休眠松材线虫幼虫快速检疫方法 【技术领域】
本发明涉及一种休眠松材线虫幼虫快速检疫方法。
背景技术
松材线虫病(又称松树萎蔫病)是松树上的一种毁灭性病害。该线虫主要通过松墨天牛补充营养时的伤口进入木质部，寄生在树脂道中，在大量繁殖的时候移动，并遍布全株，导致树脂道薄壁细胞和上皮细胞的破坏和死亡，造成植株失水，蒸腾作用降低，树脂分泌急剧减少和停止，松树针叶从灰绿色变成黄褐色或红褐色，最后整株枯死。寄主植物感染松材线虫病后40天即可死亡，从植株发病到整片松林毁灭只需3-5年的时间，由于松材线虫致病力强，传播快，寄主死亡速度快，且常常猝不及防，一旦发生，除砍伐病树外，目前尚无根治的办法，不但给国民经济造成巨大的损失，还破坏了自然景观及生态环境，更重要的是对我国约8.5亿亩(5710万公顷)针叶树木资源及黄山、张家界、庐山等著名风景名胜区、世界自然文化遗产和重点生态区的构成严重的威胁。
目前，松材线虫病只在日本、美国、加拿大、墨西哥、韩国、朝鲜、葡萄牙、香港、台湾等国家和地区有发生。我国自1882年在南京中山陵首次发现松材线虫病以来，目前已扩散至山东、江苏、浙江、安徽、广东等省的局部地区，直接经济损失25亿元，间接损失2500亿元。
我国加入WTO后，国际贸易越来越频繁，随货物进出境的木质包装材料越来越多，这为松材线虫出入我国提供了机会。为了防止松材线虫随木质包装传入传出国境，自1999年以来，我国各出入境检验检疫机构加强了对进出境木质包装的检疫工作，全国各森林植物检疫站也加强了对疫区调运货物木质包装的检验检疫工作，但在检疫中发现，现行的检疫方法由于需时长，少则4-5天(线虫含量多的材料)，多则10天以上(线虫含量少的材料)，远远不能满足口岸及国内森林植物快速检验检疫的需要，其原因是：1、从木质包装材料中直接分离出来的大多为分散型三龄幼虫，而目前主要依据松材线虫成虫的形态特征进行鉴定，要将分散型三龄幼虫或持久型四龄幼虫培养为成虫，需要一定的时间；2、进境木质包装材料的存放时间、感染程度、含水量、检疫处理等情况的不同，在进境检疫过程中，经常出现分离的松材线虫很少的情况，有地只有几条，要将这为数不多的休眠状态的幼虫转变为供鉴定的成虫，根据现有的方法与技术需要更长的时间(10天以上)，给港口、码头、检查站、货主、检测机构带来许多麻烦，如要等到检疫结果出来后再通关放行，则造成积船压港，直接影响对外及国内贸易；如不等检疫结果出来采取先通关后检疫的方式，则有可能造成漏检或疫情扩散；如在检疫中将可疑线虫不作进一步深入检验，就判为一般有害生物，则有可能造成松材线虫的入侵，如将可疑对象判为松材线虫，则有可能引起贸易纠纷，影响国与国之间的关系及对内对外贸易。于是，目前口岸及森林植物检疫机构迫切需要解决松材线虫的快速检测问题。
根据松材线虫的生活史，松材线虫可分为1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、成虫；或1龄幼虫、2龄幼虫、分散型3龄幼虫、持久型4龄幼虫、成虫。分散型3龄幼虫在一定的条件下可不经过持久型4龄幼虫阶段而直接转为繁殖型4龄幼虫，再转变为成虫。松材线虫在最适宜的环境条件下，繁殖一代仅需4天的时间，而存在于木包装材料中的松材线虫大多为休眠状态的3龄幼虫，只要能破除松材线虫幼虫休眠期并提供最适宜的生长条件，就可在非常短的时间内的得到供鉴定用的成虫，实现对木包装松材线虫的快速检测。于是，破除松材线虫幼虫休眠期是实现快速检疫的关键。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种能使休眠松材线虫幼虫迅速成长为成虫，便于检测的休眠松材线虫幼虫快速检疫方法。
本发明的休眠松材线虫幼虫快速检疫方法是：
1、将木包装或木材劈成小块；
2、将所需检测的劈碎材料用纱布包好，放入盛有培养溶液的容器中；
3、将盛有劈碎材料的容器置于20-41℃条件下分离培养；
4、培养液用100目和500目网筛过滤，100目的可套在500目网筛上面；
5、用洗瓶轻轻冲洗500目网筛收集线虫；
6、冲洗液用生物显微镜镜检，并记录观察结果。
所述的培养溶液是以双氧水为基液，并加以营养液、赤霉素、硝酸钾、盐酸克伦特罗四者中的一种或多种组合，其中营养液为去氢枞酸和长叶稀的混和物，所用的双氧水的浓度为1×10-7-9×10-3，赤霉素浓度为1-1000ppm，长叶稀浓度为1.67×10-8-5×10-2，去氢枞酸浓度为1.67×10-8-5×10-2，盐酸克伦特罗浓度为1ppt-1000ppb，硝酸钾浓度为1.1×10-5-2.2×10-2。
本发明的休眠松材线虫幼虫快速检疫方法主要特点是能使休眠状态的松材线虫幼虫快速转变供鉴定用的成虫，它比常规方法能平均提前3-4天检出休眠松材线虫。由于在培氧液中添加了双氧水和适于松材线虫生长的物质，可以极大地提高松材线虫的检出率。该方法操作方便、成本低、重复性好，数据可靠，适用于国内外进出境检验检疫机构、森林植物检疫机构或个人、集体对木质包装、木材松材线虫的检验检疫。
【具体实施方式】
实施例1：
一种休眠松材线虫幼虫快速检疫方法是：1、将木包装或木材劈成0.5×15cm小块；2、所需检测的劈碎材料用两层纱布包好，放入盛有培养溶液的容器中；3、把盛有劈碎材料的容器置于25-30℃环境下分离培养；4、培养液用100目的网筛套在500目网筛上面过滤；5、用洗瓶轻轻冲洗500目网筛上收集的线虫；6、冲洗液用生物显微镜镜检，并记录观察结果。所用的培养溶液包括1×10-7-9×10-3的双氧水、1-1000ppm赤霉素、1.67×10-8-5×10-2去氢枞酸、1.67×10-8-5×10-2长叶稀。
实施例2：
一种休眠松材线虫幼虫快速检疫方法与实施例1相同，但所用的培养溶液包括1×10-7-9×10-3双氧水、1-1000ppm赤霉素。
实施例3：
一种休眠松材线虫幼虫快速检疫方法与实施例1相同，但所用的培养溶液包括1×10-7-9×10-3双氧水、1ppt-1000ppb盐酸克伦特罗、1.67×10-8-5×10-2去氢枞酸、1.67×10-8-5×10-2长叶稀。
实施例4：
一种休眠松材线虫幼虫快速检疫方法与实施例1相同，但所用的培养溶液包括1×10-7-9×10-3双氧水、1ppt-1000ppb盐酸克伦特罗。
实施例5：
一种休眠松材线虫幼虫快速检疫方法与实施例1相同，但所用的培养溶液包括1×10-7-9×10-3双氧水、1.1×10-5-2.2×10-2硝酸钾、1.67×10-8-5×10-2去氢枞酸、1.67×10-8-5×10-2长叶稀。
实施例6：
一种休眠松材线虫幼虫快速检疫方法与实施例1相同，但所用的培养溶液包括1×10-7-9×10-3双氧水、1.1×10-5-2.2×10-2硝酸钾。
实施例7：
一种休眠松材线虫幼虫快速检疫方法与实施例1相同，但所用的培养溶液包括1×10-7-9×10-3双氧水、1.67×10-8-5×10-2去氢枞酸、1.67×10-7-5×10-2长叶稀。
实施例8：
一种休眠松材线虫幼虫快速检疫方法与实施例1相同，但所用的培养溶液包括1×10-7-9×10-3双氧水、1-1000ppm赤霉素、1.1×10-5-2.2×10-2硝酸钾。
实施例9：
一种休眠松材线虫幼虫快速检疫方法与实施例1相同，但所用的培养溶液包括1×10-7-9×10-3双氧水、1ppt-1000ppb盐酸克伦特罗、1.1×10-5-2.2×10-2硝酸钾。
以下用实验数据来加以说明：
常规处理与试验处理试验结果统计表时间 处理 转化率 (％) 线虫数 量/头 成 虫 数 量/ 头 处理 转化 率(％) 线虫 数量/ 头 成虫 数量/ 头 提前(天) 线虫增/头 成虫增/头2003.12.9-15 常规处 理 144h7.14 28 2 双氧水+长叶 稀+去氢枞酸 不同浓度、温 度 24h16.67 144h60.4 129 19 5天 线增101/144h 成增17/144h2003.12.29-04.1.3 常规处 理 120h0 24h7 120h36 0 双氧水+长叶 稀+去氢枞酸 不同浓度、温 度 24h16.67 120h100. 94 24h24 120h15 8 24h4 120h33 5天以上 线虫增122/120h 成虫增33/120h2004.1.1-740-25 CK 72h12.5 120h12.5 24h4 7 120h24 72h1 120h1 双氧水+长叶 稀+去氢枞酸 不同浓度、温 度 24h15.63 120h108. 06 24h32 120h30 4 24h5 120h66 2天 线虫增280/120h 成虫增65/120h2004.1.3-940-25 CK 72h12.5 144h12.5 24h4 144h39 72h1 144h1 双氧水+长叶 稀+去氢枞酸 不同浓度、温 度 24h3.77 144h115. 32 24h53 144h40 2 24h2 144h65 2天 线虫增363/144h 成虫增/64/144h2004.1.13-19 常规处 理 144h50 24h11 144h32 144h1 双氧水+长叶 稀+去氢枞酸 不同浓度、温 度 24h20.00 144h189. 04 24h12 144h15 4 24h1 144h17 5天 线虫增122/144h 成虫增16/144h2003.3.15-21 常规处 理 72h4.82 120h26.73 24h77 120h306 双氧水+长叶 稀+去氢枞酸 不同浓度、温 度 24h2.0 120h45.0 0 24h50 120h68 8 1 2天 线虫增/382/120h 成虫增/2004.3.23-29 CK 24h2.44 144h9.27 24h41 144h129 24h1 144h3 双氧水+长叶 稀+去氢枞酸 不同浓度、温 度 24h5.00 144h41.7 0 24h80 144h38 24h4 144h33 线虫增254/144h 成虫增30/144h2004.3.29-4.3 常规处 理 48h3.64 144h3.64 24h64 96h185 144h197 96h2 144h2 双氧水+长叶 稀+去氢枞酸 不同浓度、温 度 24h2.8 144h43.7 9 24h98 96h604 24h3 96h41 3天 线虫增419/96h 成虫增/39/96h2004.4.19-24 常规处 理 96h82.13 96h135 96h27 双氧水+长叶 稀+去氢枞酸 不同浓度、温 度 24h5.41 96h127.5 6 24h148 96h778 24h8 96h144 3天 线虫增643/96h 成虫增117/96h 时间 处理 转化率 (％) 线虫 数量/ 成虫 数量/ 处理 转化 率(％) 线虫 数量/ 成虫数 量/头 提前(天) 线虫增/头头头头成虫增/头2004.4.22-27常规处理72h33.33108h63.3312h7108h6072h5108h6.5双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度12h8.57108h235.6112h18108h322 12h1.5 108h136.52.5天线虫增262108h成虫增130/108h2004.4.26-30常规处理96h/24h696h3196h/双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度24h28.0996h151.1224h17896h573 24h50 96h2124天以上线虫增542/96h成虫增212/96h2004.5.2-6常规处理48h3.4596h3.4515h1096h7848h196h1双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度15h7.796h30.6515h1396h232 15h1 96h131.5天线虫增192/96h成虫增12/96h2004.5.5-8常规处理72h/24h1172h4072h/双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度24h18.7572h29.2824h11572h257 24h3 72h52天线虫增217/72h成虫增5/72h2004.5.24-28CK96h5.5624h9296h24296h3盐酸克伦特罗不同浓度、温度24h0.5696h6.3124h17896h659 24h1 96h93天线虫增417/96h成虫增6/96h2004.5.24-28CK96h5.6624h9296h24296h3盐酸克伦特罗+双氧不同浓度、温度48h0.496h10.2524h6396h880 48h1 96h223天线虫增638/96h成虫增19/96h2004.6.2-6常规处理96h/24h496h1896h/盐酸克伦特罗+长叶稀+去氢枞酸，不同浓度、温度24h38.4696h108.0624h1596h161 24h5 96h274天以上线虫增143/96h成虫增27/96h200.4.6.29-7.3常规处理48h9.5272h17.7124h2672h10172h10双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度24h12.972h55.6324h8272h184 24h15 72h292天线虫增83/72h成虫增19/72h2004.7.6-12常规处理144h11.4224h108144h277144h4双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度24h0.46144h24.3924h560144h1717 24h1 144h425天线虫增1440/144h成虫增38/144h2004.7.19-23常规处理96h/24h5596h21496h/双氧水+长叶稀+去氢枞酸双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度24h6.2596h11.524h14796h649 24h1 96h124天线虫增435/96h成虫增12/96h时间处理转化率(％)线虫数量/头成虫数量/头处理转化率(％) 线虫 数量/ 头 成虫 数量/ 头提前(天)线虫增/头成虫增/头2004.7.24-8.2常规处理216h18.75 24h19 216h141 216h3双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度48h1.5216h10*. 24h59 216h37 0 48h1 216h378天线虫增229/216h成虫增34/216h2004.7.26-30常规处理96h20. 24h1 96h38 96h1双氧水+长叶稀+去氢枞酸+盐酸克伦特罗不同浓度、温度24h7.6996h18.80 24h30 96h155 24h2 96h143天线虫增117/96h成虫增13/96h2004.8.2-6常规处理96/ 24h27 96h69 96h/盐酸克伦特罗不同浓度、温度24h4.4496h40.59 24h89 96h324 24h2 96h194天以上线虫增255/96h成虫增19/96h2004.8.9-13常规处理96h25360h/0 24h25 96h61 360h25 360h/0盐酸克伦特罗不同浓度、温度24h3.396h41.15 24h148 96h579 24h1 96h253天线虫增518/96h成虫增25/96h2004.8.16-20ck253个在192现成虫常规处理)72h1.7896h1.78(2) 24h125 96h448 72h1 96h1盐酸克伦特罗不同浓度、温度24h0.6296h30.41 24h302 96h134 24h1 96h652天线虫增899/96h成虫增64/96h2004.8.23-27常规处理96h/168h始现成虫。 24h43 96h215 96h/盐酸克伦特罗不同浓度、温度24h2.996h18.02 24h131 96h637 24h2 96h2011天线虫增422/96h成虫增20/96h2004.8.9-9.3常规处理96h/ 24h7 96h76 96h/盐酸克伦特罗+硝酸钾不同浓度、温度24h1.9696h28.02 24h76 96h412 24h1 96h154天以上线虫增336/96h成虫增15/96h2004.9.20-24常规处理96h/120h1 24h10 96h82 96h/赤霉素+双氧水不同浓度、24h33.3396h110.98 24h17 96h174 24h1 96h344-9天线虫增92/96h 240h1 360h32.47 360h173 360h9温度成虫增34/96h 2004.9.29-10.3常规处理 96h16.67 240h3 360h4 24h20 96h39 36067 96h1 360h4赤霉素+双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度 24h12.5 96h129.16 24h13 96h101 24h1 96h183天线虫增62/96h成虫增17/96h 2004.10.3-8常规处理 120h/ 264h33.33 24h6 120h27 264h40 120h/ 264h1赤霉素+双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度 24h20.00 120h105.7 1 24h4 120h81 24h1 120h1510天线虫增54/120h成虫增15/120h时间处理 转化率 (％) 线虫 数量/ 头 成虫 数量/ 头处理转化率(％)线虫数量/头成虫数量/头提前(天)线虫增/头成虫增/头2004.10.13-18常规处理 240h/ 24h1 240h20 240h/双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度24h8.33240h536.0424h11240h21324h1240h6110天以上线虫增193/240h成虫增61/240h2004.10.20-25常规处理 96h/ 120h始现 264 24h3 96h23 264h34 96h/ 120h1 264h2赤霉素+双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度48h15.0096h166.8524h296h6748h396h374天线虫增44/96h成虫增37/96h2004.10.25-29常规处理 168h/ 24h3 168h18 168h/赤霉素+双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度、温度48h14.29168h124.2924h33168h1648h1168h117天以上线虫增144/168/成虫增11/168h2004.11.22-26常规处理 96h/ 24h3 96h10 96h/双氧水+长叶稀+去氢枞酸+硝酸钾不同浓度、温度24h2.724h4796h12624h196h204天以上线虫增116/96h成虫增20/96h2004.12.14-18常规处理 96h25 26457.5 24h9 96h24 264h46 96h1 264h3双氧水+长叶稀+去氢枞酸不同浓度、温度48h161396h62.5624h1996h8448h596h183天线虫增60/96h成虫增17/96h