SARS酵母杂交疫苗及其制备方法.pdf

本发明属于基因工程生产疫苗技术领域，一种“SARS”酵母杂交疫苗及其制备方法，该杂交疫苗由基因重组杂交酵母组成。应用酵母杂交疫苗载体系统，构建“SARS”抗原表位基因质粒和表达细胞生长因子的质粒，分别转化酵母后进行杂交，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。由此产生的重组杂交酵母，本身是一种无致病性的基因治疗载体，该载体本身具有免疫增强活力，即免疫佐剂作用。将上述“SARS”杂交酵母菌原液、经洗涤，采用真空冷冻干燥，即制成冷冻“SARS”酵母杂交疫苗。该疫苗具有较强的免疫原性，可诱导“SARS”特异性免疫应答，对提高人体抗“SARS”病毒感染能力具有明显效果，能有效地预防“SARS”病毒引起的非典型性肺炎，具有治疗“SARS”病毒引起的非典型性肺炎的作用。

1.  一种能预防和治疗“SARS”的疫苗及其制备方法，该疫苗由一个DNA质粒通过启动子控制表达协同刺激信号的细胞因子和第二个DNA质粒通过启动子控制表达至少一个SARS-Cov的抗原基因组成，这两个质粒都由一个宿主微生物作为载体来携带。

2.  1中所说的细胞因子包括如下：IL-2、TNF、B7-1、GM-CSF、IL-12、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-14、IL-18、B7-2、CD28、CD40、TNFR、Lymphotoxin-betaR、NF-KappaB、ICAM-1、LFA-3、M-CSFR、M-CSF、Flt3-L、SCF、TPO、CD80、CD58、GM-CSF和B-7。

3.  1中所说的病原体抗原是来源于SARS病毒。

4.  1中所说的机体是脊椎动物，如哺乳动物、人、家畜。

5.  1中所说的宿主微生物载体是真核和/或原核细胞。

6.  5中所说的真核细胞是真菌，如酵母。

7.  5中所说的原核细胞是病毒和细菌。

8.  将1中所说的疫苗配以赋形剂或与其它药物联合应用。

9.  3中所说的病原体抗原是SARS相关抗原包基因括如下：S、N、M、E、X1、X2、X3、X4、X5及S基因的片段。

10.  1中所述的方法包括以下步骤：
(1)：分别构建别构建“SARS”抗原表位基因质粒(如：PYEX-S vector)和表达细胞生长因子的质粒(如：DFG-HIL-2-neo vector)；
(2)：将两个质粒分别转化进单倍体酵母，筛选阳性克隆；
(3)：将两个单倍体酵母酵母进行杂交，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选；
(4)：将筛选出来的“SARS”杂交酵母进行扩增，菌液经洗涤，采用真空冷冻干燥，制得冻干疫苗。

11.  权利要求10所述的方法，其特征在于，杂交疫苗中采用了2中所说的细胞因子或9中所说的抗原基因。

12.  一种按上述特征要求之一所述方法制备的“SARS”的疫苗，其特征在于，该疫苗是应用杂交疫苗载体系统开发的种基因工程疫苗。

SARS酵母杂交疫苗及其制备方法
技术领域  本发明涉及一种治疗和/或预防“SARS”病毒的高效疫苗及其制备方法，该发明由至少两个基因表达单位经杂交形成一个基因表达载体；其中一个基因表达单位表达细胞生长因子和/或淋巴因子，另一个基因表达单位表达单个、融合和/或多个“SARS-Cov”抗原基因；该发明主要制备用来治疗和预防“SARS”的基因表达杂交疫苗。
背景技术  SARS病毒是在去年我国乃至世界范围内肆虐的SARS病的元凶。他的传播严重的影响了人们的正常生活秩序。“SARS”病毒是一种崭新的冠状病毒，是已知冠状病毒的近期变种。冠状病毒是一种RNA病毒。2003年以来，国内外相继报道了引起SARS冠状病毒的基因序列，该病毒含有完整的5’末端序列、编码序列和3’末端序列，全基因组长度为29727个核甘酸，基因编码区的组成结构于其他冠状病毒类似，包括多个开放阅读框架(ORFS)，分别编码病毒的多聚酶蛋白(Polymerase la，lb)和结构蛋白。
在疾病防治历史上，疫苗一直是最有效、价廉和实用的方法。没有任何一种措施包括抗生素在内曾经如此有效地降低人口的死亡率，疫苗对人类健康的影响之大是难以用语言做评价的。疫苗曾在世界上许多国家成功地控制了以下九种疾病：天花、百喉、破伤风、猩红热、百日咳、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和风疹。天花是在世界范围内得到最有效控制的疾病。一个疫苗的有效性是取决于它能诱导机体产生保护性免疫反应的能力。
脊椎动物尤其是鸟类和哺乳动物战胜微生物感染的机制是一个复杂的过程。病原体侵入宿主后会激活机体多系统多种保护性反应，如果病原体或其毒素成功地攻破机体的外层防线而进入血循环，淋巴器官如脾、肝和骨髓将会分解和清除进入血循环中的病原体或其毒素。淋巴组织是由一系列相互交织的细胞和纤维组成，这些细胞包括白细胞即淋巴细胞和处于不同分化阶段的其它细胞，如浆细胞、淋巴纤维细胞、单核-巨噬细胞、嗜酸细胞和肥大细胞。淋巴细胞主要分为T和B淋巴细胞，它们在机体的抗原特异性免疫反应中起不同作用但又互补。
免疫系统通过识别外源性病原体而成为保持机体内环境稳定的重要防线。机体对外源性病原体的初步反应称为“先天性免疫”，先天性免疫的特征是自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和其它白细胞首先对病原体产生应答，这些细胞通过吞噬、消化、裂解或分秘淋巴因子在短时间内消灭病原体。先天性免疫是抗原非特异性的，它是机体产生“获得性免疫”应答之前的第一道抵御病原体的防线。T和B淋巴细胞是参于获得性免疫反应的主要细胞，获得性免疫反应的特征是B细胞识别抗原后被激活从而分秘抗原特异性抗体、T细胞的激活和抗原提呈。
B细胞识别抗原是指抗原与B细胞表面的免疫球蛋白受体结合，这些抗原包括细菌细胞壁、细菌毒素或病毒表面糖蛋白，该结合促使信号传导到B细胞内，此过程称为“第一信号”，在某些情况下，仅需要一个信号就能激活B细胞，这些无需辅助性T细胞就能激活B细胞的抗原称为“不依赖T细胞抗原”(或：不依赖胸腺抗原)；某些情况下，B细胞的激活需要“第二信号”，第二信号通常由辅助性T细胞提供，这类细胞抗原称为“T细胞依赖性抗原”(或：胸腺依赖性抗原)；结合到B细胞表面的抗原通过内吞进入B细胞并被消化为小片段，这些片段又与B细胞表面的MHC II分子结合形成“抗原多肽-MHCII分子复合物”，该复合物提供T细胞依赖性抗原激活B细胞所需的第二信号。激活B细胞的另一种方式是B细胞与淋巴结和脾脏生发中心的树突状细胞(Dentritic Cells，DC)结合。
获得性免疫的一个重要机制是T细胞的激活，激活T细胞需要抗原提呈细胞如巨噬细胞和DC细胞与T细胞结合，巨噬细胞表面有多个识别病原体抗原的受体，如甘露糖和清道夫受体，巨噬细胞吞噬这些病原体后在内体和溶酶体的作用下将其消化裂解为多肽片段，这些多肽片段与巨噬细胞表面的MHC II分子结合形成“抗原多肽-MHC II分子复合物”，当T细胞与该复合物结合后被激活。DC细胞是既能形成“抗原多肽-MHC II分子复合物”又能形成“抗原多肽-MHC I分子复合物”的抗原提呈细胞。
当B细胞与抗原结合后通过“同型转换”使分泌普通IgM抗体的B细胞转化为分泌特异性的IgG抗体，这些细胞分为两类：一类不断分裂称为克隆扩增，这类细胞成熟后每秒钟可释放2000个同样的抗体，约2-3天后死亡；另一类细胞此时不分泌抗体而成为记忆细胞，这些记忆细胞可存活数月到数年，当再次遇到同样抗原时这类记忆细胞会迅速产生大量抗体，这种免疫反应称为次级免疫反应。研发疫苗的目标就是要诱导这种较初级免疫反应更快更强的次级免疫反应。
经典的主动疫苗分为亚单位和完整病原体疫苗，亚单位疫苗是完整病原体的一部分，其目的是避免应用有致病性的完整病原体或避免应用完整病原体的有毒组份。B型副流感病毒的脂多糖做为脑膜炎疫苗就是应用抗原组份的一个亚单位疫苗例子；完整病原体疫苗通常是灭活或减毒的病原体，如灭活的百日咳疫苗。由于灭活或减毒过程有时会损害一些诱导免疫反应所必需的抗原决定基，因此这类疫苗常需添加免疫增强剂。
传统的预防性疫苗是通过接种疫苗后使机体在再次遇到相同病原体时能产生保护性免疫反应，这种理论适用于病毒或细菌传染性疾病，因病毒或细菌仅有有限数量的抗原；但抗癌疫苗并非如此，抗癌疫苗是必须能够根除已经存在的癌细胞，这样就使我们必须更好地明白肿瘤抗原和宿主免疫的作用机制，当代的疫苗理论是要诱导细胞免疫反应。
至今，人们仍缺乏能有效地治疗“SARS”地药物。SARS病毒的复苏或SARS的复发将会严重威胁人类的健康。因此，研发治疗和预防SARS疫苗有重要意义。
发明内容  本发明是一种应用酵母杂交疫苗载体平台而开发的SARS杂交酵母疫苗，它能诱导与MHC I和II分子偶联的强效、持久的保护性CTL免疫反应，也就是说是能达到理想免疫效果的疫苗。
本疫苗的第一个特征是应用特殊的基因载体系统。该载体由两个DNA质粒组成，一个编码协同刺激信号，如由启动子操作的细胞因子；另一个DNA质粒编码由启动子操作的至少一个或多个“SARS”抗原基因。
本疫苗的第二个特征是它能很好的诱导细胞毒性T淋巴细胞免疫反应(CTL)来对抗“SARS”病毒的方法。
本疫苗的第二个特征是采用了一种基因表达系统，该系统由独立启动子分别表达细胞生长因子如IFN和“SARS”病原体抗原基因。
附图说明  以下附图说明是对本发明以图表示时的一些部分的具体描述，同时也是对本发明原理的辅助性解释。
图1.本发明操作基本原理的图解。
图2.本发明的其中一个实例图解。
具体实施方式  本发明的疫苗是一种能诱导强效、持久的CTL免疫反应的疫苗，它通过激活依赖MHC I和II的途径来产生保护性免疫反应。图1是对本发明操作原理的图解，图中的酵母质粒α和a分别表达“SARS”抗原基因和一个协同刺激信号，该协同刺激信号通常是促使“SARS”抗原基因刺激最有效免疫反应的相应细胞生长因子，而且很可能若没有同时将此细胞因子导入，其免疫反应将不能达到其最佳状态。这些抗原分子有如下所列但并不限于这些，如全病毒、亚单位、病毒表面抗原、及单个、多个或不同排列组合的抗原。下所列但并不限于这些，如N、M、S、E、X1、X2、X3、X4、X5等基因；细胞因子有如下所列但并不限于这些，IL-2、TNF、IFN、B7-1、GM-CSF、IL-12、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-14、IL-18、B7-2、CD28、CD40、TNFR、lymophotoxin-betaR、NF-KappaB、ICAM-1、LFA-3、M-CSFR、mM-CSF、Flt3-L、SCF、TPO、CD80和CD58。
本发明的疫苗首先是由两个分离的质粒通过真核生物基因交配的方法形成。该真核生物包括如下所列但并不限于这些，Saccharomyces，Schizosaccharomyces，Yarrowia，candida，hansenula。另外，这个载体系统也可由原核细胞组成，如大肠杆菌和病毒质粒等但并不限于这些。因此，无论是真核或原核细胞所形成的最后产品是由一个启动子控制表达细胞因子，另一个多克隆位点供插入各种各样的抗原基因，另有复制子、转录、翻译元件的DNA序列、筛选标记等通过连接子将其连成完整质粒，真核细胞表达载体的筛选标记有neo、leu2、ura3、trp1、ade1、his3等，该疫苗载体被用于需要治疗的机体。
本发明疫苗操作原理图1所示，首先，构建二个功能性的多核苷酸序列组成的DNA表达质粒；这两个质粒的具体应用例子如图2所示。其中的启动子可以是真核生物启动子但并不限于此，可以是酵母Sccharomyces cerevisine和Candida albicans。启动子可以是诱导性的或组成性的，诱导性启动子可以被调介，如营养成份(carbon souces，nitrogen souces和其它)、药物(抗药性等)、与感染过程有关的特殊试剂(血清等)和温度(热休克和冷休克等)。将所得到的两个质粒分别转化为真核微生物如单倍体酵母，转化DNA的方法可以是多种多样的，包括钙磷沉淀法、显微注射法、脂质体法、电穿孔法和病毒载体法等，这里也包括各种各样的含有载体的宿主细胞。
本发明中的DNA质粒的启动子也可以是原核细胞启动子，在这种情况下，宿主可以是原核细胞表达质粒，其目的也是诱导所需的免疫反应，可用多种方法将此原核细胞表达质粒转化为真核微生物，如转导、偶联、转化、电穿孔法和转染等。
当用酵母作为宿主微生物时，一旦酵母质粒被成功地转化为酵母时，可用氨基酸缺陷培养基筛选转化子，然后通过单倍体酵母基因交配而形成双倍体杂交酵母，此时再用双氨基酸缺陷培养基筛选双倍体杂交转化子[Guthrie Fink，Guide to Yeast Genetics &Molecular Biology，Methods in Enzymology，194：3-231(1999)]，在这个过程中，非转化子被自然淘汰。
本发明的“SARS”疫苗用于治疗和/或预防“SARS”。该疫苗通常通过胃肠道使用，也可通过注射，如皮下、肌内、腹腔、皮内等；也可通过鼻腔滴入、喷雾吸入和口服；本发明也包括该疫苗的其它配方，如栓剂；使用疫苗的途经可根据个体情况选择以达到最佳临床效果；如果该疫苗用于动物，也可采用口服，果子狸；本疫苗可通过计算单位来定量，可以是无菌胃肠道型和非胃肠道型的，也可以是普通胃肠道型和非胃肠道型的；可以是油水或水油乳剂；使用该疫苗的疗程可以是2-3周内2次或视具体情况决定。
以下举例说明本发明但并不限于这些，所用的科学和技术术语都以本领域普通人员能理解和明白为原则。这里所举出的特例是为说明本发明之用，以供参考，并不是说本发明的应用仅限于此，另外，用同样方式同样组份但又作些修改仍显而易见属于本发明之范畴。
例1.构建酵母表达质粒表达h-IFN和构建表达抗原基因的广谱质粒载体
图2中的质粒pcDNA3.IFN质粒购于Clontech，将该质粒中的hIL-2用限制性内切酶smalI/NotI消化后克隆到pYES3/CT(Invitrogen)的多克隆位点区(MCS)smalI/NotI，将质粒pYEX-BX(Clontech)的MCS区域修饰即增加多个限制性内切酶位点使其容易克隆，由此构建成表达抗原基因的广谱质粒载体pYEX.UIG。
所得到的质粒pYEX.UIG可用于克隆表“SARS”病毒抗原基因，用EcoRI/BamH I内切酶将其抗原基因克隆到pYEX.UIG载体。
例2.杂交酵母疫苗载体的构建
如图2所示，将例1中所得质粒pYES3/CT.IFN用TE/LiOAc方法转化为酵母W303-1Aα(ATCC)，用Leu营养缺陷琼脂培养基平板筛选转化子；将例1中所得质粒pYEX.UIG.N用TE/LiOAc方法转化为酵母W303-1Aa(ATCC)，用Ura3营养缺陷琼脂培养基平板筛选转化子；将所得两个转化子IGV.IFN(α)和IGV.N(a)通过基因配型杂交生成终末疫苗产品，该疫苗具有表达IFN和“SARS”抗原蛋白的能力。
本疫苗是新一代的重组蛋白和DNA疫苗。和传统的疫苗比免疫原性弱，因此我们急需具有免疫佐剂作用的疫苗载体，当今以诱导细胞免疫为主的疫苗通常缺乏有效的导入刺激T细胞活性的协同刺激淋巴因子的方法，本发明为最有效地刺激机体的免疫反应提供了一个理想的方法，该理论可延伸到基因治疗的所有领域，因为最有效地刺激机体的免疫反应常需要合适的协同因子的配合。
本发明是利用一个创新性的疫苗平台技术，研发的一种以诱导细胞免疫为主的治疗性和预防“SARS”新型疫苗。