神经介素U2受体激动剂芦丁的新用途.pdf

神经介素U2受体激动剂芦丁的新用途，涉及芦丁可成为神经介素U2受体激动剂的应用。芦丁安全无毒不产生副作用、来源丰富、价廉、在体内相对稳定，不易被降解，能够通过脑血屏障，到达下丘脑部位，对NMU2R具有活性，从而激活NMU2R，降低肥胖大鼠的体重、血糖、血脂，增强对胰岛素的敏感性。可用于开发制备抑制食欲，增强基础代谢，降低体重及减肥和治疗糖尿病、高血脂病、高血糖病药的应用。

1.  神经介素U2受体激动剂芦丁的新用途，其特征在于：芦丁可用于激活神经介素U2受体，在制备抑制食欲，增强基础代谢，降低体重及减肥药物中的应用。

2.  根据权利要求1所述的神经介素U2受体激动剂芦丁的新用途，其特征在于：所述的芦丁在制备防治高血脂病药中的应用。

3.  根据权利要求1所述的神经介素U2受体激动剂芦丁的新用途，其特征在于：所述的芦丁在制备防治高血糖病药中的应用。

4.  根据权利要求1所述的神经介素U2受体激动剂芦丁的新用途，其特征在于：所述的芦丁在制备增强胰岛素的敏感性药中的应用。

神经介素U2受体激动剂芦丁的新用途
                           技术领域
本发明涉及芦丁的新用途，具体是指芦丁可成为神经介素U2受体激动剂的应用。
                           背景技术
芦丁(Rutin)的结构式为：

分子式为C₂₇H₃₀O₁₆·3H₂O，分子量为610.51，其形状为黄色结晶粉末或无晶形粉末，有苦味，熔点177-178℃，略溶于水，能溶于热水及乙醇。芦丁又称芸香苷(Rutinoside)广泛存在于自然界，几乎所有的芸香科和石楠科植物中均含有，尤其可以从芸香科的芸香草，豆科植物的槐、蓼科植物的荞麦，金丝桃科植物的红旱莲，鼠李科植物的光枝勾儿茶等中提取制得。据报道，其主要药理作用是维持血管弹性，增强毛细血管抵抗力，降低其脆性与通透性，并促进其细胞增生和防止血细胞凝集。也有抗炎和抗过敏作用。具有扩张血管的功能，可治疗心脑血管疾病。但是，至今为止尚未见到有关芦丁可激活神经介素U2受体，从而能用于制备减肥降脂和胰岛素抵抗等药物的报道。
                           发明内容
本发明的目的在于扩展芦丁的用途，将其作为神经介素U2受体激动剂，用于制备防治肥胖、糖尿病等能量代谢失衡性疾病药物。
本发明的依据是：神经介素(Neuromedin)是一组平滑肌刺激性多肽，通常分成韩蛙皮素类、肛褶蛙肽类、神经紧张素类和神经介素U等。神经介素U(Neuromedin U简称NMU)由174个氨基酸残基组成的蛋白质，广泛分布在中枢神经系统和外周组织很多器官中，与平滑肌收缩、动脉血压、胃肠离子转运、局部血流、肾上腺皮质素水平和饮食行为等重要生理过程的调节密切相关。实验证明NMU是一个有效的内源厌食多肽，具有重要的摄食调节功能，在大脑中充当分解代谢信号分子，具有调节体内能量平衡的重要作用。神经介素U2受体(简称NMU2R)是2000年发现的介导中枢神经系统中NMU的一种受体亚型。NMU2R属于G-蛋白偶联受体，在下丘脑大量表达，其重要的生理功能是调节饮食、代谢和体重。NMU2R激动剂能够激活NMU2R响应，从而达到抑制食欲、减轻体重。能够激活NMU2R这一受体的内源性配体是分子量较大的神经肽，所以很难从人工合成的小分子化合物中筛选到NMU2R激动剂。目前NMU2R激动剂都是由十几个到数十个氨基酸组成的短肽。这些短肽化合物在体内很容易被蛋白酶降解，使之失去活性。更为重要的是，短肽类化合物很难通过脑血屏障，不能到达NMU2R的表达部位下丘脑。因此现有的NMU2R激动剂无法起到降脂减肥效果。发明人经长期研究发现中药中有大量结构复杂的小分子有机化合物，本发明通过测定中药中提取和纯化获得的小分子化合物的有效成分对NMU2R的生物活性，筛选出可作为NMU2R激动剂的是芦丁。经薄层色谱分离法和标准对照品荧光素酶活性检验测定，由于芦丁的黄酮结构2号位置的苯环的相邻位置上有OH基或OCH₃基，因此对NMU2R表现具有活性，可成为NMU2R激动剂。
为了更好的理解本发明，下面通过芦丁对NMU2R活性测定及药理学毒性试验研究，说明芦丁的新用途。具体方法如下：
一.对NMU2R具有活性测定
1.测试原理：采用薄层色谱分离法对芦丁进行层析分离，通过对测试样品处理判断芦丁的结构，并鉴定活性。
2.测试样品处理：将市售的芦丁粉未制成不同浓度的待测样品50ul作为供试品。
3.NMU2R筛选细胞株的建立：将NMU2R质粒和报告基因按1∶5比例共转染到HEK293细胞株。转染前18-24小时收获细胞，重新接种于6孔板，每孔1-2×10⁵个细胞，37℃，5％CO₂培养箱培养18-24小时，待细胞达50-80％融合，配制转染试剂。
4.测试方法：测定与NMU2R作用的荧光素酶表达值，用含3％血清的DMEM培养基收集细胞株，按每孔100UL的量接种到96孔板，控制每孔细胞密度为4×10^-4个，孵育过夜(16-20小时)。取待测样品，每孔加入11UL，每个样品加3个孔，孵育8小时，加入与微孔中液体相同体积(110UL)的荧光素酶底物(BRIGHT-GLO^TM试剂：水＝1；4)溶液，立即用reporter仪读取信号值。结果表明芦丁对NMU2R有活性。
二.毒性试验：
1.测试方法：在细胞水平上进行系统的药理学研究，重点对特异性结构-活性关系进行研究。测定了芦丁对不同的GPCR活性的反应。检测的GPCR包括NMU2R、MC4R、M1R、NPYR、5HTR等。
2.结论：芦丁只对NMU2R起作用，而不能激活或抑制其他GPCR，说明它们只对NMU2R具有特异性，所以能够避免激活或抑制其他受体而产生副作用。
                          具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质内容，下面将大鼠肥胖模型建立后，将其随机分为模型组和芦丁试验组2组，每组10只。模型组灌胃生理盐水1g.kg^-1.d^-1，芦丁试验组灌胃芦丁300mg.kg^-1.d^-1，同时继续供高营养饲料。实验期间每周记录大鼠体重，每日专人观察记录各组大鼠的一般情况，连续喂养4w。试验结束时，分批禁食20～24h，称其体重，剪尾取血测定血糖，然后进行葡萄糖钳夹试验：将禁食大鼠用10％水合氯醛麻醉(0.4ml/100g)，经腹腔麻醉，右颈静脉及左颈动脉插管，取血测定下列各生化指标。大鼠右侧股静脉插管接一装有胰岛素(INS)溶液的输液瓶，大鼠左侧股静脉插管接一装有10％葡萄糖溶液的输液瓶，将这两个输液瓶分别安置在两个微电脑数字式电子微量输液泵上。先进行持续INS输注，速度为1.67mU.kg^-1.min^-1。每隔5min，从颈动脉取血测定血糖值。葡萄糖灌注速率根据所测血糖值不断调整，直至达到稳态(约需30～60min)，记录稳态下葡萄糖灌注速率。取稳态下1h内葡萄糖灌注速率平均值作为GIR(steadystate)。空腹血糖采用罗氏血糖仪(型号：GLUCOTREND^*2)快速测定，胰岛素采用放射性免疫法。总胆固醇(TC)甘油三酯(TG)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)用Beckman CX4全自动生化分析系统，采用酶法检测。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)采用Friedewald公式计算(LDL-C＝TC-HDL-C-0.456TG)。钳夹试验结束处死动物分离并称量睾丸及肾周的脂肪垫湿重。
数据处理，所有原始数据输入计算机，用SPSS.for WINDOWS 11.0统计软件进行统计，组间比较采用单因素方差分析统计方法，两两比较采用LSD检验。芦丁组、模型组和未进行催肥的正常对照组各项检测结果和比较结果见表1、2、3。
        表1、血糖、胰岛素和胰岛素敏感指数测定和比较结果
组别          空腹血糖          空腹胰岛素         胰岛素敏感指数
              (mmol/L)          (mIU/L)            (ISI)
芦丁组        4.81±0.72**      23.38±8.97**      -3.74±0.67**
模型组        6.12±1.47#       42.77±18.02##     -5.48±0.52#
正常对照组    5.10±0.80        21.77±12.35       -4.43±0.95
注意：与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
与正常对照组相比，##P＜0.01，#P＜0.05。
从表1可见，基础血糖和胰岛素水平测定结果表明，芦丁组空腹血糖明显低于模型组(P＜0.01)，但与正常对照组差异不明显；空腹胰岛素和胰岛素敏感指数与模型组也存在极其显著差异(P＜0.01)，而与正常对照组差异不明显。模型组的空腹血糖、空腹胰岛素和胰岛素敏感指数与正常对照组存在显著性以上的差异。因此，芦丁可在制备防治高血糖病药中应用。
                      表2、血脂测定和比较结果
组别        TCH            TG              HDL-C         LDL-C
            (mmol/L)       (mmol/L)        (mmol/L)      (mmol/L)
芦丁组      1.27±0.18**   0.70±0.34**#   0.74±0.16##  0.43±0.24**
模型组      1.79±0.29##   1.09±0.51##    0.74±0.31##  0.87±0.44##
正常对照组  1.15±0.19     0.35±0.12      1.03±0.24    0.42±0.24
注意：与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
与正常对照组相比，##P＜0.01，#P＜0.05。
血脂比较从表2可见，模型组各项生化指标与正常对照组均存在显著性差异。芦丁组的TCH与模型组和正常对照组呈极显著降低(P＜0.01)，TG和LDL-C与模型组有极其显著差异(P＜0.01)，TG与正常对照组差异显著，但LDL-C与正常对照组差异不显著。芦丁组的HDL-C与正常对照组都存在显著差异，但与模型组差异不显著。表明芦丁具有调节血脂作用，可用于制备治高血脂病药。
                  表3、脂肪率和游离脂肪酸测定和比较结果
组别             增重率(％)          脂肪率(％)          游离脂肪酸(mmol/L)
芦丁组           0.6314*             1.49±0.30*         1.38±0.84*
模型组           0.9277              1.71±0.22          2.12±0.95##
正常对照组       0.8386              未测                0.78±0.17
注意：与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
与正常对照组相比，## P＜0.01，#P＜0.05。
脂肪率和游离脂肪酸测定和比较结果从表3可见，从饲喂芦丁开始，芦丁组每日增重率显著低于模型组(P＜0.05)，与基础饲料喂养的正常对照组无显著差异；脂肪率显著低于模型组(P＜0.05)，游离脂肪酸显著低于模型组，而与正常对照组无统计显著性。说明芦丁在制备降低体重及减肥药物中应用。
                表4、葡萄糖钳夹试结果比较
组别           稳态葡萄糖(mmol/L)              GIR(mg/kg.min)
芦丁组         5.58±0.31                      19.43±6.00##
模型组         5.19±0.57                      15.85±3.48##
正常对照组     5.55±0.48                      32.04 ±3.39
注意：与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
与正常对照组相比，##P＜0.01，#P＜0.05。
从表4中可见，模型组的GIR极显著低于正常对照组，芦丁组的GIR极显著低于正常对照组(P＜0.01)，高于模型组，但P＝0.06，未达到显著性要求，提示芦丁有改善胰岛素抵抗的趋势。
上述胰岛素抵抗(IR)是诸如肥胖、高血压、糖尿病、动脉硬化等疾病的共同危险因子。本发明用高蛋白、高脂肪饲料饲喂的WISTAR大鼠，建立单纯性肥胖大鼠胰岛素抵抗模型的钳夹试验结果显示，模型组葡萄糖灌注速率只有正常对照组的一半，具有极其显著差异(P＜0.01)，说明芦丁有一定的改善胰岛素抵抗地作用，可在制备增强胰岛素的敏感性药中应用。
本发明的突出效果如下：
1.本发明对已知的芦丁找到了新用途，作为一种小分子有机化合物的芦丁安全无毒、来源丰富、价廉、在体内相对稳定，不易被降解，能够通过脑血屏障，到达下丘脑部位，对NMU2R具有活性，从而激活NMU2R降低肥胖大鼠的体重、血糖、血脂，增强对胰岛素的敏感性。
2.本发明测定了芦丁对不同的GPCR活性的反应，结果表明：芦丁只对NMU2R起作用，而不能激活或抑制其他GPCR，说明它们只对NMU2R具有特异性，所以能够避免激活或抑制其他受体而产生副作用。