抗海水养殖动物弧菌病的偶联亚单位疫苗及其制备方法和用途.pdf

本发明涉及一种抗海水养殖动物弧菌病的偶联亚单位疫苗的制法及用途。本疫苗为病原弧菌最小弧菌产生的外毒素与其LPS经偶联后制成。最小弧菌活化后接种普通海水营养培养基后，经摇床培养，培养物经离心，取上清，对最小弧菌产生的外毒素进行分离纯化；进行最小弧菌LPS的制备；进行灭活外毒素与LPS的偶联，制成偶联亚单位疫苗。这种偶联亚单位疫苗能产生较好的免疫保护性，其免疫保护率平均可达80％。该疫苗适用于免疫多种养殖海水鱼类，并具有提高养殖产量的效果。

1、  一种抗海水养殖动物弧菌病的偶联亚单位疫苗，其特征在于适用作多种养殖海水动物提高养殖产量的抗弧菌免疫剂的疫苗，由权利要求2中所述的方法制备，为病原弧菌最小弧菌产生的外毒素与其LPS经偶联后制成，产生菌种为最小弧菌。

2、  一种制备权利要求1所述的抗海水养殖动物弧菌病偶联亚单位疫苗方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)、最小弧菌活化后接种普通海水营养培养基，经25-37℃、100-250rpm摇床培养10-24小时，培养物经10000rpm离心20-40分钟，取上清；
(2)、外毒素的提纯及生物学特性分析：采用硫酸铵分级盐析及Sephadex-G100层析生化方法进行提纯；取真鲷实验动物的红细胞，按Kirov的方法测定外毒素的溶血谱和溶血价；参照病毒TCID50滴定方法，测定外毒素对Vero细胞和HeLa细胞的CD₅₀值；按Reed-Muench的方法测算对真鲷的LD₅₀；
(3)、LPS的制备，参照Westphal和Jann的酚水法进行；
(4)、LPS的类脂A去除及多糖的定量测定：用0.1mol/L醋酸缓冲液水解LPS后，超速离心以去除类脂A；参照Dubois的苯酚—硫酸法定量多糖；
(5)、外毒素的灭活及与LPS的偶联：采用热灭活的方法对外毒素进行灭活，灭活后的外毒素没有毒性，但仍保持其抗原性；参照Beuvery的方法采用EDC法进行偶联。

3、  根据权利要求2中所述的制备抗海水养殖动物弧菌病偶联亚单位疫苗方法，其特征在于该方法步骤(1)所述为：最小弧菌活化后接种普通海水营养培养基，经30℃、200rpm摇床培养18-20小时，培养物经10000rpm离心30分钟，取上清。

4、  权利要求1中所述抗海水养殖动物弧菌病的偶联亚单位疫苗的一种用途，其特征在于可用作多种养殖海水动物提高养殖产量的抗弧菌的免疫。

抗海水养殖动物弧菌病的偶联亚单位疫苗及其制备方法和用途
技术领域：
本发明涉及一种抗海水养殖动物弧菌病的偶联亚单位疫苗及其制法。
背景技术：
弧菌病是海水养殖动物中常见的流行病，在现有地技术中，目前只有鳗弧菌菌体疫苗的生产和应用，尚未见弧菌偶联亚单位疫苗的生产和应用。鳗弧菌菌体疫苗在水产养殖生产中具有较专一的抗弧菌特异性，对抗鳗弧菌引起的疾病具有较高的抗性，但正是由于其作用专一，对其它弧菌致病菌引起的疾病的防御作用较差，在生产应用中存在非常明显的局限性。此外，传统的细菌疫苗的生产工序上在最后环节加入灭活用药物，残留于疫苗中，导致存在副作用。
本发明的目的在于提供一种弧菌偶联亚单位疫苗的生产工艺，其特性能完全为作用动物所接受。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种弧菌偶联亚单位疫苗的生产工艺，其特性能完全为作用动物
所接受。该抗海水养殖动物弧菌病的偶联亚单位疫苗，为病原弧菌最小弧菌产生的外
毒素与其LPS经偶联后制成，产生菌种为最小弧菌。
本发明所述弧菌偶联亚单位疫苗的制备方法包括如下步骤：
1，最小弧菌活化后接种普通海水营养培养基，经25-37℃、100-250rpm摇床培养10-24小时，培养物经10000rpm离心20-40分钟，取上清。
2，外毒素的提纯及生物学特性分析：采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析等生化方法进行提纯；取真鲷等实验动物的红细胞，按Kirov的方法测定外毒素的溶血谱和溶血价；参照病毒TCID50滴定方法，测定外毒素对Vero细胞和HeLa细胞的CD₅₀值；按Reed-Muench的方法测算对真鲷的LD₅₀。
3，LPS的制备。参照Westphal和Jann的酚水法进行。
4，LPS的类脂A去除及多糖的定量测定：用0.1mol/L醋酸缓冲液水解LPS后，超速离心以去除类脂A；参照Dubois等的苯酚—硫酸法定量多糖。
5，外毒素的灭活及与LPS的偶联：采用热灭活的方法对外毒素进行灭活，灭活后的外毒素没有毒性，但仍保持其抗原性；参照Beuvery的方法采用EDC法进行偶联。
上述方法1中所述优选条件为：最小弧菌活化后接种普通海水营养培养基，经30℃、200rpm摇床培养18-20小时，培养物经10000rpm离心30分钟，取上清。
本发明所提供的抗海水养殖动物弧菌病的偶联亚单位疫苗的用途，是可用作多种养殖海水动物提高养殖产量的抗弧菌的免疫，这种偶联亚单位疫苗能产生较好的免疫保护性，其免疫保护率平均可达80％。该疫苗适用于免疫多种养殖海水鱼类，并具有提高养殖产量的效果。可取得较好的效果，利用上述制备的弧菌偶联亚单位疫苗经浸泡免疫养殖动物，其保护效果见下表：
                    表1  疫苗在网箱养殖真鲷中的试用效果
                实验时间  实验鱼        死亡鱼      死亡率        存活率
地点  组  别
                (月)      (尾)          (尾)        (％)          (％)
      免疫组    6         400           69          17.3          82.7
深圳
      对照组    6         400           180         45            55
      免疫组    6         400           45          11.3          88.7
湛江
      对照组    6         400           155         38.8          61.2
                   表2  疫苗在网箱养殖石斑鱼中的试用效果
                实验时间  实验鱼        死亡鱼      死亡率       存活率
地点  组  别
                (月)      (尾)          (尾)        (％)         (％)
      免疫组    6         400           106         26.5         73.5
深圳
      对照组    6         400           211         52.8         47.2
      免疫组    6         400           115         28.8         71.2
湛江
      对照组    6         400           199         49.8         50.2
具体实施方式：
本发明提供的弧菌偶联亚单位疫苗的制备方法，按如下步骤实现：
1，最小弧菌活化后接种普通海水营养培养基，经30℃、200rpm摇床培养18-20小时，培养物经10000rpm离心30分钟，取上清。
2，外毒素的提纯及生物学特性分析：采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析生化方法进行提纯；取真鲷实验动物的红细胞，按Kirov的方法测定外毒素的溶血谱和溶血价；参照病毒TCID50滴定方法，测定外毒素对Vero细胞和HeLa细胞的CD₅₀值；按Reed-Muench的方法测算对真鲷的LD₅₀。
3，LPS的制备：参照Westphal和Jann的酚水法进行。
4，LPS的类脂A去除及多糖的定量测定：用0.1mol/L醋酸缓冲液水解LPS后，超速离心以去除类脂A；参照Dubois等的苯酚—硫酸法定量多糖。
5，外毒素的灭活及与LPS的偶联：采用热灭活的方法对外毒素进行灭活，灭活后的外毒素没有毒性，但仍保持其抗原性；参照Beuvery的方法采用EDC法进行偶联。