一种麻竹遗传转化和植株再生的方法技术领域
本发明涉及植物组织培养和遗传转化方法，具体涉及一种由花药诱导且具有再生能力愈伤组织为基因受体材料，进行农杆菌的遗传转化，进而产生转基因植株的方法。
背景技术
麻竹(Dendrocalamus latiflorus Munro)为禾本科竹亚科牡竹属麻竹亚属，原产中国，自然分布于福建、台湾、广东、广西、贵州和云南等省，是我国华南及东南沿海地区重要的优良、速生、笋材两用的大型丛生竹种之一。麻竹很少开花，品种选育主要以自然界优良无性系选育为主，遗传改良受到限制。由于麻竹组织培养很难获得再生植株，制约了通过遗传转化在麻竹上的应用。最近，通过不断实验探索，麻竹组织培养再生植株技术有了突破，由花药诱导得到的胚性愈伤组织，可直接分化成为再生植株，为麻竹的遗传转化奠定了基础。以具有良好再生植株能力的胚性愈伤组织为基因受体材料，通过农杆菌介导的遗传转化再生体系具有方法简单，可靠性高，易操作的特点，为麻竹的遗传改良开辟了新途径。
发明内容
本发明提供了一种麻竹(Dendrocalamus latiflorus Munro)组织培养和遗传转化方法，通过麻竹花药诱导胚性愈伤组织，并以此进行农杆菌介导，从而获得转基因植株，涉及植物组织培养和遗传转化方法领域。主要步骤包括：麻竹花药的收集和预处理、胚性愈伤组织的获得、质粒构建和农杆菌培养、农杆菌侵染、麻竹胚性愈伤组织筛选及分化、植株再生与炼苗移栽。基本过程如下：
步骤1.采集麻竹未成熟花药，诱导愈伤组织，获得基因受体材料；
步骤2.构建目的基因载体中并导入到农杆菌中，获得单克隆并进行培养；
步骤3.农杆菌侵染；
步骤4.麻竹胚性愈伤组织筛选与分化；
步骤5.麻竹植株再生与炼苗移栽。
所述步骤1操作方法如下：
麻竹花药应选择小孢子的发育时期为单核靠边期的花药，此时从外观上观察，小穗呈淡 紫色，长1.2cm左右，顶端小花柱头稍微露出，花药呈淡黄色。摘取小穗先经过2-6天的低温(4-15℃)预处理，接种前流水冲洗1小时，70％乙醇表面消毒，消毒时间为20-40秒，无菌水冲洗3-5次后，2％次氯酸钠进行表面消毒，消毒时间控制在10-15分钟，无菌水冲洗3-5次。将花药从小穗中剥离，尽量避免花药受伤，均匀接种到花药愈伤诱导培养基。愈伤诱导与增殖培养基组成为：M8基础培养基；添加：2mg·L-1NAA，0.5mg·L-16-BA，15mg·L-1PAA，7.5mg·L-1STS，500mg·L-1CH，100mg·L-1Proline，100mg·L-1Glutamin，5.4％Maltose，0.8％Agar；pH5.0；培养条件为暗培养，温度为22-28℃。获得胚性愈伤后，将愈伤挑出转入新的培养基进行增殖备用。
所述步骤2操作方法如下：
将含有双元植物表达载体pBS1305RdcodA的农杆菌EHA105单克隆于含50mg·L-1卡那霉素和25mg·L-1利福平的YM培养基上划线，28℃培养3天。收集农杆菌菌体，将其悬浮于M8液体培养基中，不断晃动30min后至菌体OD600为0.3-0.6，即可用于转化。
所述步骤3操作方法如下：
侵染时各具体参数如下：麻竹愈伤组织切成2mm-3mm的小块；预培养时间2-4天；侵染时间20-40min；共培养时间2-4天；添加乙酰丁香酮浓度为100-200mg·L-1，潮霉素浓度为25-30mg·L-1。
所述步骤4操作方法如下：
将共培养后的愈伤组织块转入筛选培养基(添加潮霉素和头孢霉素的愈伤诱导与增殖培养基)进行筛选，2周换培养基一次，直到抗性愈伤生长稳定，进而诱导出胚芽。
所述步骤5操作方法如下：
当愈伤组织诱导出胚芽后，将培养皿转入光照培养。选取健壮的胚芽，移入生根培养基。生根培养基组成为：B5+300mg·L-1Cef+30％Sugar+0.25％Gelrite，pH 5.8，光照。待根系发达，苗长到50mm-80mm以上时进行移栽，栽培基质为泥炭土∶蛭石＝1∶1(v/v)，置于光照培养箱内培养1-2月，即可转移至遮阴大棚培养，3-5月后可进入野外林地栽培。
附图说明
图1是麻竹愈伤转化结果，图1A是转化过后的抗性愈伤，图1B是分化得到抗性芽，图1C是抗性芽生根，图1D是阳性再生植株；
图2是PCR扩增检测Rd29A电泳图；
图3是PCR扩增检测codA基因电泳图；
图4是Southern杂交印记电泳图，M：λDNA/HindIII Marker，plasmid：pBS1305RdcodA， T1-T3：转基因植株，CK：非转基因植株；
图5是codA基因表达的RT-PCR分析，CK：非转基因麻竹植株，T1、T2：转基因再生植株。
具体实施方式
实施例
1.麻竹开花植株取自福建省永安市。在麻竹花期选取长1.2-1.4厘米的小穗，在4℃下保存4天，接种前流水冲洗60分钟，70％乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗3遍，2％次氯酸钠12分钟，无菌水冲洗5次。将花药从小穗中剥离出来，均匀接种到花药愈伤诱导培养基。愈伤诱导与增殖培养基组成为：M8基础培养基；添加：2mg·L-1NAA，0.5mg·L-16-BA，15mg·L-1PAA，7.5mg·L-1STS，500mg·L-1CH，100mg·L-1Proline，100mg·L-1Glutamin，5.4％Maltose，0.8％Agar；pH5.0；培养条件为暗培养，温度为22-28℃。当花药诱导出愈伤长至2-3mm后，挑出愈伤转入新的培养基进行增殖并反复继代培养，获得足够的愈伤组织材料。
2.质粒为含有诱导型启动子Rd29A引导耐寒基因CodA的双T-DNA载体pBS1305RdcodA；农杆菌菌种为EHA105。农杆菌EHA105单克隆于含50mg·L-1卡那霉素和25mg·L-1利福平的YM培养基上划线，28℃培养3天。收集农杆菌菌体，将其悬浮于M8液体培养基中，不断晃动30min后至菌体OD600为0.3，用于转化。
3.将麻竹愈伤组织切成2-3mm的小块，预培养3天。挑出愈伤组织块置于无菌三角瓶中，倒入材料体积3倍的含100mg·L-1AS的农杆菌菌液侵染20分钟，期间每隔3分钟摇晃1分钟，分离出愈伤组织块，用滤纸吸附多余的侵染液，在超净工作台上吹20分钟，转入含有100mg·L-1AS的共培养基中暗培养3天，然后转移至含有25mg·L-1Hyg和300mg·L-1Cef的筛选培养基上，每2周继代一次，挑选出抗性愈伤，继续继代培养培养直至分化出不定芽。
4.待不定芽长至2-3cm时，移入生根培养基。生根培养基组成为：B5+300mg·L-1Cef+30％Sugar+0.25％Gelrite，pH 5.8，光照。当再生苗长至50mm-80mm，根系80mm长时，将苗从培养基中小心拔出，洗净培养基，移栽至经高压灭菌的基质转移至温室培养，栽培基质为经高压灭菌的蛭石泥炭土(比例1∶1)，用Hoagland培养液浇灌，覆膜，上开小孔，1周后转入遮阳大棚栽培，即可进入常规育苗程序。全过程参见图1。
5.转基因再生植株的检测：
(1)PCR检测
采用CTAB法提取抗性麻竹再生植株的总DNA进行PCR扩增，质粒pBS1305RdcodA作为对照鉴定Rd29A和codA基因，电泳结果表现为阳性，证明Rd29A基因(图2)和codA9(图3)基因已经整合到麻竹再生植株基因组上。
(2)Southern检测
对生长状况良好的再生植株Southern杂交分析(图4)，以地高辛标记的CodA基因为探针，在转基因植株中可以检测到一条目的基因，而非转基因中没有目的片段。说明CodA基因整合到麻竹基因组中，并且是一个单插入事件。
(3)RT-PCR检测
对PCR阳性植株进行RT-PCR分析(图5)，在4℃低温胁迫24h后可以检测到codA基因的表达，而在非转基因植株和胁迫前植株中没有检测到codA基因的表达。说明Rd29A引导的codA基因已经在麻竹细胞中转录生成相应的mRNA，即codA基因已经整合到麻竹基因组中。