抗原虫疫苗 【技术领域】
本发明涉及原虫病的免疫疗法。更具体地，本发明涉及次黄嘌呤鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine xanthinephosphoribosyl transferase)蛋白或其肽片段作为有效抵抗原虫病的疫苗中的免疫原的用途，原虫病如疟疾和巴贝虫病(babesiosis)。本发明的令人惊奇之处在于用次黄嘌呤鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶蛋白或其肽片段免疫接种，诱导了对血液阶段疟疾的T细胞免疫。因此，本发明提供可广泛地应用于原虫病包括疟疾的蛋白的和DNA的疟疾疫苗以及产生T细胞介导的免疫应答的预防和治疗性免疫接种地方法。
背景技术
通常，原虫病严重地影响人类和动物的健康和生存，特别是家畜和宠物。病原体包括那些在人类中导致疟疾的(疟原虫(Plasmodium spp.))，感染家畜的牛巴贝虫(Babesis bovis)、二联巴贝虫(Babesia bigemina)和分歧巴贝虫(Babesia divergens)，感染狗的犬巴贝虫(Babesia canis)，感染人的果氏巴贝虫(Babesia microti)和分歧巴贝虫(Babesia divergens)。由其他原生动物引起的主要疾病包括，如人和动物、特别是家畜中的锥虫病(冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)、刚果锥虫(T.congolense)、克氏锥虫(T.cruzi)及其他种类)，各种利什曼病(杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、热带利什曼原虫(L.tropica)、巴西利什曼原虫(L.brasiliensis)、墨西哥利什曼原虫(L.mexicana))，贾第鞭毛虫病(兰伯贾第虫(Giardia lamblia))，弓形体病(鼠弓形体(Toxoplasma gondii))。此外，鸡中柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)导致的动物产品的球虫病造成严重的经济影响。
疟疾是人类发病率和死亡率的主要引因，特别是在不发达国家中。疟疾威胁全世界40-50亿人，每年导致超过200万人死亡(Murray et al.，1995，Manual of Clinical Microbiology(6th ed.)ASM Press，Washington D.C.)。
疟疾是由疟原虫属的原生动物寄生引起。感染人的有四种，恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)。疟原虫具有复杂的生活周期，其包括在脊椎动物宿主的红细胞中发生无性繁殖的血液阶段。
自由寄生虫(裂殖子)识别、附着和侵入红细胞。一旦侵入，寄生虫复制、形成裂殖体，新形成的裂殖子从被感染的红细胞中释放到血浆，裂殖子在血浆中感染其他红细胞。
对药物和杀虫剂的抗性不断增加，日益成为已有的预防或治疗方法，包括应用于人以杀死寄生虫的药物和用于杀死蚊子载体的杀虫剂，难以解决的问题。
疟疾疫苗是对于现有的地方性疟疾控制项目的一个重要补充，对于短期暴露于疟疾的旅行者也是重要的。
开发疟疾疫苗的尝试已经集中于确定起始适当的宿主免疫应答的合适疟原虫蛋白。但是，疟原虫的复杂生活周期使得这种蛋白的确定成为一项艰巨的任务。
虽然有很好的证据表明，过继免疫系统的不同效应子成分可介导对血液阶段的疟原虫的免疫(Freeman & Parish，1981；Grun & Weidanz，1983；Brake et al，1988；Seixas & Langhorne，1999)，但主要成分的目标抗原、效应子CD4+T细胞还未被确定。至今，仅抗体的目标抗原被确定，这些目标是在克隆中具有变化能力的变体，或者是表明具有等位基因多态性(Good，2001)。
发明概述
本发明广泛地涉及次黄嘌呤鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGXPRT)蛋白和/或其免疫原性片段作为能够引起对原生动物的免疫应答的免疫原的用途。
优选地，HGXPRT蛋白、其免疫原性片段或其编码核酸分离自疟原虫属或巴倍虫属。
第一个方面，本发明提供一种包含次黄嘌呤鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGXPRT)蛋白的至少一种免疫原性片段的分离的蛋白质，其中所述分离的蛋白质不是全长的HGXPRT。
在一个具体的实施方案中，所述分离的蛋白质包含选自SEQ IDNO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；SEQ IDNO：15；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；或SEQID NO：24的一种氨基酸序列。
优选的氨基酸序列示于SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、15、17、18、21、22、23和24中。
更加优选的氨基酸序列示于SEQ ID NO：17和21中。
在另一个具体的实施方案中，本发明提供一种包含多个HGXPRT蛋白的免疫原性片段的分离的蛋白质。
本发明的这个方面还包括前述的HGXPRT片段和分离的蛋白质的变体和衍生物。
第二个方面，本发明提供编码第一方面的分离的蛋白质的分离的核酸。
在一个具体的实施方案中，分离的核酸包含序列选自SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ IDNO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38；SEQNO：39；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44；SEQ NO：45；SEQ ID NO：46；SEQ ID NO：47；或SEQ IDNO：48的一种核苷酸序列。
第三方面，本发明提供一种免疫治疗组合物，其包含分离的次黄嘌呤鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGXPRT)蛋白，或至少一种其免疫原性片段和免疫学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
第四方面，本发明提供一种免疫治疗组合物，其包含编码次黄嘌呤鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGXPRT)蛋白或至少一种其免疫原性片段的分离的核酸，和免疫学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
优选地，免疫治疗组合物是疫苗。
优选地，HGXPRT蛋白，其免疫原性片段或编码核酸分离自或来自致病的原生动物。
优选地，HGXPRT蛋白，其免疫原性片段或各个免疫原性片段或编码核酸分离自疟原虫属或巴倍虫属。
在一个实施方案中，所述免疫治疗组合物还包括一或多种来自除HGXPRT以外的一或多种蛋白质的B淋巴细胞表位，或其编码核酸。
第五个方面，本发明提供识别HGXPRT蛋白表位的分离的淋巴细胞。
优选地，淋巴细胞是T淋巴细胞。
更加优选地，T淋巴细胞是CD4+T淋巴细胞。
优选地，T淋巴细胞是产生一或多种细胞因子的CD4+T淋巴细胞，所述细胞因子包括但不限于白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
第六个方面，本发明提供一种用HGXPRT蛋白或至少一种其免疫原性片段免疫的非人类的动物。
优选地，非人类动物是小鼠、奶牛、狗或鸡。
第七个方面，本发明提供一种抗原虫病的免疫方法，所述方法包括将HGXPRT蛋白或至少一种其免疫原性片段施用给动物的步骤。
第八个方面，本发明提供一种抗原虫病的免疫方法，所述方法包括将编码HGXPRT蛋白或其免疫原性片段的分离的核酸施用给动物的步骤。
第九个方面，本发明提供一种结合HGXPRT蛋白的免疫原性片段的抗体。
优选地，抗体结合包含示于SEQ ID NO：1-24中任何一种氨基酸序列的肽。
从前述可以了解，本发明涉及采用HGXPRT蛋白作为免疫原来治疗多种原虫病的免疫疗法，原虫病包括但不限于人的疟疾(Plasmodiumspp.)，感染家畜的牛巴贝虫、二联巴贝虫和分歧巴贝虫，感染狗的犬巴贝虫，感染人的果氏巴贝虫和分歧巴贝虫，人和动物特别是家畜的锥虫病(冈比亚锥虫、刚果锥虫、克氏锥虫等)，各种利什曼病(杜氏利什曼原虫、热带利什曼原虫、巴西利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫)，贾弟虫病(兰伯贾第虫)，弓形体病(鼠弓形体)和鸡的球虫病(柔嫩艾美耳球虫)和边虫病。
在本说明书中，除非另外指出，“包含”(comprise、comprises、comprising)作为开放式使用，而不是作为封闭式使用，使得指明的组分或组分组可以包括一或多种未指出的组分或组分组。
【附图说明】
图1A T细胞系的特异性。T细胞系对不同抗原的增殖反应。结果为三个孔的ΔCPM平均数±SD。F-、J-、pRBC-、E-和卵清蛋白特异性T细胞系的背景CPM分别是2630±151、560±83、2573±325、3330±403和274±46。
图1B 寄生虫特异性和卵清蛋白T细胞系的免疫分型和细胞因子特征。对于各种细胞系来说，细胞比例是来自两个24孔平板的细胞的代表性结果。
图2 SCID小鼠(5只/组)的寄生虫血症的水平。给小鼠输入5×106的抗原特异性T细胞。一天后，在用105pRBC静脉注射攻击感染之前，对小鼠进行两个感染-治疗的循环。
图3 将F集合(pool)的蛋白级份纯化为单条带的蛋白质。用考马斯兰染色制备SDS-PAGE梯度凝胶(6-18％)来显示被切取用于分析的单条带蛋白质。蛋白质标记的相对分子量被显示在左边。箭头指示双条带16的位置。
图4A 用于分析单条带蛋白质的SCID小鼠的寄生虫血症的水平。给小鼠过继输入用单条带特异性T细胞(5×106/小鼠)，这些T细胞已经用F级份抗原进行一次体外刺激一静止培养循环。转化后24h，在用寄生虫化的红细胞(105pRBC/只)静脉攻击感染之前，对小鼠进行两个感染-治疗的循环来体内扩增T细胞。
图4B 用于分析单条带蛋白质的SCID小鼠的寄生虫血症水平。在进行两个感染-治疗的循环前，给小鼠输入F级份特异性T细胞(106/小鼠)，然后用CFA/IFA中的单条带蛋白质免疫(总共5μg/只小鼠)。
图5A 保护性约氏疟原虫(P.yoelii)17XNL条带16(P1)-标记的淋巴结细胞对活性形式的重组恶性疟原虫HGXPRT(PfX抗原)的增殖反应。小鼠用保护性SDS-PAGE凝胶提取的条带16(P1)免疫。10天后，收集淋巴结细胞，用紧邻P1的正下方的条带(P2)(图3)和PfX刺激。不相关的100kDa寄生虫蛋白(A)被用于检测特异性。完整约氏疟原虫寄生虫抗原(pRBC)、PPD和con-A用作为对照。结果为三个孔的CPM平均数±SD。背景CPM为2551±396。
图5B 用恶性疟原虫HGXPRT(PfHGXPRT)免疫的BALB/c小鼠中的寄生虫血症水平。包括用卵清蛋白和PBS免疫的小鼠作为对照。
图6 来自疟原虫属、人和小鼠的HGXPRT序列以及肽CS17和CS21的比较。暗灰色阴影表示相同；浅色阴影表示保守取代。预测的CS17和CS21的免疫原性氨基酸用粗体表示。
图7 (A)(来自恶性疟原虫株FCR3和恶性疟原虫株3D7)HGXPRT的肽序列(称为CS-1到CS-24)和(B)编码肽CS-1到CS-24的核苷酸序列。称作CS-1到CS-24的肽分别对应于SEQ ID NO：1-24。编码CS-1到CS-24的核苷酸序列分别对应SEQ ID NO：25-48。
图8 从用重组PfHGXPRT(rPfHGXPRT)免疫的BALB/c小鼠获得的淋巴结细胞的增殖反应。结果为三个孔的平均数。用衍生自PfHGXPRT的肽(称作为CS-1到CS-24)或者全长的重组HGXPRT分子(rPfHGXPRT)体外刺激淋巴结T细胞。T细胞还用感染了各种疟原虫株的人和小鼠红细胞来刺激。用纯化的蛋白质衍生物(PPD)、正常的小鼠红细胞(NMRBC)和正常的人红细胞(NHRBC)刺激的T细胞作为对照。
关键词：rPfHGXPRT；重组恶性疟原虫HGXPRT；Pf-pRBC(3d7)；用恶性疟原虫，3d7株感染的人红细胞；Pb-pRBC；用柏格氏鼠疟原虫(P.berghei)，ANKA株感染的小鼠红细胞；P.ch AS-pRBC；用P.chabaudi，AS株感染的小鼠红细胞；Py 17XNL-pRBC；用约氏疟原虫，17XNL株感染的小鼠红细胞；Py YM-pRBC；用约氏疟原虫，YM株感染的小鼠红细胞；Pv-pRBC；用P.vinckei感染的小鼠红细胞。
图9 来自用A.集合的(pooled)肽CS 1-8；B.集合的肽CS 9-16或C.集合的肽CS 17-24免疫的B10.BR小鼠的淋巴结细胞的增殖反应。用PfHGXPRT、PPD、ConA(作为对照)，或者如指定的各种浓度(30、10和3ug/ml)的各种肽体外刺激淋巴结细胞。
图10 当用感染了不同疟原虫株的红细胞体外刺激时，来自用A.集合的肽CS 1-8；B.集合的肽CS 9-16或C.集合的肽CS 17-24免疫的B10.BR小鼠的淋巴结细胞的增殖反应。参见图3中关键词。
图11 rPfHGXPRT肽特异性免疫应答来防止B10.BR小鼠感染柏格氏鼠疟原虫ANKA的能力。B10.BR小鼠用肽16、17、21，集合的肽16、17和21或者磷酸缓冲液生理盐水(PBS；对照)免疫，然后用柏格氏鼠疟原虫ANKA攻击。
图12 来自用A.集合的肽CS1-8；B.集合的肽CS9-16或集合的肽CS 17-24免疫的BALB/c小鼠的淋巴结细胞的增殖反应。用PPD、ConA(作为对照)或不同浓度(30、10和3ug/ml)的用于免疫小鼠的肽的集合的各种肽体外刺激淋巴结细胞。
图13 当以用不同株的疟原虫感染的红细胞体外刺激时，来自用A.集合的肽CS1-8；B.集合的肽CS9-16或集合的肽CS 17-24免疫的BALB/c小鼠的淋巴结细胞的增殖反应。
图14 rPfHGXPRT肽对防止BALB/c小鼠被约氏疟原虫17XNL感染的特异性免疫应答的能力。BALB/c小鼠用肽1、17、21，肽9、10和11的集合，肽1、9、10、11、17和21的集合，或者PBS免疫，然后用约氏疟原虫17XNL攻击。
图15 rPfHGXPRT肽对防止BALB/c小鼠受柏格氏鼠疟原虫ANKA感染的特异性免疫应答的能力。BALB/c小鼠用肽1、17、21，肽9、10和11的集合，肽1、9、10、11、17和21的集合，或者PBS(对照)免疫，然后用柏格氏鼠疟原虫ANKA攻击。
【具体实施方式】
本发明产生自将分离自疟疾寄生虫的HGXPRT施用给小鼠时诱导免疫应答的意外发现。更加惊奇的是，免疫应答介导的保护作用主要是由T细胞引起，并可能涉及“Th1”细胞因子如白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的生成。而且，根据被免疫的小鼠抵抗随后的疟疾寄生虫的攻击的能力，断定这种免疫应答具有保护性。本发明还提供确定的产生自疟疾HGXPRT的免疫原性肽，可以用于诱导保护性免疫应答。因此，本发明可合乎逻辑地扩展到抗多种寄生虫病的动物免疫接种。特别地，本发明提供用免疫原免疫人类来抵抗疟疾，这种免疫原是人类保护性T细胞介导的免疫的主要的、有效的诱导剂。
HGXPRT的免疫原性片段
一个方面，本发明提供分离的原生动物HGXPRT的免疫原性片段和包含一或多种该免疫原性片段的分离的蛋白质。
为了实现本发明的目的，“分离的”是指物质从其天然状态中被取出的或经过人为处理的。被分离的材料可能基本上或实质上不含有通常在自然状态下与其相伴的成分，或者被处理以和通常在自然状态下与其相伴的成分一起处于人工状态。分离的物质可以是天然的或重组形式。
“蛋白质”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸，D型或L型氨基酸，这在本领域是熟知的。氨基酸范围内还包括本领域熟知的化学修饰的或衍生的氨基酸。
“肽”是具有少于50个氨基酸的蛋白质。
“多肽”是具有50个或更多氨基酸的蛋白质。
分离自疟原虫的HGXPRT蛋白质在本领域是已知的，对技术人员来说容易获得。来自疟原虫属、小鼠和人的HGXPRT蛋白质序列示于图6。
次黄嘌呤鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGXPRT)常见于哺乳动物、原生动物和细菌中。例如，对可以得到的数据库进行BLAST序列检索，表明在硕大利什曼原虫(Leishmania major)、杜氏利什曼原虫、克氏锥虫、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、鼠弓形体和柔嫩艾美耳球虫中可以检测到HGXPRT。例如，鼠弓形体中的酶与恶性疟原虫的酶具有51％序列相同性(sequence identity)和70％的氨基酸相似性(similarity)，而柔嫩艾美耳球虫的部分氨基酸序列与恶性疟原虫的酶具有44％序列相同性和65％序列相似性。
还应当指出，黄嘌呤是疟原虫、弓形虫和毛滴虫的HGPRT酶的额外底物，因此，有时它们的酶简称为HGXPRT。这表示底物特异性的差异较小，与对抗原的免疫应答无关。
为了说明的目的，所有次黄嘌呤鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶都简称为HGXPRT。
在本发明的上下文中，HGXPRT蛋白质的“免疫原性片段”是存在于HGXPRT蛋白质中的任何氨基酸序列(而不是完整的HGXPRT氨基酸序列)，当被施用给动物特别是人时，能够引起免疫应答。
“表位”是指能够被至少一个T细胞或B细胞克隆型(clonotype)体内或体外识别的连续或不连续的氨基酸序列。
本发明的分离的蛋白质可能包括至少一个本文描述的免疫原性片段，任选地，和其他氨基酸残基。
根据前述的教导，可以理解本发明包括分离的蛋白质，其包括多个本文描述的免疫原性片段，任选地，和其他氨基酸残基。
示于SEQ ID NO：1-24的分离的蛋白质的例子包括至少一个来源于或存在于疟原虫HGXPRT蛋白质中的氨基酸序列，在特别的实施方案中，还有其他氨基酸残基。一般通过与哺乳动物如小鼠和人中的HGXPRT蛋白质不同源的最小区域来选择至少一个氨基酸序列。这些最小的非同源区可能是保护性T细胞的优选靶点。
本发明特别有效的分离的蛋白质列举在SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、15、17、18、21、22、23和24中。
本发明更加有效的分离的蛋白质列举在SEQ ID NO：17和21中。
如图6所示，免疫原性肽CS17(SEQ ID NO：17)和CS21(SEQ ID NO：21)与人和小鼠蛋白质的高度同源区形成一致的比对，是一个令人惊奇的结果。原本预期的结果是，这些免疫原性片段可能与非同源区形成一致的比对。
预测的CS17和CS20的免疫原性氨基酸显示在图6中，不过这不应该被视为说明了这些氨基酸是免疫原性残基，或者在CS17和CS20中没有其他免疫原性残基。
确定存在于HGXPRT的其他T细胞表位，可以由技术人员根据本文提供的充分公开来实现。对此，可以参考Tian et al，1998，其中提供一个表位作图方法的例子，可以被用于描绘HGXPRT的T细胞表位。
本发明还包括仍然保持免疫原性的变体和/或衍生物或其他被修饰的HGXPRT蛋白质和免疫原性片段。实际上，可以预期，SEQ ID NO：1-24不是完全来自相应的HGXPRT序列，而是包括其他氨基酸，因此，对于相应的HGXPRT序列来说是“变体”。
一般地，可以引入保守氨基酸取代或者实质上保持免疫原性的HGXPRT蛋白质。可选择地，可以引入非保守氨基酸取代，按期望地改变免疫原性。
还可以预期，T细胞的计算机辅助分析可以被用于构建HGXPRT免疫原性片段或肽的变体，采用的方法如在Dressel et al，1997或Michielinet al，2000中被描述，虽然不限于此。
根据前述，在特定实施方案中，本发明的免疫原性蛋白质的变体可能包括与SEQ ID NO：1-24任何之一具有至少70％，优选至少80％，或更加优选至少90％和有利地至少95％序列相同性的氨基酸序列。
序列相同性可以在“比较窗”中确定，比较窗具有至少6个氨基酸、优选至少12个氨基酸、更优选至少20个氨基酸和有利地在基本上完整的全长参比氨基酸序列上确定。
还可以预期，HGXPRT蛋白质及其片段可以化学交联到载体蛋白质(如BSA或甲状腺球蛋白)。对特定氨基酸的其他类型的化学修饰在本领域是熟知的，技术人员参考CURRENT PROTOCOLS IN PROTEINSCIENCE Eds.Coligan et al.John Wiley & Sons NY USA(1995-2001)第15章来获得更加详细的与蛋白质的化学修饰相关的方法学。
还可以预期，按照本发明的免疫治疗组合物，可能还包括来自HGXPRT外的一或多种原生动物抗原的一或多种B细胞表位。例子包括MSP1或顶膜抗原1(Apical membrane Antigen 1)的羧基末端作为B细胞表位，但不限于此。
应当理解，优选的免疫应答是保护性T细胞介导的抗人的疟疾的应答。
HGXPRT蛋白、由此衍生的免疫原性肽和其他蛋白质或疫苗的肽成分(如B细胞表位)可以通过重组DNA技术或通过本领域熟知的固相或液相化学合成来制备。
重组蛋白质表达在本领域是熟知的，表达系统可以从细菌(如大肠杆菌DH5α)、昆虫(如Sf9)和酵母细胞中获得。
至于例子，技术人员可以分别参考CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等，John Wiley & Sons NY USA(1995-2001)的第15和18章来获得分别用于重组蛋白表达和化学合成的技术。
可选择地，用蛋白酶如endoLys-C，endoArg-C，endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化HGXPRT蛋白质来制备肽。消化的片段通过例如高效液相层析(HPLC)技术来纯化。
为了表达重组HGXPRT蛋白，增加融合配偶体来辅助纯化。作为例子，融合配偶体包括聚组氨酸标记、麦芽糖结合蛋白(MBP)、蛋白质A和谷胱甘肽S-转移酶(GST)。还可以预期，蛋白质裂解位点(如因子Xa和凝血酶位点)可能存在于HGXPRT蛋白和融合配偶体之间，以便后来去除融合配偶体。
HGXPRT核酸和核酸疫苗
在一种形式中，本发明提供编码原生动物HGXPRT，优选疟疾HGXPRT的一或多种免疫原性片段的分离的核酸。
疟原虫HGXPRT核酸序列在本领域是熟知的，而且可以参考NCBIEntrez登录号M88110(恶性疟原虫)和AB021413(柏格氏鼠疟原虫)。
编码SEQ ID NO：1-24的肽的优选核酸序列分别示于SEQ IDNO：25-48和图7B中。
本发明还提供免疫治疗性组合物，其包括编码HGXPRT或其一或多种免疫原性片段的核酸，优选是DNA疫苗形式。
所述核酸还编码来自除HGXPRT以外的一或多种疟疾抗原的一或多种B细胞表位。
因此，包括多表位构建体的DNA疫苗也被包括在本发明中，采用方法如Boyle et al，1998或Hanke et al，1999中所描述。
本文所用的术语“核酸”是指单链或双链的mRNA、RNA、cRNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA和DNA-RNA杂合体。
“多核苷酸”是具有80或更多连续核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”是具有少于80个的连续核苷酸。
“探针”是单链的或双链的寡核苷酸或多核苷酸，适当地被标记用于在例如Northern或Southern印迹中检测互补序列。
“引物”通常是单链的寡核苷酸，优选具有15-50个连续核苷酸，其能够退火结合核酸“模板”，并通过DNA聚合酶如Taq聚合酶、RNA依赖的DNA聚合酶或SequenaseTm的作用以模板依赖的方式延伸。
本发明还包括在本发明的核酸中使用被修饰的嘌呤(例如，次黄嘌呤核苷、甲基次黄嘌呤核苷和甲基腺苷)和被修饰的嘧啶(硫尿嘧啶和甲基胞嘧啶)。
本发明还包括HGXPRT的编码核酸，通过利用密码子序列冗余来修饰。在特别实施例中，改进密码子选择来优化核酸在特定生物体或细胞类型中的表达。在这一点上，已经证明在DNA疫苗中，密码子优化可能增强被表达的疟疾抗原的免疫原性(Narum et al，2001)。
本发明还包括修饰的核酸，其编码各种上文定义的HGXPRT的免疫原性片段。
被修饰的核酸例如与SEQ ID NO：25-48任何之一具有至少60％、优选至少70％、更加优选至少80％和有利地至少90％核苷酸序列相同性。
序列相同性可以通过“比较窗”测定，其具有至少12个核苷酸、优选至少20个核苷酸、更加优选至少50个核苷酸和有利地在基本上完整的全长参比核苷酸序列上测定。
对于核酸疫苗可以采用表达构建体，其包含在表达载体中可操作地连接到一个或多个调控序列上的分离HGXPRT编码核酸。
存在于表达载体中的调控核苷酸序列(如增强子、启动子、剪接供体/受体信号、终止子和聚腺苷酸序列)在本领域是熟知的，便于嵌合受体的表达。无论是对于选择转化的细菌(例如bla、kanR和tetR)还是转化的哺乳动物细胞(如潮霉素、G418和嘌呤霉素)选择性标记也是有用的。
组成型和诱导型的启动子可以用于表达本发明的嵌合受体。诱导型启动子的例子是本领域已知的金属硫蛋白诱导的或四环素抑制系统。
还包括组织特异性启动子，其便于标记DNA疫苗的表达，从而增强编码的免疫原的加工和呈递。
技术人员将可以预期，DNA接种将成为日益被使用的抗疟疾的接种模式。充分讨论所用的表达载体和检测的疟疾抗原不在本说明书的范围内。但是，技术人员可以参考Kumar et al，2002和Doolan & Hoffman，2001来获得抗疟疾DNA疫苗总体现状。
免疫治疗组合物和疫苗
本发明提供免疫治疗性组合物，优选疫苗，其中的免疫原性成分是分离的HGXPRT蛋白或其一或多种片段。
“免疫治疗性组合物”是指能够对组合物的一或多种免疫原性成分或者对获得所述一或多种免疫原性成分的生物体产生免疫应答的组合物。
本文所用“疫苗”是产生保护性的免疫应答的免疫治疗性组合物。
可以预期，免疫治疗性组合物和疫苗可被治疗性地用于处理疟疾或可以预防性地用于防止或降低原生动物感染的严重程度。
本发明的治疗性组合物包括HGXPRT蛋白、肽，而核酸治疗方法可以任意多种形式和施用路径来施用。
可以预期，免疫治疗性组合物，如本发明的疫苗，包括免疫学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其有时可以是一种佐剂。但是，还可以预期，免疫学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂可以是一种物质，如水、生理盐水、酒精、有机聚合体或其他免疫学上惰性载体，其仅仅通过适当悬浮的和/或稳定的疫苗成分来辅助呈递疫苗。
在本领域可以理解，“佐剂”是指由一或多种增强疫苗组合物的免疫原性和效率的物质组成的组合物。非限定的合适的佐剂例子包括鲨烷和鲨烯(或动物来源的其他油)；阻断共聚物；去垢剂如Tween-80；QuillA，矿物油如Drakeol或Marcol，植物油如花生油；棒状杆菌来源的佐剂如小棒杆菌(Corynebacterium parvum)；丙酸杆菌属(Propionibacterium)如疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acne)来源的佐剂；牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(Bacille Calmette-Guerin或BCG)；白细胞介素如白细胞介素2和白细胞介素12；单核因子如白细胞介素1；肿瘤坏死因子；干扰素如干扰素γ；组合物如皂角苷-氢氧化铝或Quil-A氢氧化铝；脂质体；ISCOM和ISCOMATRIX佐剂；分支杆菌细胞壁提取物；合成糖肽如胞壁酰二肽或其他衍生物；顺式水八角苷；脂质A衍生物；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或具有磷酸铝；羧基聚亚甲基如Carbopol′EMA；丙烯酸共聚物乳剂如Neocryl A640(例如美国专利5,047,238)；牛痘或动物痘病毒蛋白；亚病毒颗粒佐剂如霍乱毒素或它们的混合物。
任何安全的施用路径可以被用于施用本发明的免疫治疗组合物。例如，可以采用口服的、直肠的、胃肠外的、舌下的、口腔的、静脉的、关节内的、肌肉内的、真皮内的、皮下的、吸入的、眼内的、腹膜内的、脑室内的、经皮的等。肌肉内的和皮下的注射是特别合适如用于施用免疫治疗性组合物如蛋白质的和DNA的疫苗。
抗体
本发明还提供抗体，其结合HGXPRT的免疫原性片段，例如示于SEQID NO：1-24的肽序列或其变体。
本发明的抗体可以是单克隆的或多克隆的。应用于抗体制备、纯化和使用的熟知方法可见于如Coligan et al，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY(John Wiley & Sons NY，1991-1994)的第2章和Harlow，E.& Lane，D.Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，ColdSpring Harbor Laboratory，1988中。
特别地，制备单克隆抗体可以采用标准方法如在Kohler &Milstein，1975，Nature 256，495的文章中描述的，在此引入作为参考，或者通过其最近的改进，如描述在Coligan et al，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY，同上文，通过无限增殖来自生产品种的脾细胞或其它制备抗体的细胞，生产品种已经用一或多种本发明的多肽、片段、变体或衍生物接种。
本发明的范围内还包括包含上述单克隆或多克隆抗体的Fc或Fab片段的抗体。可选择地，抗体可以包括抗本发明的BSP蛋白的单链Fv抗体(scFvs)。这种scFvs可以按照分别在美国专利5,091,513、欧洲专利239,400或Winter & Milstein，1991，Nature 349 293的文章中描述的方法来制备，在此引入作为参考。
标记可以与本发明的抗体或抗体片段结合，可以选自包括发色团、催化剂、酶、荧光团、化学发光分子、稀土离子如铕(Eu34)、放射性同位素和直接可视标记的组。在为直接可视标记时，采用胶体金属的或非金属颗粒、染色颗粒、酶或底物、有机聚合体、乳胶颗粒、脂质体、或其他含有单一的制备物的囊泡等。
大量可用作标记的酶被公开在美国专利说明书US4,366,241、US4,843,000和US4,849,338中，全部在此引入作为参考。用于本发明的酶标包括，如碱性磷酸酶、山葵过氧化物酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。酶标记可被单独使用或在溶液中与第二种酶结合使用。
荧光团可以是，如异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITL)、别藻蓝素(APC)、德克萨斯红、Cy5、Cy3或R-藻红素(RPE)，这在本领域是熟知的。
为了更加详尽地理解本发明，技术人员可以参考如下非限制性的实施例。
实施例
实施例1鉴定HXGPRT是约氏疟原虫中的免疫原
1.材料与方法
小鼠
4-6周龄的正常BALB/c小鼠、无胸腺BALB/c裸鼠和BALB/c SCID小鼠购自Animal Resources Center(Perth，WA，澳大利亚)，并在无特异性病原体条件(specific-pathogen-free)下饲养在QIMR的动物装置(animalfacility)中。到了6-8周龄时被用于试验。
寄生虫
啮齿类疟原虫约氏疟原虫17XNL通过腹膜内路径(i.p)在被感染和未被感染的小鼠之间进行106寄生虫感染的红细胞(pRBC)/小鼠的交替传代来维持。在传代3或4次后，然后稳定的寄生虫被冷冻和保存在液氮中。冷冻保存物在用于试验性攻击感染前进行三次交替传代。从心脏穿刺和断尾获得的血液中收集寄生虫，并用于制备寄生虫抗原和薄层血液涂片来确定寄生虫血症。
寄生虫血症的确定
通过断尾从被感染的小鼠收集一滴血液，制备载玻片上的薄层血液涂片。风干涂片并用Diff-Quick染色试剂(Lab Aids Pty Ltd，Narrabeen，澳大利亚)染色。总共计数约300-500红细胞(RBC)来估计寄生虫血症百分率；但是计数至少103RBC来确定小于或等于1％的寄生虫血症。
制备寄生虫抗原
制备完整寄生虫抗原(pRBC)
当寄生虫血症在30-50％之间时，通过心脏穿刺将被感染小鼠的血液收集到抗凝的无菌试管中。然后在温热的PBS中洗涤血液，并确定pRBC的浓度。然后PBS中的pRBC立即用于感染小鼠或者通过37℃下在红细胞溶解缓冲液(0.17M tris-羟甲基氨基甲烷、0.16M氯化铵；pH7.2)中，温育10min来裂解pRBC。然后寄生虫至少冷冻-解冻3次，超声波处理、等分试样，并在-70℃下保存直到被用于体外细胞培养。
制备可溶性寄生虫抗原(sAg)
当寄生虫血症在50-60％之间时，通过心脏穿刺将血液收集到抗凝试管中。然后血液在PBS中洗涤两次。存在蛋白酶抑制剂时，37℃下在0.01％皂角苷/PBS中温育血液20min来溶解RBC。然后在pRBC用4℃的冷PBS超声波处理之前，用皂角苷/PBS缓冲液再洗涤血液一次。
在超声波处理后，溶解产物在4℃下以100,000xg离心30min。然后收集上清液，在4℃下更换PBS三次来透析。蛋白质浓度通过二喹啉甲酸分析确定，寄生虫抗原在-70℃下保存直到使用。
体外生成T细胞系
用50ul乳化在完全Freund佐剂(CFA)(Sigma，St.Louis，MO，美国)中的抗原在后脚掌皮下免疫小鼠。7-10天后，在无菌条件下将腹股沟和腿弯部的淋巴结收集到Eagle′s minimal essential medium with Earle′s Salts(EMEM)(Trace，Biosciences，澳大利亚)中。然后如先前描述(Amante &Good，1997)，采用刺激和静止交替循环来制备细胞系。
淋巴细胞增殖分析
静止期后，取出T细胞悬浮液，与被照射的不含RBC的同基因型脾细胞混合(1∶3)，在96平孔的微量滴定板(Corning Incorporated，Corning)以2×106细胞/ml完全培养液，在含有5％CO2的湿润培养箱中37℃下培养4天。细胞在仅培养液(阴性对照)、结核菌素纯化蛋白质衍生物(PPD)(CSL Ltd，Parkville，VIC，澳大利亚)或伴刀豆球蛋白-A(con-A)作为阳性对照、或各种浓度检测抗原的三个或四个孔中，来评价在24、48和/或72h时的增殖和/或培养上清液中的细胞因子含量。
通过对用0.25uCi/孔3H-胸苷(Amersham Biotech，UK)培养至少16-18h进行脉冲调制来测定增殖，将各个孔中的内含物收集到玻璃纤维薄毡(glass fiber mat)上，风干后用平板闪烁计数器测定3H-TdR的结合。
过继转移和感染治疗方案
在静止期收集的活T细胞通过在Ficoll-Hypaque(Pharmacia)中离心来纯化。在EMEM中以300xg RT洗涤后，细胞再悬浮在PBS中，200ul含有适当数量细胞通过侧面尾静脉被静脉注射灌注到各种免疫缺乏的小鼠中。灌注后24h，通过105pRBC/小鼠静脉注射感染来体内扩增T细胞。两天后，用乙嘧啶腹膜内处理小鼠3天(剂量：0.2mg/0.2ml PBS/小鼠/天)。在攻击感染(105pRBC/小鼠)之前，重复感染-治疗方案循环，然后测定寄生虫血症和血清。再感染之前，小鼠有3周的间隔期来完全代谢药物。
细胞因子ELISA
从细胞培养物中收集上清液，立即分析或者等分并冷冻保存在-70℃下直到使用。根据Sander等(1993)的方法，通过酶联免疫分析测定IL-4和IFN-，分别使用重碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)中的单克隆抗体BVD4-1D11(5ug/ml)和R4-6A2(2ug/ml)(PharMingen，San Diego，USA)在37℃下包被96-U型孔平板2h。然后连续滴定未稀释的上清液，平板包裹在铝铂中，室温下(RT)在湿润的培养箱中温育过夜。
洗涤平板6次，每次顺序在0.05％Tween-20/PBS、PBS和水中，轻拍干燥。加入含有生物素酰化BVD6-24G2克隆抗小鼠IL-4(1∶2000)或XMGl.2大鼠抗小鼠IFN(1.0ug/ml)(PharMingen)单克隆抗体的阻断缓冲液(0.05％Tween-20、1％FCS、0.1％脱脂奶粉溶解在PBS中)，室温下温育平板2h。洗涤后，加入链霉抗生物素-HRP-偶联剂(Vector，Burlingame，CA，USA)(1∶1600)来检测，接着在加入酶底物2，2-azinobis3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid(ABTS)(Sigma)之前，在室温下再温育2h。在415nm下读取吸收值，以1h后490nm的值为参照。重组细胞因子(IL-4和IFN；Sigma)和完全培养液分别作为阳性和阴性对照。超过阴性对照值至少3个SD的定义为阳性上清液。阳性对照被用于建立滴定曲线。
细胞内的细胞因子染色
活的静止T细胞系通过Ficoll Paque(Pharmacia Biotech)离心纯化，再悬浮在完全培养液中。然后按照生产商的说明，在存在莫能菌素(monensin)(GolgiStopTM，PharMingen)时，37℃下在含有5％CO2的湿润培养箱中用40ng/ml乙酸肉寇佛波醇(PMA)(Sigma)和2uM钙离子载体(Sigma)刺激6h。细胞在FACS缓冲液(0.1％BSA，0.1％叠氮化钠/PBS)中以300xg，4℃洗涤5min两次，在黑暗中冰浴上用1∶50 FITC-偶联的大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体(Mab)(Caltag Laboratories，Burlingame，CA，USA)以2×107细胞/ml FACS缓冲液染色30min。洗涤两次后，细胞充分地再悬浮，并4℃下在冰冷的4％多聚甲醛中固定30min。洗涤两次，细胞进一步被固定，并按照生产商的说明，4℃下在cytofix/cytospermTM(PharMingen)中温育20-30min来渗透。细胞在渗透缓冲液中洗涤两次，以2×107细胞/ml cytofix/cytospermTM再悬浮，并且约106个细胞分散到FACS管中。细胞在4℃下黑暗中染色30min，分别用1∶50 PE-偶联的大鼠抗小鼠IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4单克隆Mab(PharMingen)来染色IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4。作为对照，采用未染色的细胞样本和PE标记的非特异性IgGl和IgG2b Mab(PharMingen)。在渗透缓冲液中洗涤两次后，细胞再悬浮在200ul FACS缓冲液中，用于直接流动细胞计数评价。
用装备了CELLQuestTM软件的FACScalibur流动细胞计数器(BectonDickinson，CA，USA)测定荧光。对于各种细胞因子，计数10,000个细胞，在修正自身荧光和非特异荧光后，确定阳性细胞的比例。
细胞表面表型分析
染色细胞来确定表面表达如下分子：CD3、CD4、CD8、CD25、CD19、NK1.1、TCR和/或TCR，如先前的描述(Xu等，2000)。
免疫接种和攻击感染
3-5只小鼠的组用乳化在完全Freund佐剂(CFA)(Sigma)中的抗原在后脚掌上皮下注射免疫接种。在4和6周后，用相同含量的乳化在不完全Freund佐剂(IFA)(Sigma)中的抗原腹部皮下和腹腔内注射来加强免疫。与佐剂混合的PBS作为对照抗原。
最后一次免疫的10天后，小鼠用约氏疟原虫17XNL寄生虫感染的RBC进行静脉注射攻击。
ELISA血清分析寄生虫特异性抗体
如先前描述进行(Xu等，2000)。
考马斯染色凝胶中的蛋白质
通过在0.5％w/v考马斯兰溶液(含有25％v/v甲醇，10％v/v乙酸)中温育凝胶1h并缓慢地搅动来染色SDS-PAGE分离的蛋白质。然后变换三次脱色液(具有相似成分但是没有考马斯兰染料的溶液)来脱色凝胶过夜。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
Laemmli(1970)描述的标准方法略加改进。凝胶用丙烯酰胺：二丙烯酰胺(29∶1)浸泡。蛋白质样本与样本缓冲液(200mM Tris，pH6.8；30％v/v甘油，6％w/v SDS，0.2％w/v溴酚兰)混合(4∶1)，并且装载前在95℃下温育5min。当需要还原蛋白质时，往样本缓冲液中加入p-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。装载后，凝胶以恒定电压(60V)电泳约1.5h。然后以Rabilloud等(1988)的方法用考马斯亮兰R-250(Sigma)染色或银染来可视化蛋白质。
制备等电聚焦(IEF)来分级可溶性寄生虫蛋白质
在Multiphor IITM(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala)上按照生产商的说明制备宽范围(WR)和窄范围(NR)的等电聚焦(IEF)。简而言之，按照生产商的说明，Zwittergent3-12可溶性材料在宽范围的等电聚焦(WR-IEF)上分离。也就是，将18ml AmpholineTM pH3.5-10.0(AmershamPharmacis Biotech，Uppsala)和1.35g Zwittergent3-12与MQW混合到最终体积，逐步加入16.0g UltrodexTM粒状凝胶(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala)来充分地膨胀。制备平床凝胶(19cm×24cm×0.5cm深)，IEF在12W和10℃下预聚焦1500Vh。1.36ml Ampholine pH3.5-10.0和约1.0gUltrodex TM粒状凝胶与19.0ml Zwittergent3-12可溶性物质结合。在低pH端(最终pH范围～4.0-4.3)将样本装载到预聚焦的IEF凝胶上，在12W和10℃下聚焦1200Vh。接着进行电泳，级份用2ml含有0.2％Zwittergent3-12和50μM AEBSF的MQW洗脱2次。记录各个级份的pH，并用1.0ml的1.0M Tris-HCl pH-7.4的缓冲液调节样本pH为7.4。在SDS-PAGE上显示IEF级份的蛋白质成分。
从SDS-PAGE凝胶上被动洗脱蛋白质
考马斯染色的凝胶在水中洗涤30min。将凝胶放置在玻璃平板上，用无菌解剖刀将单条带切成小立方体，然后将它们放入含有提取缓冲液(100mM乙酸钠、0.1％SDS、10mM DTT)的试管中，在37℃下温育过夜。收集上清液，并通过SDS-PAGE分析来确定纯度，随后转移到PVDF膜上。
PVDF膜电印迹和N末端测序
在SDS-PAGE上分离蛋白质并用电泳池Multiphor IITM(AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)印迹到PVDF膜上，以225毫安(1毫安/cm2)通过预先浸泡在印迹缓冲液(0.02％w/v SDS、0.3％w/v糖胶、0.15％v/v乙醇胺)的印迹纸1.25h。然后在水中洗涤该纸，接着在甲醇中洗涤，再用考马斯兰(0.05％w/v考马斯兰、40％v/v甲醇、1％v/v乙酸)染色5min。然后更换三次50％v/v甲醇来脱色PVDF膜5min，接着在水中洗涤两次。将膜放在37℃培养箱中干燥，切取期望的条带，通过Edman降解法(Edman and Begg，1967)在N末端的氨基酸测序仪(Procise-HTTM；Applied Biosystems，Fostercity，CA，USA)上测序。
2.结果
制备约氏疟原虫感染的RBC的可溶性制备物，然后根据电荷(charge)将其分馏成30个级份，分组成12集合(A-L)。然后将这些各种级份乳化在完全Freund佐剂中，被用于免疫小鼠。8天后，取出引流(Draining)淋巴结，接着连续循环抗原刺激和静止，生成多克隆T细胞系。仅在E、F和J成功地建立细胞系。检测该细胞系对各个级份、可溶性寄生虫制备物和寄生虫感染的RBC的应答能力。被证实抗原特异性(图1A)和表达CD3、CD4和αβT细胞受体和生成细胞因子(IL2、IFN-γ、TNF-α，但不是IL4)的细胞系统一称为“Th1”或促炎细胞(图1B)。然后将细胞系施用给无胸腺的裸BALB/c小鼠，然后用活寄生虫感染攻击小鼠。基于这些结果，选择被证明最有效的抗寄生虫活性的细胞系用于进一步的分析(级份F细胞系)。但是，应当指出，如同其他细胞系的受体，级份F特异性T细胞的受体在攻击后死亡(低寄生虫血症)。
因此，调整试验操作来使细胞在最后攻击前在宿主中成熟更长的时间。有证据表明，对疟原虫的天然免疫应答随时间而变化，这与较少病理学相关(Brown et al，1990；Langhorne et al，1989；Baird，1995)。虽然疟原虫特异性T细胞系是否会变化是未知的，但是可能细胞数量会改变，并且其在整个受体宿主内的分布将会变化成更加有效的结构。因此，T细胞被施用给免疫缺乏的BALB/c SCID小鼠(缺乏T细胞和B细胞)，然后小鼠暴露于两次感染，攻击后2天用抗疟疾的化学疗法来降低感染，两次感染之间间隔3周。选用SCID小鼠，使得随后产生任何保护作用是来自被感染的T细胞。对照小鼠不接受T细胞或接受特异于不相关抗原卵清蛋白(OVA)的T细胞，它们具有相同表型特征(CD4+、Th1)。在两次感染后，然后小鼠接受不用化学治疗消弱的最后攻击。接受OVA特异性T细胞的SCID小鼠都死于与天然小鼠相似攻击的时间。但是，五只接受F级份特异性的T细胞的小鼠中有两只存活，所有的受体被证实在整个感染中具有显著低的寄生虫密度(图2)。有意思的是，接受F-特异性T细胞的小鼠存活的比接受特异于完整寄生虫的T细胞的小鼠多。
为了确定保护性T细胞系的抗原特异性，级份F以及具有相似pI的邻近级份通过窄范围等电聚焦(pH5-7)来分级，随后根据大小在SDS-PAGE上对蛋白质分级。然后选择17个单独的条带用于进一步研究(图3)。接着进行两种方法，在第一种方法中(A)，通过用各个条带免疫天然小鼠来制备新的T细胞系，然后用级份F体外扩增细胞。然后检测这些新的T细胞系的体外特异性和体内功效(如上述)。在第二种方法中(B)，特异于级份F的T细胞被施用给SCID小鼠，该小鼠接着用各个条带免疫。然后用活的感染物来攻击小鼠。这两种方法的结果示于图4中，从中可以看出在两种方法中，特异于条带16的T细胞能够减缓体内寄生虫的生长，并在方法A和B分别100％和50％地保护受体。
具有相似的分子量的两个分离条带(“16”)，然后每个与保护作用相关的条带被测序，采用N末端氨基酸测序的Edman降解法，得到如下序列：MKIPNNPGAGELGYEPVMI(SEQ ID NO：49)和MKIPN(SEQ IDNO：50)。从疟原虫数据库的检索中，确定这些序列存在于嘌呤拯救酶、次黄嘌呤鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGXPRT)中。重组的恶性疟疾HGXPRT是可以获得的(Keough et al，1999)并检测其激活保护性条带特异性T细胞的能力。这些结果(图5A)表明保护性T细胞在体外不对重组蛋白应答。
然后用重组恶性疟疾HGXPRT免疫正常的BALB/c小鼠，然后活的感染物攻击。对照小鼠用OVA或PBS免疫，采用相同的佐剂配方和呈递方案。在攻击后8天，被免疫的小鼠的平均寄生虫血症是3.6％，相比于OVA免疫的小鼠的43.2％(P＜0.0001)和PBS-免疫的小鼠的47.8％(P＜0.001)。五只HGXPRT免疫的小鼠中的两只能够完全地抵制感染。ova-免疫的小鼠和PBS免疫的小鼠之间没有差异(P＝0.545)。
本研究确定嘌呤拯救酶、HGXPRT作为保护性T细胞的靶点抗原。T细胞的功效不同于抗体，通过T细胞适应性地将抗性转移到SCID小鼠中。用HGXPRT免疫正常小鼠，必然地引起抗HGXPRT的抗体应答，但是由于该酶位于裂殖子膜的内表面(Shahabuddin et al，1992)，难以想象这些抗体能够对寄生虫生长产生作用。转化SCID小鼠的HGXPRT-特异性T细胞和免疫的正常小鼠的HGXPRT在所有受体中控制寄生虫生长的能力似乎是由于激活的CD4+T细胞介导的作用而产生。确切地说，寄生虫特异性CD4+T细胞如何控制寄生虫生长是未知的，但是许多研究已经证明，这种T细胞(具有未知特异性)能够控制寄生虫生长(Brake et al，1988；Taylor-Robinson et al，1993；Amante & Good，1997)，并且许多研究表明IFN-γ和TNF-α下游的炎症介质如一氧化氮(Taylor-Robinson et al，1993；Rockett et al，1991)和可能氧自由基(Clark & Hunt，1983；Wozencraft et al，1984)是重要的。
人中的这些免疫性表现为诱导寄生虫特异性Th1-型T细胞应答和上调可诱导的一氧化氮合酶，但是完全缺乏任何可测定的抗体应答。在树枝状细胞加工抗体后，T细胞可以被寄生虫抗原激活，但是来自被激活的T细胞的效应分子和巨噬细胞可能在RBC和脾中杀死寄生虫(Favila-Castillo et al，1996)。因此，细胞激活是特异性的，但是效应子的功能是非特异性的。激活寄生虫特异性T细胞的副作用可能是免疫病理学的(Hirunpetcharat et al，1999)，这可能解释了既便在所有小鼠中寄生虫浓度显著降低时，并非所有接种的或T细胞灌注的受体都存活的原因。
本发明人已经研究特异于裂殖子表面蛋白片段MSP119的T细胞是否能够保护小鼠(Tian et al，1998)。尽管事实上MSP119能够产生高水平的保护作用，结果一致地是否定的。这种保护作用在攻击时依赖于高抗体滴度。令人好奇的是，非保护性的MSP119特异性T细胞具有与本试验中研究的HGXPRT特异性保护性T细胞相同的表型特征(CD4+，Th1)。由于T细胞仅识别被加工后的抗原，具有一种特异性的T细胞具有保护作用而具有不同特异性的T细胞不具有保护作用的原因是不清楚的。一种可能的解释停留在抗原定位。HGXPRT存在于裂殖子的电子密集颗粒中，这些颗粒类似于高等真核细胞的分泌颗粒，HGXPRT还存在于被感染的红细胞的细胞质中和寄生泡的外部(Shahabuddin et al，1992)。可能抗原沉积在红细胞的细胞质中，抗原丰度在激活的效应子T细胞中是关键因素。
如果保守分子如HGXPRT能够诱导降低寄生虫密度的T细胞，那么至于在初次暴露后在小孩不能较快地产生天然免疫的原因也是奇怪的。通常需要5年地方性暴露来产生临床免疫性(Greenwood et al，1987)。不过，具有这种特异性的T细胞产生一定程度免疫性是可能的。还值得指出的是，已知寄生虫感染会导致人单核细胞(Toure-Balde et al，1996)的凋亡和甚至啮齿类系统中体内的寄生虫特异性CD4+T细胞的凋亡(Hirunpetcharat & Good，1998)。因此，人T细胞对HGXPRT的应答可能被感染抑制，不能自然地产生；但是对于这种人的T细胞应答是一无所知的。本发明人认为T细胞免疫性的这种抑制可能会导致目标抗原被保守，降低免疫压力来选择变体或多态性序列(Good，2001)。
HGXPRT是设计寄生虫疫苗中考虑的新免疫原，是疫苗开发的新途经。HGXPRT抗原单独地用作免疫原，或者作为一种与其他疫苗分子连接或混合的理想成分，目前所有这些成分被设计来刺激保护性抗体应答。与单一地添加变体抗原来扩展一种免疫应答类型的特异性相反，通过增加其他类型的免疫应答，很可能将极大地提高开发一种成功疫苗的机会。
实施例2绘制HGXPRT的T细胞表位
实施例1中数据已经确定疟原虫HGXPRT可能在调节预防疟疾感染中起作用。由于哺乳动物也表达HGXPRT，哺乳动物的HGXPRT与寄生虫HGXPRT十分同源(图6)，重要的是确定蛋白质的最小非同源区域，其可能是保护性T细胞的靶点。这些区域可能被用作疟疾疫苗候选。
至此，横跨HGXPRT的24种线性重叠肽被设计来定义含有保护性T细胞表位的蛋白质区域(图7)。各种品系的小鼠用全长的恶性疟原虫HGXPRT蛋白(PfHGXPRT)或者来自PfHGXPRT的肽集合免疫，来确定产生增殖的T细胞应答的蛋白质区域。在此之后，这些区域(对应于肽)随即被用于免疫小鼠来确定相应的T细胞是否能够保护小鼠免受疟疾感染。不同的H-2同品系小鼠(近交系小鼠，仅缺乏MHC基因)被用于这些试验，来确定MHC基因在影响对该蛋白质的免疫应答中的作用。
1.方法
淋巴细胞增殖分析
小鼠用肽集合(20ug各种肽)或者乳化在完全Freunds佐剂(CFA)中的15ug重组PfHGXPRT蛋白在后脚掌免疫。7到9天后，取出引流的腿弯部和腹股沟的淋巴结。制备细胞并以2×106细胞/ml悬浮在溶液中，并被加到96孔的平板中。37C、5％CO2下用各种浓度抗原或分裂素培养细胞72h。往平板中加入(3H)-胸苷，并在18-24h后通过β-发射光谱测定放射性标记的结合。
肽合成
如所述(Houghten，1985)，采用茶叶袋技术通过QIMR肽单位来合成肽。
肽免疫接种和攻击操作
按照如下操作，用PfHGXPRT肽免疫小鼠。20ug的各种肽被乳化在CFA中，并在第0天被皮下输入。然后在第21天，用不完全Freund佐剂(IFA)中20ug各种肽加强(皮下注射)小鼠，并在第42天和第56天腹膜内加强。然后在第71天，用1×104柏格氏鼠疟原虫或约氏疟原虫17XNLpRBC攻击小鼠。在攻击后的每两天从尾部采集血液样本来确定寄生虫血症(寄生虫化的红细胞，pRBC的数量)。
2.结果
如在此所用，方便起见，肽1-24对应于SEQ ID NO：1-24。
参照图6-8，取自用PfHGXPRT免疫的BALB/c小鼠的淋巴结细胞在体外对大量来自PfHGXPRT的肽产生应答。最显著的增殖反应是对肽6、7、8、9、10、11、12、15、17、18、21、22、23和24的反应。基于这些结果，对应于上述肽的rPfHGXPRT区域可能含有被BALB/c(H-2d)小鼠识别的T细胞表位。还存在对被恶性疟原虫和不同啮齿类疟原虫感染(柏格氏鼠疟原虫、P.chabaudi AS、约氏疟原虫YM、约氏疟原虫17XNL和P.vinckei)的红细胞的反应，表明不同疟原虫表达的之间具有一定程度的同源性。
在图9A中，来自用肽1-8的集合免疫的小鼠的淋巴结细胞显示对肽3和8的强烈增殖反应。观察到对肽6和7的低水平增殖。参见图9B，来自用肽9-16的集合免疫的小鼠的淋巴结细胞显示对肽12和16的强烈增殖反应。观察到对集合中的所有其他肽的较低水平增殖。来自用肽17-24的集合免疫的小鼠的淋巴结细胞显示对肽17和21的强烈增殖反应(图9C)。观察到对肽22的较低水平增殖。总之，PfHGXPRT中对应于上述肽的区域含有被B10.BR(H-2k)小鼠识别的T细胞表位。
来自用不同肽集合免疫的小鼠的淋巴结细胞不仅对于用恶性疟原虫感染红细胞(RBC)，而且对不同啮齿类疟原虫感染的RBC具有不同增殖水平(图10)。这表明不同种类的HGXPRT之间可能具有序列同源性。但是，来自用CS9-16免疫的小鼠的细胞对用约氏疟原虫和P.vinckei感染的细胞的反应显著高于正常小鼠RBC。
用柏格氏鼠疟原虫ANKA感染的天然小鼠通常死于称作脑型疟疾的疾病综合症。用肽16或17免疫的小鼠具有类似于用PBS免疫的小鼠的寄生虫血症(或脑型疟疾)的进程。但是，从图6中看出，用肽21或肽16、17和21的集合免疫的小鼠免受与柏格氏鼠疟原虫感染相关的致死性大脑症状。这些数据表明，疟原虫酶HGXPRT的区域(肽21和肽16、17和21的组合)已经被确定，其含有能够在B10.BR小鼠中产生抗柏格氏鼠疟原虫ANKA寄生虫的保护性免疫应答的T细胞表位。
从用收集的肽CS1-8免疫的小鼠获得的淋巴结细胞具有对肽3、6和7的强烈的增殖反应(图12A)。观察到对肽8的低水平增殖反应。从用收集的肽9-16免疫的小鼠获得的淋巴结细胞具有对肽9、10、11和16的强烈的增殖反应。观察到对肽13和15的低水平增殖反应(图12B)。对于12C，从用收集的肽17-24免疫的小鼠获得的淋巴结细胞具有对肽17、18和24的强烈的增殖反应。总之，对应于具有增殖反应的上述肽的PfHGXPRT区域含有被BALB/c(H-2d)小鼠识别的T细胞表位。
从图13中可以明显地看出，从用不同的肽的集合免疫的BALB/c小鼠获得的淋巴结细胞不仅对用恶性疟原虫感染的红细胞(rbc)，而且对于用不同的啮齿类的疟原虫感染的rbc具有不同增殖水平。这表明在不同种类中，可能存在HGXPRT的序列同源性。
在图14中，虽然一只来自各组的小鼠受攻击时死亡，肽1、17或21以治疗性方式起作用，给受约氏疟原虫17XNL攻击的小鼠带来一定程度保护作用。收集的肽9、10和11以及收集的肽1、9、10、11、17和21不能使小鼠免受约氏疟原虫17XNL的致死性攻击。这些数据表明疟原虫酶HGXPRT的区域(肽1、17和21)已经被确定含有能够在BALB/c小鼠中产生抗约氏疟原虫17NXL寄生虫的保护性免疫应答的T细胞表位。
在图15中，用肽1，收集的肽9、10和11，肽17，收集的肽1、9、10、11、17和21免疫的小鼠免受与柏格氏鼠疟原虫ANKA感染的致死性脑部症状。这些肽能够产生抗病的免疫应答。用肽21免疫的小鼠和用PBS免疫的对照小鼠不被保护，受攻击时死亡。这些数据表明疟原虫酶HGXPRT的区域(肽1、17，肽9、10、11的组合以及肽1、9、10、11、17和21的组合)被确定，含有能够在BALB/c小鼠中产生抗柏格氏鼠疟原虫ANKA寄生虫的保护性免疫应答的T细胞表位。
在进一步试验中，目的在于研究MHC限制性，BALB/b小鼠(H-2b)对肽1、7、8、10、15、17、18、19、20、21、22、23和24应答；B10小鼠(H-2b)对肽4、5、6、7、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24应答；B10.D2小鼠(H-2d)对肽1、2、3、4、7、8、9、10、11、15、16、17、18、22和24应答；BALB/c小鼠(H-2d)(参见图12)对肽3、6、7、8、9、10、11、13、15、16、17、18和24应答；BALB/k小鼠(H-2k)对肽3、4、5、6、7、8、12、15、16、17、21和22应答；和B10.BR小鼠(H-2k)对肽3、6、8、10、11、12、15、16、17、21和22应答。
本发明得出，MHC基因可能影响对一些衍生自HGXPRT的肽的免疫应答。MHC之外的区域也可能起作用。对此还需要进行进一步工作来澄清。
此外，来自用不同肽集合免疫的BALB/k小鼠、B10小鼠、B10.D2小鼠和BALB/b小鼠的淋巴结细胞不仅对受恶性疟原虫感染的红细胞(rbc)，而且对受不同啮齿类疟原虫感染的rbc具有不同增殖水平。这表明在不同种类之间可能具有HGXPRT的序列同源性。
总结
用衍生自恶性疟原虫的HGXPRT的重叠肽进行试验，各种品系的近交小鼠已经确定了作为T细胞靶点的HGXPRT的区域。此外，已经证明这些蛋白的小区域(对应于特定的肽)产生能够控制被检测的啮齿类寄生虫株(约氏疟原虫17XNL和柏格氏鼠疟原虫ANKA)的生长和与啮齿类疟疾感染相关的疾病症状的免疫应答。对应于肽CS17和CS21的区域能够在多种小鼠品系中产生抗不同啮齿类寄生虫的免疫应答，是特别有意义的。这些肽被认为是疟疾疫苗的候选。
在整个说明书中，目的在于描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制在任何一种实施方案或特定的特征组合。在不脱离本发明的广阔的精神和范围的前提下，可以对在此所描述和阐明的实施方案进行各种改变和修正。
在本说明书中参考的所有计算机程序、算法、专利和科技文献在此全文引入作为参考。
参考文献：
Freeman RR，Parish CR.Plasmodium yoelii：antibody and the maintenance ofimmunity in BALB/c mice.Exp Parasitol.1981 Aug；52(1)：18-24.
Grun JL，Weidanz WP.Antibody-independent immunity to reinfection malariain B-cell-deficient mice.Infect Immun.1983 Sep；41(3)：1197-204.
Brake DA，Long CA，Weidanz WP.Adoptive protection against Plasmodiumchabaudi adami malaria in athymic nude mice by a cloned T cell line.JImmunol.1988 Mar 15；140(6)：1989-93.
Seixas EM，Langhorne J.gammadelta T cells contribute to control of chronicparasitemia in Plasmodium chabaudi infections in mice.J Immunol.1999Mar 1；162(5)：2837-41.
Good，M.F.Towards a blood stage vaccine for malaria：Are we following allthe leads？Nature Rev.Immunol.1：117-125，2001.
Brown AE，Webster HK，Teja-Isavadharm P，Keeratithakul D.Macrophageactivation in falciparum malaria as measured by neopterin andinterferon-gamma.Clin Exp Immunol.1990 Oct；82(1)：97-101.
Langhorne J，Gillard S，Simon B，Slade S，Eichmann K.Frequencies of CD4+T cells reactive with Plasmodium chabaudi chabaudi：distinct responsekinetics for cells with Th1 and Th2 characteristics during infection.IntImmunol.1989；1(4)：416-24.
Baird JK.Host age as a determinant of naturally acquired immunity toPlasmodium falciparum.1995.Parasitol Today 11：105-111.
Keough DT，Ng AL，Winzor DJ，Emmerson BT，de Jersey J.Purification andcharacterization of Plasmodium falciparum hypoxanthine-guanine-xanthinephosphoribosyltransferase and comparison with the human enzyme.MolBiochem Parasitol.1999 Jan 5；98(1)：29-41.
Shahabuddin M，Gunther K，Lingelbach K，Aikawa M，Schreiber M，RidleyRG，Scaife JG.Localisation of hypoxanthine phosphoribosyl transferase in themalaria parasite Plasmodium falciparum.Exp Parasitol.1992 Feb；74(1)：11-9.
Brake DA，Long CA，Weidanz WP.Adoptive protection against Plasmodiumchabaudi adami malaria in athymic nude mice by a cloned T cell line.JImmunol.1988 Mar 15；140(6)：1989-93.
Taylor-Robinson AW，Phillips RS，Severn A，Moncada S，Liew FY.The role ofTH1 and TH2 cells in a rodent malaria infection.Science.1993 Jun 25；260(5116)：1931-4.
Amante FH，Good MF.Prolonged Th1-like response generated by aPlasmodium yoelii-specific T cell clone allows complete clearance ofinfection in reconstituted mice.Parasite Immunol.1997 Mar；19(3)：111-26.
Rockett KA，Awburn MM，Cowden WB，Clark IA.Killing of Plasmodiumfalciparum in vitro by nitric oxide derivatives.Infect Immun.1991 Sep；59(9)：3280-3.
Clark IA，Hunt NH.Evidence for reactive oxygen intermediates causinghemolysis and parasite death in malaria.Infect Immun.1983 Jan；39(1)：1-6.
Favila-Castillo L，Monroy-Ostria A，Kobayashi E，Hirunpetcharat C，KamadaN，Good MF.Protection of rats against malaria by a transplanted immunespleen.Parasite Immunol.1996 Jul；18(7)：325-31.
Hirunpetcharat C，Finkelman F，Clark IA，GoodMF.Malaria parasite-specificTh1-like T cells simultaneously reduce parasitemia and promote disease.Parasite Immunol.1999 Jun；21(6)：319-29.
Tian JH，Good MF，Hirunpetcharat C，Kumar S，Ling IT，Jackson D，Cooper J，Lukszo J，Coligan J，Ahlers J，Saul A，Berzofsky JA，Holder AA，Miller LH，Kaslow DC.Definition of T cell epitopes within the 19 kDacarboxylterminalfragment of Plasmodium yoelii merozoite surface protein 1(MSP1(19))andtheir role in immunity to malaria.Parasite Immunol.1998 Jun；20(6)：263-78.
Greenwood BM，Bradley AK，Greenwood AM，Byass P，Jammeh K，Marsh K，Tulloch S，Oldfield FS，Hayes R.Mortality and morbidity from malariaamong children in a rural area of The Gambia，West Africa.Trans R SocTropMed Hyg.1987；81(3)：478-86.
Toure-Balde A，Sarthou JL，Aribot G，Michel P，Trape JF，Rogier C，Roussilhon C.Plasmodium falciparum induces apoptosis in humanmononuclear cells.Infect Immun.1996 Mar；64(3)：744-50.
Hirunpetcharat C，Good MF.Deletion of Plasmodium berghei-specific CD4+T cells adoptively transferred into recipient mice after challenge withhomologous parasite.Proc Natl Acad Sci USA.1998 Feb 17；95(4)：1715-20.
Sander B，HoidenI，Andersson U，Moller E and Abrams JS(1993)：Similarfrequencies and kinetics of cytokine producing cells in murine peripheralblood and spleen.Cytokine detection byimmunoassay and intracellularimmunostaining.J ImmunolMethods 166(2)：201-14.
Laemmli UK(1970)：Cleavage of structural proteins during the assembly ofthe head of bacteriophage T4.Nature 227(259)：680-5.
Dainese P，Hoyer-Hansen G and Bassi R(1990)：The resolution ofchlorophyll a/b binding proteins by a preparative method based on flat bedisoelectric focusing.Photochem Photobiol 51(6)：693-703.
Edman P and Begg G(1967)：A protein sequenator.Eur J Biochem 1(1)：80-91.
Narum DL，Kumar S，Rogers WO，Fuhrmann SR，Liang H，Oakley L，Taye A，Sim BK and Hoffman SL(2001)：Codon optimization of gene fragmentsencoding Plasmodium falciparum merozoite proteins enhances DNA vaccineproteinexpression and immungenicity in mice.，Infect.Immun.69(12)：7250-3.
Kumar S，Epstein JE，Richie TL，Nkrumah FK，Soisson L，Carucci DandHoffman SL(2002)：A multilateral effort to develop DNA vaccines againstfalciparum malaris.Trends Parasitol.18(3)：129-35.
Doolan DL & Hoffman SL(2001)：DNA-based vaccines against malaria：status and promise of the Multi-Stage Malaria DNA Vaccine Operation.Int.J.Parasitol.31(8)：753-62.
Boyle et al(1998)：Nature 393：408-411.
Houghten，R.A.(1985)General method for the rapid solid-phase synthesis oflarge numbers of peptides：specificity of antigen-antibody interaction at thelevel of individual amino acids，Proc Natl Acad Sci USA，82(15)，pp.5131-5135.
Dressel A，Chin JL，Sette A，Gausling R，Hollsberg P，Hafler DA.(1997)Autoantigen recognition by human CD8 T cell clones：enhanced agonistresponse induced by altered peptide ligands.J Immunol.159(10)pp.4943-4951.
Michielin et al.(2000).Modeling of the TCR-MHC-peptide complex.J.Mol.Biol.300(5)PP 1205-1235.
Hanke T，Schneider J，Gilbert SC，Hill AV，McMichael A(1999)DNAmulti-CTL epitope vaccines for HIV and Plasmodium falciparum：immunogenicity in mice.Vaccine 16(4)pp.426-35.