一种奎尼酸衍生物、其制程及其用途.pdf

本发明关于一种奎尼酸衍生物、其制程及其用途，其具有类奎尼酸结构，并可利用类奎尼酸结构与CD28分子结合以阻断依赖CD28分子参与的T细胞第二讯号路径，进而抑制T细胞的活化，此外，经由将奎尼酸分子中1-羧基、3-羟基及4-羟基进行修饰，可降低生成的奎尼酸衍生物的毒性；其制程分为两步骤，首先在酸性环境催化下将奎尼酸与第一试剂反应而生成中间产物，随后将中间产物与第二试剂反应而获得奎尼酸衍生物；其用途则可透过其抑制T细胞活化的能力，而用于治疗自体免疫疾病、过敏、移植排斥或其他相关免疫失调病症。

1.  一种奎尼酸衍生物，其特征在于，其包含一类奎尼酸结构，该类奎尼酸结构用以结合至一CD28分子。

2.  如权利要求1所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中该奎尼酸衍生物用于治疗一自体免疫疾病、一过敏反应、一移植排斥反应或其他免疫失调病症。

3.  如权利要求1所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中该奎尼酸衍生物的化学结构式为：

其中，R1为一有机官能基团。

4.  如权利要求3所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中R1选自-CH₂CH₂Ph、-CH₂CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂(CH₂)₂OCH₃、正丁基、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂CH₂CH(Ph)₂、环戊基、正戊基、-CH₂(CH₂)₂Ph或

5.  如权利要求1所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中该奎尼酸衍生物的化学结构式为：

其中，R1为一有机官能基团，且R2为一羟基保护基团。

6.  如权利要求5所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中R1选自-CH₂CH₂Ph、-CH₂CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂(CH₂)₂OCH₃、正丁基、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂CH₂CH(Ph)₂、环戊基、正戊基、-CH₂(CH₂)₂Ph或

7.  如权利要求5所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中R2选自

8.  一种奎尼酸衍生物的制程，其特征在于，其步骤包含：
使用一酸及一第一试剂与一奎尼酸反应，生成一中间产物，该中间产物的化学结构式为：
以及
使用一第二试剂与该中间产物反应，生成该奎尼酸衍生物；
其中，该第一试剂具有一羰基，该第二试剂具有一化学式R1-NH₂，且R1为一有机官能基团，R2为一羟基保护基团。

9.  如权利要求8所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中R1选自-CH₂CH₂Ph、-CH₂CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂(CH₂)₂OCH₃、正丁基、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂CH₂CH(Ph)₂、环戊基、正戊基、-CH₂(CH₂)₂Ph或

10.  如权利要求8所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中该第一试剂选自

11.  如权利要求8所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中使用该酸及该第一试剂与该奎尼酸反应生成该中间产物的步骤或使用该第二试剂与该中间产物反应生成该奎尼酸衍生物的步骤于微波辐射下进行。

12.  如权利要求8所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中使用该酸及该第一试剂与该奎尼酸反应生成该中间产物的步骤或使用该第二试剂与该中间产物反应生成该奎尼酸衍生物的步骤于100℃下进行且反应时间小于或等于5分钟。

13.  一种奎尼酸衍生物的制程，其特征在于，其步骤包含：
使用一酸与一奎尼酸反应，生成一中间产物，该中间产物的化学结构式为：
以及
使用一第二试剂与该中间产物反应，生成该奎尼酸衍生物；
其中，该第二试剂具有一化学式R1-NH₂，且R1为一有机官能基团。

14.  一种奎尼酸衍生物，其特征在于，其分子结构式为：

其中，R1为一有机官能基团。

15.  如权利要求14所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中R1选自-CH₂CH₂Ph、-CH₂CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂(CH₂)₂OCH₃、正丁基、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂CH₂CH(Ph)₂、环戊基、正戊基、-CH₂(CH₂)₂Ph或

16.  一种奎尼酸衍生物，其特征在于，其分子结构式为：

其中，R1为一有机官能基团，且R2为一羟基保护基团。

17.  如权利要求16所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中R1选自-CH₂CH₂Ph、-CH₂CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂(CH₂)₂OCH₃、正丁基、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂CH₂CH(Ph)₂、环戊基、正戊基、-CH₂(CH₂)₂Ph或

18.  如权利要求16所述的奎尼酸衍生物，其特征在于，其中R2选自

一种奎尼酸衍生物、其制程及其用途
技术领域
本发明是有关于一种奎尼酸衍生物、其制程及其用途，其尤指一种类洋蓟酸的奎尼酸衍生物，可与CD28分子结合并透过抑制T细胞活化而达成其药理用途者。
背景技术
T细胞在抗原引起的免疫反应的起始与调节过程中扮演着关键性的角色，T细胞的活化有许多正向或负向调节程序与机转参与，以严密地控制T细胞的活化程度，避免因免疫反应过度或免疫反应不足而导致病理症状。当T细胞受到来自胞外的特异性抗原刺激时，需要第一讯号路径（signal 1 pathway）与第二讯号路径（signal 2 pathway）的共同参与才能达到最佳的T细胞活化效果，第一讯号路径的起始需要T细胞表面的T细胞受体（T-cell receptor，TCR）与抗原呈现细胞（antigen-presenting cell，APC）如树突状细胞（dendritic cell）等细胞表面表现的主要组织兼容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）分子及透过MHC分子呈现的抗原片段相互结合，而第二讯号路径的诱发则需要T细胞表面的CD28分子与APC表面的共同刺激分子（co-stimulatory molecule）如CD80分子（亦称为B7-1分子）或CD86分子（亦称为B7-2分子）相互结合，以启动共同刺激路径（co-stimulatory pathway），缺乏第二讯号路径下的TCR结合反应（engagement）将导致T细胞失能（anergy），使得T细胞进入低反应能力的状态。
当免疫系统遭遇自体抗原或过敏原的时候并不需要引发完整的免疫反应，此时T细胞若过度活化将导致自体免疫疾病或过敏反应，因此，降低第二讯号路径以导致T细胞失能可作为自体免疫疾病或过敏反应的治疗策略。然而，由于参与细胞内部各种讯号转导路径（signal transduction pathway）的因子有相当的重迭，干扰细胞内的讯号转导路径很可能导致严重的副作用（例如不具选择性地同时阻断第一讯号路径和第二讯号路径），相反地，由细胞外部阻断 讯号转导路径是相对较温和且较适合用于调节讯号反应强度的方式（例如可选择性地个别阻断第一讯号路径或第二讯号路径），举例来说，非致有丝分裂性（non-mitogenic）的抗CD28抗体即可作为由T细胞外部阻断第二讯号路径的阻断剂，然而，由于抗体本身较为脆弱且不稳定的性质，利用抗体作为药物具有许多缺点，例如，抗体会受到消化道中的酸和蛋白酶降解，使得抗体不适合以口服方式投药，抗体的立体构型难以维持而连带使其失去功能，因此也不便于保存，再加上抗体药物本身对免疫系统来说是一种外来蛋白质抗原，也可能诱发免疫反应，这些缺点都会导致以抗体作为治疗药物时效果下降。
利用模拟代谢产物（metabolite）的有机小分子作为药物结合目标受体以阻断特定讯号转导路径可以克服前述抗体药物的缺点，为了开发理想的T细胞阻断剂，本发明的发明人建立了一种筛选药物的技术，称为固定化接受器动态撷取（after flowing through immobilized receptor，AFTIR）并取得中国台湾地区专利公告号I355493的发明专利，发明人利用此筛选技术由西方草药紫锥菊（Echinacea purpurea）萃取物中分离出对CD28分子具有特异性结合能力的目标成分，并确认此成分为洋蓟酸（cynarin，其化学结构式请参阅图1）。然而由于洋蓟酸本身具有较高的细胞毒性，将导致较严重的副作用，发明人转而开发洋蓟酸的类似物，以期得到可以有效地阻断CD28分子而细胞毒性低于洋蓟酸的有机小分子，发明人透过洋蓟酸与CD28分子的三维模型进行分子动力学仿真，发现洋蓟酸分子结构中用以结合CD28分子的关键阻断因子（key blocking factor，KBF）是一个类奎尼酸结构，发明人即由奎尼酸衍生一种类洋蓟酸的奎尼酸衍生物，并对奎尼酸骨架进修饰，以降低奎尼酸衍生物的细胞毒性。
因此，本发明提出一种类洋蓟酸的奎尼酸衍生物、合成此种奎尼酸衍生物的制程以及此种奎尼酸衍生物透过抑制依赖CD28分子参与（CD28-dependent）的T细胞活化过程而达成的药理用途，透过本发明的实施，可改善习知以抗CD28抗体或洋蓟酸作为免疫调节药物时造成的缺点，提升药物的口服稳定度并降低药物的毒性。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种奎尼酸衍生物，其可透过所具有的一类奎尼酸结构与CD28分子结合，并阻断依赖CD28分子参与的T细胞活化反应。
本发明的次要目的，在于提供一种奎尼酸衍生物的制程，其首先在酸性环境催化下生成内酯型中间产物，随后在微波辐射环境下将内酯型中间产物与酰胺试剂反应，而生成奎尼酸衍生物。
本发明的又一目的，在于提供一种奎尼酸衍生物的用途，其透过结合并阻断CD28分子而抑制T细胞活化的功效，而可用于治疗自体免疫疾病、过敏或移植排斥等免疫失调病症。
为了达到上述所指称的各目的与功效，本发明揭示了一种奎尼酸衍生物、其制程以及其用途，本发明的奎尼酸衍生物是一种洋蓟酸的类似物，与洋蓟酸分子相同，其具有一类奎尼酸结构，可作为结合并阻断CD28分子的关键阻断因子，以抑制T细胞的活化。
本发明的奎尼酸衍生物，其化学结构式为：

其中，R1为一有机官能基团，R2则为一羟基保护基团（hydroxyl-protecting group）。
本发明的奎尼酸衍生物具有的结合与阻断CD28分子的能力源自于一奎尼酸骨架（即该类奎尼酸结构），如前所述，于洋蓟酸分子中用于与CD28分子的特异性结合位置（specific binding site）结合者即为该类奎尼酸结构。此外，由于其奎尼酸骨架中1-羧基与一第二试剂（R1-NH₂）中的胺基反应生成一胜肽键，意即使连接于一号碳（C-1）的-C(O)OH基团被-C(O)NHR1基团所取代，使得本发明的奎尼酸衍生物的毒性下降。此外，为了达到更稳定的奎 尼酸衍生物，可进一步利用一第一试剂（R2=O）形成一羟基保护基团以保护奎尼酸骨架中的3-羟基或4-羟基。由于3-羟基与4-羟基毗邻，且在分子的立体结构中为同向（cis），3-羟基与4-羟基可与同一分子反应而形成可同时保护3-羟基与4-羟基的单一羟基保护基团。
本发明提出的利用奎尼酸制备奎尼酸衍生物的制程包含两个步骤：第一，利用一强酸或一强酸及一第一试剂（R2=O）与一奎尼酸反应而生成一中间产物，该中间产物的化学结构式为：

第二，利用一第二试剂（R1-NH₂）与该中间产物反应，而生成该奎尼酸衍生物。将本制程的第一或第二步骤置于微波辐射下并加热至100℃，可促进反应速率，并使得每一步骤的反应时间减少至仅需约五分钟即可完成。
本发明的奎尼酸衍生物的用途是透过结合CD28分子、阻断依赖CD28分子参与的T细胞第二讯号路径，最终达成抑制T细胞活化效果的调节免疫反应的药理机转，而可作为治疗自体免疫疾病、过敏或移植排斥等免疫失调病症的药物。
附图说明
图1：其为洋蓟酸的化学结构；
图2：其为本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的化学结构；
图3：其为本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的合成制程；
图4：其为本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的产率；
图5：其为本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的活体外细胞毒性测试结果；
图6：其为本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的活体外效力测试结果；
图7：其为本发明的一较佳奎尼酸衍生物的分离力测试结果；
图8：其为本发明的一较佳奎尼酸衍生物的活体外半抑制浓度测试结果；
图9：其为本发明的一较佳奎尼酸衍生物的活体内免疫抑制效力测试结果；
图10：其为本发明的一较佳奎尼酸衍生物的活体副作用评估结果；及
图11：其为本发明的一较佳奎尼酸衍生物的另一活体副作用评估结果。
【图号对照说明】
KBF关键阻断因子
具体实施方式
为了使本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，特用较佳的实施例及配合详细的说明，说明如下：
请参阅图2，其为本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的化学结构；如图所示，本发明的奎尼酸衍生物的系列分子分别对应一编号，并共同具有一分子式：

其中，R1为一有机官能基团，R2则为一羟基保护基团。如前所述，3-羟基与4-羟基毗邻且在分子的立体结构中为同向，故可连接至同一R2。如图中所示，第一试剂（R2=O）分别与3-羟基的氧原子及4-羟基的氧原子键结并释出一水分子，形成该羟基保护基团以保护3-羟基与4-羟基。该胜肽键与该羟基保护基团可保护该奎尼酸衍生物，使其不易水解，而避免释出具有细胞毒性的奎尼酸。
参阅图3，其为本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的合成制程；如图所示，本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的合成程序皆包含以下两个步骤：
步骤一：使用一酸及一第一试剂与一奎尼酸反应，生成一中间产物；及
步骤二：使用一第二试剂与该中间产物反应，生成该奎尼酸衍生物。
在步骤一中，添加强酸（如硫酸）以催化奎尼酸的内酯化反应或缩酮反应，在酸性催化下，奎尼酸的5-羟基的氧原子对1-羧基进行亲核性（nucleophilically）攻击，而生成中间产物的五元内酯环（five membered lactone ring）结构；当第一试剂（为一种酮）的羰基与酸性催化同时存在时，3-羟基的氧原子与4-羟基的氧原子亦会对第一试剂的羰基的碳原子进行亲核性攻击，而生成具有内酯结构的中间产物的五元缩酮环（five membered ketal ring），此一缩酮结构可保护3-羟基与4-羟基。此外，将步骤一置于高温（如100℃）下进行时，相较于室温下进行，高温可使反应所需时间缩短，再者，将步骤一置于微波辐射的下进行时，步骤一的反应速率可更进一步提升。例如，以丙酮作为第一试剂与奎尼酸反应时，若将此反应置于室温下，需要经过12小时才能使内酯中间产物的产率达到85%，然而，将同样的反应置于微波辐射下并加热至100℃，在5分钟以内即可达到98%的内酯中间产物产率。
在步骤二中，内酯中间产物与胺类第二试剂（具有R1-NH₂的分子式）反应而生成奎尼酸衍生物，胺基的氮原子对内酯中间产物的羰基（位于步骤一时形成的五元内酯环结构内）进行亲核性攻击，使内酯环打开并形成一胜肽键，而生成一酰胺产物（即该奎尼酸衍生物）并释出一水分子。将步骤二置于微波辐射下进行并加热至100℃时，反应仅需5分钟即可得到高产率的奎尼酸衍生物。本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的产率如图4中所示。
为方便标示，下文与图例中各奎尼酸衍生物以Cyn-编号的方式表示。
参阅图5，其为本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的活体外（in vitro）细胞毒性测试结果；图中的纵轴为体外培养的T细胞的存活率，以百分比表示，横轴为添加于T细胞的洋蓟酸或各奎尼酸衍生物的浓度，单位为微克／毫升（μg/mL），T细胞的存活率以MTT测试，结果如图所示，添加Cyn-1315、Cyn-1316、Cyn-1317、Cyn-1318、Cyn-1319、Cyn-1320、Cyn-1321、Cyn-1322、Cyn-1323及Cyn-1324等奎尼酸衍生物的T细胞，其存活率高于添加洋蓟酸的T细胞，反过来说，该些奎尼酸衍生物的细胞毒性小于洋蓟酸。
参阅图6，其是本发明的奎尼酸衍生物的系列分子的活体外效力测试结果；图中的纵轴代表IL-2的表现量，以相对于PBS的倍数表示，图中的横轴表示 各奎尼酸衍生物及洋蓟酸，并以条状图的填色区分不同的浓度，当T细胞的活化被干扰时，IL-2的表现量将随的下降，结果如图所示，Cyn-1316、Cyn-1319、Cyn-1320、Cyn-1321、Cyn-1323、Cyn-1324、Cyn-1325及Cyn-1326等奎尼酸衍生物对T细胞的活化反应表现出等同或高于洋蓟酸的抑制效果。
由于上述奎尼酸衍生物的系列分子中，Cyn-1324表现出最低的细胞毒性以及对T细胞活性的高抑制效力，发明人遂将其作为代表进行后续实验，以进一步测试其效力。Cyn-1324的化学结构式如下：

并根据国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）制定的标准命名法命名为(3a顺,5顺,7顺,7a逆)-5,7-二羟-N-(2-甲丙基)六羟螺[1,3-苯并二恶茂-2,1'-环己烷]-5-羧胺（(3aR,5R,7R,7aS)-5,7-dihydroxy-N-(2-methylpropyl)hexahydrospiro[1,3-be nzodioxole-2,1'-cyclohexane]-5-carboxamide）。
参阅图7，其是本发明的奎尼酸衍生物Cyn-1324的分离力测试结果；图中的纵轴表示T细胞的CD28分子与B细胞的CD80分子间的结合机率（binding probability），横轴表示分离力（unbinding force）的大小，单位为皮牛顿（pN），标示(A)的字段代表未加入Cyn-1324的分离力测试结果，标示(B)的字段代表加入Cyn-1324的分离力测试结果，如图所示，未加入Cyn-1324时，量测到的平均分离力大约为41.9pN，加入Cyn-1324后，平均分离力下降至大约29.1pN，此结果提供物理证据证实Cyn-1324使CD28分子与CD80分子间的结合下降，而可阻断经由CD28分子与共刺激分子如CD80或CD86间作用而诱发的第二讯号路径。
参阅图8，其是本发明的奎尼酸衍生物Cyn-1324的活体外半抑制浓度测 试结果；图中的纵轴代表Cyn-1324对共刺激诱发的IL-2表现量的抑制效果，以百分比表示，横轴代表Cyn-1324的浓度取对数值，半抑制浓度（IC₅₀）表示能将达到抑制第二讯号路径而使T细胞的IL-2表现量减半的剂量，如图中所示，Cyn-1324达成阻断T细胞免疫反应的半抑制浓度大约为20μg/mL。
参阅图9，其是本发明的奎尼酸衍生物Cyn-1324的活体内（in vivo）免疫抑制效力测试结果，测试方法将四组BALB/c小鼠分别以磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）、卵清蛋白（ovalbulmin，OVA）、OVA与Cyn-1324、OVA与环孢灵A（cyclosporin A，CSA）处理，PBS作为阴性控制（negative control）的对照组，OVA用以使BALB/c小鼠产生免疫反应，CSA则为最近临床上用以抑制免疫反应的新药，可作为阳性控制（positive control）以及药效参考的对照组，处理后经过14天再由小鼠身上收集血清，并以ELISA分析血清中免疫球蛋白G（IgG）免疫球蛋白E（IgE）的含量。图中的纵轴代表免疫球蛋白的浓度，单位为μg/mL，横轴代表四组小鼠，标示A的左栏为小鼠血清中IgG的含量，标示B的右栏为小鼠血清中IgE的含量，如图所示，相较于仅以OVA处理的小鼠，一并以OVA与Cyn-1324处理的小鼠其血清中IgG含量减少约30%而IgE含量减少约23%，另，一并以OVA与CSA处理的小鼠其血清中IgG含量减少约45%而IgE含量减少约12%，显示Cyn-1324可有效地抑制免疫反应。
参阅图10，其是本发明的奎尼酸衍生物Cyn-1324的活体副作用评估结果；测试方法将四组小鼠其中一组以PBS处理，其于三组皆以OVA处理以引发免疫反应，并于以OVA致敏后分别以PBS、Cyn-1324以及CSA处理，并持续追踪四组小鼠的体重，结果如图所示，图中的纵轴为小鼠体重，以百分比表示，横轴为小鼠年龄，单位为周，图中可明显看出以CSA处理的小鼠在12周龄至20周龄间体重逐渐减轻，至22周龄时又突然上升，而其余组别的小鼠其体重皆随年龄增长缓慢上升，故Cyn-1324的副作用可能较CSA温和。
参阅图10，其是本发明的奎尼酸衍生物Cyn-1324的另一活体副作用评估结果；图中标示(A)的图片为小鼠的背部照片，图中标示(B)的图片为小鼠的腹部照片，两张图片左侧皆为以OVA致敏后经Cyn-1324处理的小鼠，右侧皆 为以OVA致敏后经CSA处理的小鼠，如图所示，以CSA处理的小鼠出现身体肿胀的副作用，而以Cyn-1324处理的小鼠并未出现相同的副作用。此外，单一剂量毒性试验（single dose toxicity test）的结果，小鼠对Cyn-1324的最大容许剂量（maximum tolerance dose，MTD）为每公斤体重400毫克。
综上所述，本发明提出一种奎尼酸衍生物，其可透过其具有的类奎尼酸结构与CD28分子结合，以阻断依赖CD28分子参与的T细胞第二讯号路径，进而抑制T细胞的活化与免疫反应，并有活体外与活体内的实验数据作为左证，此外，本发明的奎尼酸衍生物其制程分为两步骤，首先在酸性环境催化下将奎尼酸与第一试剂反应而生成中间产物，使第一试剂生成可同时保护奎尼酸分子中的3-羟基及4-羟基的一羟基保护基团，随后将中间产物与第二试剂反应而获得奎尼酸衍生物，第二试剂中的胺基与奎尼酸分子中的1-羧基反应后成为较稳定的酰胺，可降低奎尼酸衍生物的毒性，另，由于本发明的奎尼酸衍生物具有抑制T细胞活化的能力，可用于治疗自体免疫疾病、过敏、移植排斥或其他相关免疫失调病症。
上文仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施的范围，凡依本发明权利要求范围所述的形状、构造、特征及精神所为的均等变化与修饰，均应包括于本发明的权利要求范围内。