一种提高果酒储存稳定性的方法.pdf

本发明公开了一种提高果酒储存稳定性的方法，向果酒中加入明胶和单宁进行澄清处理后，加入乳酸菌胞外多糖，混匀静置3～5天后过滤。所述的乳酸菌胞外多糖由植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)CGMCC No.10178发酵制备得到。本发明与现有技术相比，本发明方法安全无害，简单高效，能显著提高果酒储存稳定性，为果酒加工业生产提供可靠的菌种资源，为果酒加工业的健康发展提供技术支持。

权利要求书1.  一种提高果酒储存稳定性的方法，其特征在于，向果酒中加入明胶和单宁进行 澄清处理后，加入乳酸菌胞外多糖，混匀静置3～5天后过滤。 2.  根据权利要求1所述的提高果酒储存稳定性的方法，其特征在于，明胶和单宁 的质量比为3～4：1。 3.  根据权利要求1所述的提高果酒储存稳定性的方法，其特征在于，向果酒中先 加入单宁，混匀后再加入明胶；其中，每1L果酒中，单宁添加量为0.1～0.3g,明胶的添 加量为0.30～1.20g。 4.  根据权利要求1所述的提高果酒储存稳定性的方法，其特征在于，所述的乳酸 菌为植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏日期为2014年12月15，保藏号为CGMCC No.10178。 5.  根据权利要求1或4所述的提高果酒储存稳定性的方法，其特征在于，所述的 乳酸菌胞外多糖由植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)CGMCC No.10178发酵制备得 到。 6.  根据权利要求5所述的提高果酒储存稳定性的方法，其特征在于，所述的乳酸 菌胞外多糖按如下提取步骤制备得到： (1)将植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)CGMCC No.10178单菌落接种于含有 MRS液体培养基的试管中，28～30℃条件下静置培养16～18h至稳定期，按照1％～3％ 接种量接种至MRS液体培养基中，28～30℃条件下培养16～20h至稳定期，以此发酵 液作为发酵种子液，按照3％～5％接种量接种至装有MRS液体培养基的发酵罐中， 24～26℃条件下培养48～72h； (2)将步骤(1)中所得混合体系于4℃条件下离心并收集上清液； (3)将步骤(2)中所得的上清液减压浓缩，与Sevag试剂混合后于4℃条件下离 心并收集上清液； (4)向步骤(3)中所得的上清液中加入2～3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置 12～18h后，离心得到胞外多糖的粗提物； (5)将步骤(4)中所得的胞外多糖的粗提物用乙醇洗涤2～4次后，用截留分子量 为3000～5000道尔顿的透析袋透析，冷冻干燥获得乳酸菌的胞外多糖。 7.  根据权利要求1所述的提高果酒储存稳定性的方法，其特征在于，每1L果酒中， 乳酸菌胞外多糖的添加量为150～500mg。 8.  根据权利要求1所述的提高果酒储存稳定性的方法，其特征在于，过滤方法为 用孔径为0.20～0.80um的微孔滤膜或陶瓷膜进行过滤。

说明书一种提高果酒储存稳定性的方法
技术领域
本发明属于果酒加工技术领域，具体涉及一种提高果酒储存稳定性的方法。
背景技术
随着生活水平的提高和保健意识的增强，以葡萄酒为代表的果酒的营养价值得到 广泛认可。果酒是利用新鲜水果为原料，在保存水果原有营养成分的情况下，利用自 然发酵或人工添加酵母菌经发酵酿制出的具有保健功能的营养型酒。有些生吃水果不 能吸收的营养，通过果酒却可以吸收。
果酒作为一种商品，澄清度是决定其品质的一个重要指标，也是给消费者的第一 印象，澄清透明、颜色清亮的果酒商品容易吸引消费者的眼球。虽然浑浊或带有沉淀 的果酒对人体健康没有影响，但影响消费者的购买欲，进而影响销售市场，因此，果 酒必须保持较高的澄清度和稳定性才能保持果酒的商品价值。
果酒的澄清处理方法有自然澄清法、澄清剂澄清处理法、冷热澄清处理法和超滤 法。自然澄清法耗时太久，但经过自然澄清法获得的果酒的稳定性高，不易出现二次 沉淀现象。超滤法存在成本高的缺点。澄清剂处理法和超滤法是目前常用的方法，有 时也把冷热处理法和澄清剂处理法结合使用。本研究团队对黑莓、蓝莓、草莓、葡萄 等果酒的加工进行了多年的研究，取得一些研究成果，从黑莓自然发酵果酒中筛选到 适合黑莓果酒发酵且具有降L-苹果酸功能的酿酒酵母FM-S-115，该菌株及其用法获 得专利(ZL 201310098108)。利用皂土、壳聚糖、明胶-单宁对黑莓、蓝莓、草莓和葡 萄果酒进行澄清处理，获得较好的效果，但我们在研究的过程中发现，果酒装瓶后在 储存过程中的很容易发生二次沉淀，大大降低果酒的商业价值，进而会给果酒产业造 成巨大的经济损失，那么如何在果酒的储藏过程中保持其澄清度的稳定性是亟待解决 的一个问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种安全无害，简单高效的提高果酒储存稳定性的 方法，以解决现有技术中存在的成本较高，易出现二次沉淀等问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种提高果酒储存稳定性的方法，它是向果酒中加入明胶和单宁进行澄清处理后， 加入乳酸菌胞外多糖，混匀静置3～5天后过滤。
其中，明胶和单宁的质量比为3～4：1。
其中，向果酒中先加入单宁，混匀后再加入明胶；其中，每1L果酒中，单宁添加 量为0.1～0.3g,明胶的添加量为0.30～1.20g。
其中，所述的乳酸菌为植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)，命名为FM-L1-3，是 于2013年8月从新疆酸马奶中筛选得到的一株具有高产胞外多糖性能的乳酸菌，其部 分生理生化性质如表1所示。该菌株目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏日期为2014年12月15，保藏号为CGMCC No.10178。
表1菌株FM-L1-3的部分生理生化性质测定结果

注：“+”：表示阳性反应，“-”：表示阴性反应。
其中，其特征在于，所述的乳酸菌胞外多糖由植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum) CGMCC No.10178发酵制备得到。
其中，所述的乳酸菌胞外多糖按如下提取步骤制备得到：
(1)将植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)CGMCC No.10178单菌落接种于含有 MRS液体培养基的试管中，28～30℃条件下静置培养16～18h至稳定期，按照1％～3％ 接种量接种至MRS液体培养基中，28～30℃条件下培养16～20h至稳定期，以此发酵 液作为发酵种子液，按照3％～5％接种量接种至装有MRS液体培养基的发酵罐中， 24～26℃条件下培养48～72h；(2)将步骤(1)中所得混合体系于4℃条件下离心并 收集上清液；
(3)将步骤(2)中所得的上清液减压浓缩，与Sevag试剂混合后于4℃条件下离 心并收集上清液；
(4)向步骤(3)中所得的上清液中加入2～3倍体积的无水乙醇，4℃条件下下静 置12～18h后，离心得到胞外多糖的粗提物；
(5)将步骤(4)中所得的胞外多糖的粗提物用乙醇洗涤2～4次后，用截留分子量 为3000～5000道尔顿的透析袋透析，冷冻干燥获得乳酸菌的胞外多糖。
步骤(3)中，Sevag试剂由氯仿和戊醇(或丁醇)以4：1的体积比混合而成，Sevag 试剂的加入量为步骤(2)中所得上清液体积的20％。
其中，每1L果酒中，乳酸菌胞外多糖的添加量为150～500mg。
其中，过滤方法为用孔径为0.20～0.80um的微孔滤膜或陶瓷膜进行过滤。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
1、本发明的提高果酒储存稳定的方法，为果酒加工业的健康发展提供技术支持。
2、植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-L1-3，来源于新疆酸马奶中，来源比较 安全，其产生的胞外多糖对人体无害，并且能提果酒的保健功能。
3.植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-L1-3，为果酒加工业生产提供可靠的菌 种资源。
附图说明
图1为FM-L1-3平板菌落形态图。
图2为FM-L1-3菌体形态图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。
实施例1胞外多糖高产菌株FM-L1-3的筛选与鉴定
以MRS培养基为筛选培养基，从新疆酸马奶的21株单菌落中，根据革兰氏染色和 过氧化氢接触酶实验结果，初步鉴定出16株乳酸菌，挑取单菌落接种至MRS液体培养 基中，25℃条件下静置培养48h，4℃条件下，5000rpm/min离心5min，收集上清，上 清液Sevag法处理以脱除蛋白(氯仿：戊醇或丁醇＝4：1)，加入上清液体积20％的Sevag 试剂，充分震荡混匀，4℃条件下，12000rpm/min离心10min，弃沉淀，再添加3倍体 积的冷无水乙醇于上清液中，4℃下静置过夜，4℃条件下，12000rpm/min离心20min， 得胞外多糖的粗提物，采用苯酚-硫酸法测定糖含量。16株乳酸菌株的胞外多糖产量见 表2。从表中可以看出，FM-L1-3胞外多糖的产量最高，为315.56mg/L。
表2不同菌株的胞外多糖的产量

提取FM-L1-3的基因组，利用16S r DNA通用引物，以基因组为模版进行PCR扩增， 扩增出的产物经纯化后送上海生物工程有限公司进行测序。获得16S r DNA序列(如SEQ  ID No：1所示)在GenBank数据库中进行序列比对，所显示95％的序列都是植物乳杆菌， 且与该序列相似性都在99％及以上。用Blast搜索程序从GenBank数据库中调出相似性较 高的相关菌株的16S rRNA基因序列，经过序列多重比对和系统发育进化分析，发现菌株 FM-L1-3与Lactobacillius plantarum strain LP-01(HM130542)序列相似性高达99％，并 且系统发育分析结果显示该菌与植物乳杆菌Lactobacillius plantarum strain LP-01 (HM130542)自然聚为一支，说明该菌株是植物乳杆菌种的成员。FM-L1-3的菌落和 菌体形态分别见图1和图2，该菌在MRS培养基平板上培养48h的菌落形态呈现规则圆 形，湿润，颜色为乳黄色，菌落直径为0.5～1.5mm；菌体长度为2.1～3.5μm，菌体细胞典 型杆状，单个或呈链状排列，常聚集在一块，无芽孢；其生理学特性是革兰氏染色为阳 性、氧化酶和过氧化氢酶试验为阴性，该菌株的部分糖发酵结果见表3，结合系统发育 分析结果、形态学及主要生物学特性把菌株FM-L1-3鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillius  plantarum)。该菌株于2014年12月15在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 进行保藏，保藏号是CGMCC No.10178。
表3FM-L1-3部分糖发酵结果


实施例2FM-L1-3胞外多糖的提取
挑取FM-L1-3单菌落接种至5ml的MRS液体培养基中，30℃条件下静置培养18h， 按2％的接种量接种至300ml的MRS液体培养基中，以5％的接种至10L(装6L的 MRS液体培养基)的自动发酵罐中，25℃条件下静置培养48h，4℃条件下，5000 rpm/min离心5min，收集上清，上清液用减压浓缩法浓缩上清液体积至1/5，用Sevag法 处理以脱除蛋白(氯仿：戊醇或丁醇＝4：1)，加入上清液体积20％的Sevag试剂，充 分震荡混匀，4℃条件下，12000rpm/min离心10min，弃沉淀，再添加3倍体积的冷乙 醇于上清液中，4℃下静置过夜。4℃条件下，12000rpm/min离心20min，获得胞外多糖 的粗提物，用冷乙醇洗涤沉淀物2～4次，用截留分子量为5000道尔顿的透析袋透析， 冷冻干燥获得乳酸菌的胞外多糖。该提取物用于果酒的储存稳定性处理。
实施例3黑莓果酒的澄清及稳定性处理
该黑莓果酒的酒精含量为12.0±0.5％(v/v)，糖含量为3.6±0.1g/L。
明胶溶液:将一定量的明胶用10倍的水加热膨胀溶解，配成100mg/mL的明胶 溶液；
单宁溶液：称10g单宁于烧杯中，量取100ml水，向烧杯中加入20～30ml，加热至 60～70℃，单宁完全溶解后，加入剩下的水，搅拌均匀配成100mg/mL的单宁溶液
将配制好的澄清剂按照以下添加比例和顺序依次添加到待澄清的黑莓果酒中：单 宁溶液终浓度0.2～0.3g/L，在添加的过程中搅拌黑莓果酒，30～60min后加入黑莓果酒 中明胶终浓度为0.8～1.2g/L的明胶溶液，添加的过程中搅拌黑莓果酒，30～60min后在 -5.5～-6.5℃静置冷处理7～10d，趁冷在-6～-7℃的条件下硅藻土过滤。
胞外多糖处理：硅藻土过滤后的果酒，按照终浓度为200～300mg/L的量加入 FM-L1-3的胞外多糖，充分混匀后常温下静置3～5d，利用孔径为0.20～0.80um的微 孔率膜过滤处理。经过胞外多糖处理的黑莓果酒的主要成分变化及稳定性见表4，从 表中可以看出，胞外多糖的处理能够显著提高黑莓果酒的储存稳定性，未经胞外多糖 处理的黑莓果酒在经过5个月的储存之后，在瓶的底部会出现少许沉淀，而经过胞外 多糖处理的黑莓果酒在储存10个月之后，仍能保持澄清，底部未见沉淀，并且经过 胞外多糖处理的黑莓果酒的酒精含量没有明显改变，蛋白质含量明显下降，酚类物质 有所下降，但黑莓果酒的透光率有所提高。
表4黑莓果酒稳定处理前后主要成分及稳定性变化

实施例4蓝莓果酒的澄清及稳定性处理
该蓝莓果酒的酒精含量为12.0±0.5％(v/v)，糖含量为3.3±0.1g/L。
明胶溶液:将一定量的明胶用10倍的水加热膨胀溶解，配成100mg/mL的明胶溶 液；单宁溶液：称10g单宁于烧杯中，量取100ml水，向烧杯中加入20～30ml，加热至 60～70℃，单宁完全溶解后，加入剩下的水，搅拌均匀配成100mg/mL的单宁溶液。
将配制好的澄清剂按照以下添加比例和顺序依次添加到待澄清的蓝莓果酒中：单宁 溶液终浓度0.3～0.4g/L，在添加的过程中搅拌蓝莓果酒，30～60min后加入蓝莓果酒中明 胶终浓度为0.8～1.2g/L的明胶溶液，添加的过程中搅拌蓝莓果酒，30～60min后在-5～-7℃ 静置冷处理10～20d，趁冷在-5～-7℃的条件下硅藻土过滤。
胞外多糖处理：硅藻土过滤后的果酒，按照果酒中含胞外多糖终浓度为200～300 mg/L的量加入FM-L1-3的胞外多糖，充分混匀后常温下静置3～5d，利用孔径为0.20～0.80 um的微孔率膜过滤处理。经过胞外多糖处理的蓝莓果酒的成分及稳定期变化见表5，从 表中可以看出胞外多糖的处理能够显著提高蓝莓果酒的储存稳定性，未经胞外多糖处理 的蓝莓果酒在经过4个月的储存之后，在瓶的底部会出现少许沉淀，而经过胞外多糖处 理的蓝莓果酒在储存10个月之后，仍能保持澄清，底部未见沉淀，并且经过胞外多糖处 理的蓝莓果酒的蛋白质含量明显下降，酚类物质也有所下降，但蓝莓果酒的透光率有所 提高，酒精含量没有明显变化。
表5蓝莓稳定处理前后主要成分的变化及稳定性

实施例5草莓果酒的澄清剂稳定性处理
该草莓果酒的酒精含量为12.0±0.5％(v/v)，糖含量为3.3±0.1g/L。
明胶溶液:将一定量的明胶用10倍的水加热膨胀溶解，配成100mg/mL的明胶溶 液；单宁溶液：称10g单宁于烧杯中，量取100ml水，向烧杯中加入20～30ml，加热至 60～70℃，单宁完全溶解后，加入剩下的水，搅拌均匀配成100mg/mL的单宁溶液。
将配制好的澄清剂按照以下添加比例和顺序依次添加到待澄清的草莓果酒中：单 宁溶液终浓度0.1～0.2g/L，在添加的过程中搅拌草莓果酒，30～60min后加入果酒含明 胶终浓度为0.3～0.6g/L的明胶溶液，添加的过程中搅拌草莓果酒，30～60min后在 -5～-6℃静置冷处理7～10d，趁冷在-5～-6℃的条件下硅藻土过滤。
胞外多糖处理：硅藻土过滤后的果酒，按照草莓果酒中胞外多糖终浓度为 150～200mg/L的量加入FM-L1-3的胞外多糖，充分混匀后常温下静置3～5d，利用孔 径为0.20～0.80um的微孔率膜过滤处理。经过胞外多糖处理的草莓果酒的成分变化及 稳定性见表6，从表中可以看出胞外多糖的处理能够显著提高草莓果酒的储存稳定性， 未经胞外多糖处理的草莓果酒在经过6个月的储存之后，在瓶的底部会出现少许沉淀， 而经过胞外多糖处理的黑草果酒在储存10个月之后，仍能保持澄清，底部未见沉淀， 并且经过胞外多糖处理的草莓果酒的蛋白质含量明显下降，酚类物质和草莓果酒的色 度也有所下降，草莓果酒的透光率有所提高。
表6草莓果酒稳定处理前后主要成分及稳定性变化