大多数植物中，ACC属于多亚基型，其四个亚基α-CT、BCCP、BC和β-CT分别由accA、B、C和D基因编码，除accD基因存在于叶绿体体中外，其他编码基因位于细胞核中。各个亚基在催化作用中具有不同的功能，BCCP蛋白是连接ACC另外3个亚基的纽带和桥梁，在植物种子脂肪酸的合成过程中起着十分重要的作用。研究表明在拟南芥、油菜以及蓖麻的种子发育过程中过量表达BCCP基因，可以提高ACC的活性以及种子中油脂含量(Roesler RK，Savage LJ，Shintani DK，etal.Co-purification，co-immunoprecipitation，and coordinate expression of acetyl-coenzymeAcarboxylase activity.biotin carboxylase，and biotin carboxyl carrier protein of higher plants.Planta 1996，198：517-525；Benning F，Winkledl C.A novel mutant of Arabidopsis with a deficiency in the seed-specific regulation of carbohydrate metabolism[J].Plant Physiology，1998.118：91-101)。β-CT亚基是ACCase活性的限制因子，质体中超量表达accD基因会提高ACCase的酶活水平，从而提高脂肪酸的合成。该基因在烟草和马铃薯中得到了研究。此外，非禾本科植物质体中的ACC为异质型，相反禾本科植物质体中ACC为同质型，针对这一点可以设计杂草敏感而对其它作物无影响的特异性除草剂(Turner JA，Pernich DJ.Origin of enantiomeric selectivity in the aryloxyphenoxypropionic acid class of herbicidal acetyl coenzyme A carboxylase(ACCase)inhibitors Agriculture Food Chemistry，2002，50(16)：4554-4566)。动物中的ACC属于多功能型，人类的ACC的两个亚型已成功进行了克隆表达，研究表明，ACC的表达可能与前列腺癌的发生有关；ACC2活性的降低或缺失，有可能抵抗摄 食过多引起的肥胖，可作为防治肥胖症的新靶点(Essop MF，Camp HS，Choi CS，et al.Reduced heart size and increased myocardial fuel substrate oxidation in ACC2 mutant mice.American Journal of Physiology：Heart and Circulatory Physiology，2008，295(1)：H256-65)。微藻的ACC属于同质型，目前仅在硅藻和蓝藻究中进行了研究(Roessler PG，Ohlrogge JB.Cloning and characterization of the gene that encodes acetyl-coenzyme A carboxylase in the alga cyclotella cryptica.Journal Biology Chemistry，1993，268(26)：19254-19259；宋东辉，侯李君，施定基 生物柴油原料资源高油脂微藻的开发利用，2008，24(3)：341-348)。
由于世界能源危机和环境问题的日益严重，开发绿色、清洁的生物燃料代替传统石化燃料，已成为国际研究热点。在生物燃料的众多原料中，微藻具有光合作用效率高、含油量高、生长周期短、油脂面积产率高等特点，被认为是最有潜力替代石油的生物质资源。如何进一步提高微藻的产量和油脂含量以成为人们关注的问题。微藻生长条件的优化和光生物反应器的推广使微藻产量上了一个新台阶，脂肪酸代谢机理的研究为进一步提高油脂含量提供改造方法。参与脂肪酸代谢的关键酶对脂肪酸的积累起着不可替代的作用。我们对参与脂肪酸从头合成代谢途径的第一步反应的作用酶也是关键酶的ACC1进行了研究。从前期实验室构建的微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)转录组文库筛选出了与脂肪酸合成密切相关的ACC1基因，克隆表达并对其环境胁迫下基因表达变化等进行了研究。填补了ACC在微藻中研究的空缺，并对利用基因工程改造获取高油脂产量微藻及油料作物的研究奠定了良好的基础。
三、发明内容：
本发明的一个目的是提供一种来自微拟球藻脂肪酸合成代谢密切相关的同质型蛋白酶基因NgACC1，补充现有同质型ACC研究的不足，同时为构建高产油微藻藻株提供基因资源；本发明的又一目的是构建真核表达载体pAUR123-NgACC1，在转基因酵母中获得高效表达，完善了同质型ACC1的真核表达系统；本发明的再一目的是提供逆境条件下的研究对象，为研究不同胁迫环境中该基因的表达以及对油脂积累的潜在影响提供基础。
本发明是通过以下方案实现的：
本发明所述的从微拟球藻中克隆NgACC1基因，其核苷酸序列为SEQ ID：1；氨基酸序列为SEQ ID：2。
本发明从微拟球藻中克隆NgACC1基因的过程如下：
根据本实验室前期构建的微拟球藻转录组数据库中基因注释及NCBI比对结果获得编码NgACC1基因序列信息，设计8对引物(其序列为SEQ ID：3-10)，采用重叠延伸PCR技术分段扩增后，经连续拼接获得大小为7101bp的目的片段。
上述基因真核表达载体pAUR123-NgACC1的构建通过以下过程实现：
将上述获得的PCR产物纯化后用SmaI和HpaI限制性酶进行双酶切，表达载体pAUR123也进行同样的处理。胶回收目的片段和表达载体大片段，利用T4连接酶进行连接后转化大肠杆菌后，经PCR、酶切和测序鉴定后获得重组pAUR123-NgACC1。
上述基因的环境胁迫性研究：
不同的生长环境对微藻细胞脂质含量的积累有不同的影响，其中温度和氮源是影响微藻脂肪酸代谢的关键因素。本发明中微拟球藻来着国家海洋局第一海洋研究所生态中心藻种库，经培养条件为：温度25℃，光照强度200μmol·m-2·s光照周期14:10(光照:黑暗)的光照培养箱培养至对数期后，进行以下操作：实验一，改变温度，其他条件不变，将培养至对数期的微拟球藻分别置于15℃(低温)、25℃(最佳)和35℃(高温)下培养；实验二，改变氮源含量，其他条件不变，将培养至对数期的微拟球藻收集后分别置于无硝酸盐(缺氮)、75mg·L-1硝酸盐(最佳)和150mg·L-1硝酸盐(富氮)条件下培养，两组实验分别经12h、24h、36h、48h、72h和96h后取样，RT-PCR检测NgACC1表达情况。实验结果表明：不同胁迫下，该基因的表达量和最佳表达时间都不同。本发明首次研究了微藻中ACC1在不同条件下的表达情况，为高产油脂微藻的改造提供一定的基础。
四、附图简要说明：
图1：微拟球藻测序cDNA文库构建的基本过程。
图2a：两基因分段用重叠延伸PCR进行拼接的示意图。
图2b：利用重叠延伸PCR获得ACC1基因整个过程的示意图。
图3：NgACC1蛋白中的三个主要的功能结构域。
图4：构建的酿酒酵母重组表达质粒pAUR-NgACC1图谱。
五、具体实施方式：
本发明涉及到的大肠杆菌感受态DH5α及其克隆载体pEASY-Blunt Zero购自北京全式金公司；酿酒酵母菌株购自Invitrogen公司；真核表达载体pAUR123以及分子操作中的工具酶如连接酶和限制性内切酶均为Takara公司生产；其他试剂及配制培养基的各种试剂均为国产分析纯。具体操作参照J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔编纂的《分子克隆实验指南》或按照制造厂商所建议的条件运行。
实施例1：微拟球藻同质型NgACC1基因全长的获取
本发明基于第二代高通量测序技术Illumina Hiseq 2000.进行转录组测序、拼接与注释，并结合重叠延伸PCR技术将具有NgACC1保守区的基因自起始密码子至终止密码子进行捕获。
1.1 微拟球藻cDNA文库的构建及其测序分析
1.1.1 微拟球藻总RNA的提取
(1)向10mL F/2液体培养基中接入1mL微拟球藻藻种，在25℃，光照强度200μmol·m-2·s，光暗比为14h/10h的条件下培养至指数生长后期；
(2)取2ml藻液离心收集，在液氮中研磨并迅速转移至RNase-Free离心管中；
(3)加入1ml TRlzon试剂，反复吹打，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离；
(4)向以上溶液中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2-3min；
(5)4℃，12000rpm离心15min，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要位于水相，把水相转移到一个新的RNase-Free离心管中；
(6)向水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清；
(7)加入1ml75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心3min，小心吸弃上清；
(8)室温放置3-5min，晾干。加入30-50μL的无RNAase的蒸馏水，充分溶解RNA。
1.1.2 微拟球藻测序cDNA文库的构建
RNA-Seq测序所需cDNA文库的构建，参照美国Illumina生物技术公司RNA-Seq样品制备试剂盒(mRNA-Seq Sample Preparation Kit)的操作说明进行，基本程序见附图1。
1.1.3 微拟球藻转录组的测序分析
转录组文库的测序，由深圳华大基因研究院提供测序服务，测序平台为3G Illumina/Hiseq2000，获得原始数据经Trinity软件拼接组装获得洁净的Unigenes。所得Unigenes经BLASTX平台进行基因的功能注释。
1.2 脂肪酸合成代谢中的关键酶NgACC1编码基因全长的克隆
根据反馈回的基因功能注释，在转录组文库中，找到具有典型NgACC1保守区域的基因序列信息，预测该蛋白基因全长7101bp。采用重叠PCR技术对潜在的编码NgACC1的ORF序列其进行克隆，具体步骤如下：
总RNA的提取和cDNA合成：总RNA的提取如上所述；参照Takara公司生产的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书，以总RNA为模板进行第一条链cDNA的合成。
NgACC1基因全长克隆：①PCR扩增及测序：根据预测NgACC1基因片段的序列设计8对特异性引物(基因序列为SEQ ID：3-10，其中SEQ ID：3的F+29带有SmaI的酶切位点，SEQ ID：10的R-7293上带有HpaI的酶切位点)分段扩增NgACC1基因。PCR引物见表1
表1 重叠延伸PCR分段扩增引物

PCR反应体系(25μL)：PrimeSTARHS Premix(Takara)12.5μL，上下游10mM，cDNA 2μL，双蒸水补至25μL。扩增程序(Touch down)为94℃5min；94℃15s，64℃25s(每循环降低0.5℃)，68℃1.5min，进行10个循环；94℃15s，58℃25s，68℃1.5s，进行25个循环，68℃最后延伸2min。取5μLPCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。纯化后的PCR产物与克隆载体pEASY-Blunt Zero在T4连接酶的作用下重组后转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送上海生工测序。②重叠延伸PCR：先将克隆到的8个片段先两两拼接，得到4个片段，再将这四个片段两两拼接，形成2个大片段，最后将这2个片段拼接成一个完整的基因。每次将两个片段进行拼接时，需要进行两轮PCR。使用与上述反应相同的PCR扩增体系，两轮扩增程序为94℃5min；94℃15s，60℃20s，68℃1～2min(PCR产物的长度每增加1kb，延伸时间相应增加1min)，进行15～20个循环；68℃最后延伸2min。两轮反应使用的模板和引物不同。具体以片段1和2的拼接为例：先在两个反应体系中分别进行第一轮反应，以带有目的片段的质粒作为模板，片段1的5′端引物使用载体上的M13F，3′端使用基因内部引物；而片段2正好相反，5′端引物使用基因内部引物，3′端使用载体上M13R，获得的两个扩增产物之间有一段150bp左右的序列完全相同的重叠区域。第二轮反应则以上一轮PCR产物的混合物作为模板，在反应体系中加入上述产物各0.5μL，以片段1的5′端和片段2的3′端引物扩增20个循环，电泳验证扩增条带大小并通过测序技术检测扩增序列的正确性。基因分段扩增和重叠延伸PCR的示意图可见附图2。将拼接完整序列所编码的氨基酸序列进行功能预测，发现该编码产物包含AccC，AccB和Carboxyltransferase(CT)三个功能域，预测结果见附图3。进一步证实本发明克隆到了ACC1基因的完整cDNA序列。
实施例2 NgACC1酿酒酵母表达载体pAUR123-NgACC1的构建：
用SmaI和HpaI双酶切实例1获得NgACC1扩增产物及表达载体pAUR123，用T4DNA连接酶16℃过夜链接获得重组质粒，链接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，通过质粒提取和PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定。质粒构建结果见附图4。所构建的含有乙酰辅酶A羧化酶基因的酵母表达质粒命名为pAUR123-NgACC1。该质粒是由pAUR123(Takara公司)和利用重叠延伸PCR所获得的产物构建而成。
实施例3 NgACC1电转化酿酒酵母及酶切鉴定
3.1 酿酒酵母感受态制备：
①、挑取酵母单菌落(不超过4天)接种至10mLYPD液体培养基中30℃、200r/min，培养过夜；
②、将培养过夜的菌液按1∶10接入新鲜的100mL YPD培养基中，培养至OD600约1.3-1.5；
③、离心收集菌体，将培养至OD600为1.3-1.5的菌液冰上放置30min，4℃、1500g离心5min，弃上清液；
④、用等体积预冷无菌双蒸水重悬菌块，4℃、1500g离心5min，弃上清液；
⑤、用预冷的无菌双蒸水50mL再次重悬，4℃、1500g离心5min，弃上清液；
⑥、用10mL1M冰浴的无菌山梨醇重悬，4℃、1500g离心5min，弃上清液；
⑦、重复步骤6一次；
⑧、加1mL1M山梨醇重悬，即为酵母感受态细胞。
3.2 酵母电转化：
①、取1-5μg(约10μL)重组质粒pAUR123-NgACC1加入到80μL酿酒酵母感受态细胞中，冰浴5min；
②、加入预冷的2mm电转化杯中，电转化条件是：1500V，5ms；
③、转化后立即向电转杯加入1mL预冷山梨醇，并立即转移到灭菌离心管中；
④、取100μL菌液涂布于含有0.5μmol/L短梗霉素A(AbA)的YPD抗性培养基上，30℃倒置培养至有转化子出现。
3.3 PCR鉴定阳性重组子
从抗性平板上挑取酵母单菌落，扩大培养提取质粒，与空质粒一起跑电泳用于鉴定阳性重组转化子。用SmaI和HpaI双酶切提取的重组质粒并进行电泳检测，进一步鉴定阳性重组酵母。
实施例4 NgACC1基因的异源表达及检测
将阳性酵母单菌落接种于含有0.5μmol/L短梗霉素A(AbA)的YPD培养基中，30℃摇床培养；培养3d后，1500g离心5min收集酵母细胞用于NgACC1的表达检测；
RNA水平上检测上的检测：①将收集的酵母细胞进行总RNA的提取并反转录合成第一链cDNA，具体参照实例1中的相关步骤；②根据NgACC1的保守序列设计特异性荧光定量引物(F：5′ TGCCTCCGATGAACCACTG 3′；R：5′GAATGTCGCCTCGGATGG 3′)，以反转录产物为模板，β-action基因作为参照基因。采用Takara公司生产的SYBRPremix DimerEraserTM(Perfect Real Time)试剂盒进行定量测定，扩增体系(50μL)如下：2×SYBRPremix DimerEraser 25μL，上下游引物0.3μM，50×ROX Reference Dye ll 1μL，cDNA 5μL，dH2O 16μL。反应程序采用3步法：第一步，预变性：95℃30s；第二步，PCR反应：95℃5s，55℃30s，72℃34s40个循环；第三步，溶解曲线的建立，参照AB17500荧光定量PCR仪设置的参数进行。获得的数据采用2-ΔΔCt方法计算相对表达量，结果表明NgACC1在酵母中获得成功表达。
蛋白水平上检测上的检测：用Yeast Protein Extraction Reagent试剂盒(Takara公司)破碎酵母细胞并提取酵母总蛋白，利用十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)银染法检测到外源基因在酵母中成功表达。
实施例6 环境胁迫下ACC1基因表达情况RT-qPCR检测
温度和盐度是影响微藻脂类积累的重要因素，研究表明当培养温度从20℃升高到25℃时，眼点拟微绿球藻的脂类含量约提高了2倍，对于小球藻，培养温度由25℃变为30℃反而使其脂类含量降低了2倍多。而缺氮情况下，两类海洋绿藻细胞内油脂含量都获得了提高(Converti A，Casazza AA，Ortiz EY，etal.Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production，Chemical Engineering and Processing，2009 48：1146-1151；Mujtaba G，Choi W，Lee CG，etal.Lipid production by Chlorella vulgaris after a shift from nutrient-rich to nitrogen starvation conditions，Bioresource Technology，2012 123：279-283)。本发明对另一株海洋绿藻-微拟球藻在不同温度和氮源含量下，对脂肪酸合成关键酶ACC1的表达情况进行了研究，为不同环境中脂类代谢的调控机理的研究奠定基础。
温度胁迫实验：从F/2固体海水培养基中挑取微拟球藻单克隆，接种至10mL液体F/2液体培养基中，培养条件为：温度25℃，光照强度200μmol·m-2·s光照周期14:10(光照:黑暗)，培养5d后转接入100mLF/2培养基中扩大培养2d，再转入5L F/2液体培养基中，培养至对数中期后进行温度胁迫试验。将5L藻液在无菌条件下分装到100mL无菌的锥形瓶中并分别置于15℃(低温)、25℃(正常)和35℃(高温)的光照培养箱中培养，每组三个平行，其他条件一致。分别经12h、24h、36h、48h、72h和96h后取样，RT-PCR检测NgACC1表达情况。实验结果表明：不同温度处理ACC1基因的表达量随时间的变化不同，正常温度处理组中ACC1的最高表达量出现在12h，而胁迫处理组中都在36h时出现最高表达且高温胁迫下的表达量稍高于低温胁迫下的表达量，我们并发现两组胁迫条件下的最高表达量约是正常条件下最高表达量的8倍。
氮胁迫实验：前期实验同上述温度胁迫实验，当培养至对数中期时1500g，10min离心收集藻体，以硝酸盐作为氮源，将收集的藻体转接到无硝酸盐(缺氮)、75mg·L-1硝酸盐(最佳)和150mg·L-1硝酸盐 (富氮)含量的F/2海水培养基上培养，每个浓度设三个平行样，同样在培养12h、24h、36h、48h、72h和96h后取样，RT-PCR检测NgACC1表达情况。实验结果表明：该基因在不同氮含量的培养条件中，处理12h时表达量都达到了最大值且富氮条件下的表达量约为最佳氮含量培养下的2倍。而缺氮对该海洋绿藻中ACC1的表达量影响不大。