一种两亲性PH响应4/6杂臂星型共聚物及其制备方法.pdf

本发明属于生物医药用高分子聚合物材料技术领域，公开了一种两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物，数均分子量为30000～54000g/mol。还公开了其制备方法：将ε-己内酯、辛酸亚锡及小分子引发剂混合，110～140℃下反应24～48h，减压蒸馏、沉淀、过滤、干燥，得到聚己内酯大分子引发剂；将聚己内酯大分子引发剂、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、六甲基三亚乙基四胺、溴化铜溶于甲苯，搅拌后加入辛酸亚锡，60～90℃下反应5～12h；加入甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯连续聚合5～12h，去除催化剂，过滤，滤液后处理，得到两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物，将其应用于制备装载水难溶性药物胶束系统中。

1.   一种两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物，其特征在于具有公式（1）或公式（2）所示结构：


R₁为：
R₂为：
x=17～53，y=10～41，z=12～29。

2.   根据权利要求1所述的两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物，其特征在于：所述两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物的数均分子量为30000～54000g/mol。

3.   一种根据权利要求1或2所述两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：
（1）制备聚己内酯大分子引发剂：将ε‑己内酯、辛酸亚锡及小分子引发剂混合，110～140℃下反应24～48h，减压蒸馏、沉淀、过滤、干燥，得到聚己内酯大分子引发剂；
(2)制备两亲性pH响应4/6臂杂臂星型共聚物：将步骤（1）制备的聚己内酯大分子引发剂、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、六甲基三亚乙基四胺、溴化铜溶于甲苯中，搅拌后加入辛酸亚锡，60～90℃下反应5～12h；再加入甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯连续聚合5～12h，去除催化剂，过滤，滤液后处理，得到两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物。

4.   根据权利要求3所述的两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中反应物的重量份数配方如下：
小分子引发剂          2.35～13.43份
ε‑己内酯             86.51～97.52份
辛酸亚锡              0.06～0.13份；
步骤（2）中反应物的重量份数配方如下：

所述甲苯的用量为每1g聚己内酯大分子引发剂使用2～4mL甲苯。

5.   根据权利要求3所述的两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的沉淀均指往旋转蒸发后溶液加入10倍体积的0℃体积分数为50%的甲醇水溶液进行沉淀；步骤（2）所述的去除催化剂指将反应产物溶解于四氢呋喃后，过中性氧化铝层析柱，四氢呋喃洗脱，除去催化剂；步骤（2）所述的滤液后处理指将滤液旋蒸蒸发、加入10倍体积的正己烷中沉淀、过滤、干燥。

6.   根据权利要求3所述的两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物的制备方法，其特征在于：当制备两亲性pH响应4杂臂星型共聚物时，所述小分子引发剂指2‑溴异丁酸季戊四醇二酯，由以下方法制备得到：将摩尔比为1:2:2的季戊四醇、2‑溴异丁酰溴、三乙胺溶解于四氢呋喃中，在冰水浴中反应4～6h，然后在室温下反应16～30h，经旋转蒸发、沉淀、过滤、干燥，得到2‑溴异丁酸季戊四醇二酯；
当制备两亲性pH响应6杂臂星型共聚物时，所述小分子引发剂指2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯，由以下方法制备得到：将摩尔比为1:3:3的二季戊四醇、2‑溴异丁酰溴、三乙胺溶解于四氢呋喃中，在冰水浴中反应4～6h，然后在室温下反应16～30h，经旋转蒸发、沉淀、过滤、干燥，得到2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯。

7.   根据权利要求6所述的两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物的制备方法，其特征在于：当制备两亲性pH响应4杂臂星型共聚物时，所述四氢呋喃的用量为每1g季戊四醇使用20～25mL四氢呋喃；当制备两亲性pH响应6杂臂星型共聚物时，所述四氢呋喃的用量为每1g二季戊四醇使用10～15mL四氢呋喃。

8.   根据权利要求1或2所述的两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物在制备装载水难溶性药物胶束系统中的应用。

9.   根据权利要求8所述的两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物在制备装载水难溶性药物胶束系统中的应用，其特征在于所述装载水难溶性药物胶束系统由以下方法制备得到：将两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物和水难溶性药物溶于有机溶剂中，室温下搅拌4～6h，去离子水透析24～48h，冷冻干燥，得到装载水难溶性药物胶束系统。

10.   根据权利要求9所述的两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物在制备装载水难溶性药物胶束系统中的应用，其特征在于：所述的水难溶性药物指在1L水中溶解度小于或等于1g的药物；所述的有机溶剂指二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的至少一种。

一种两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药用高分子聚合物材料技术领域，特别涉及一种两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物及其制备方法。
背景技术
癌症是21世纪三大疾病之一，严重危害着人类的健康。世界卫生组织的全球癌症报告显示：目前每年在全球夺去700多万人的生命，随着世界人口日趋老龄化，预计全世界癌症死亡人数还将快速上升，到2030年可能将超过1310万。由于癌症细胞的异质性、多药耐药性等，癌药的治疗仍面临着巨大的挑战。作为抗击癌症最重要的工具之一，化疗对于癌症的治疗起着非常重要的作用。理想的化疗药物应该只对病变部位的癌细胞发挥作用，而不会或少对正常细胞产生毒副作用。为了降低毒副作用，提高药物的利用度，减少药物的降解及损失，人们近年来大力开发各种药物载体体系。这些药物载体体系能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官。为了寻找合适的药物载体，人们对各种载体体系如聚合物胶束、水凝胶、囊泡、微球、脂质体、微乳液等进行了大量的研究。其中，聚合物胶束以其特有优异性质而成为目前研究的热点。
可生物降解两亲性聚合物在水溶液中通过自组装形成核/壳结构的胶束，其作为抗癌药物载体越来越受到各国研究者的普遍关注。它具有以下优点：（1）聚合物分子量大，作为载体使用时能使药物在病灶部位停留较长时间；肿瘤部位的细胞透过性处于亢进状态，抗癌药物在血液循环中存在的时间越长，进入肿瘤部位的机会就越多；（2）药物在聚合物胶束内能通过扩散或聚合物自身的降解达到缓释或可控释放的目的；（3）可以把一些具有靶向作用或控制药物释放的功能性组分通过化学键合的方式结合到聚合物粒子表面；（4）可生物降解的聚合物材料，能够避免药物释放后载体材料在人体器官组织内聚积和产生毒副作用。
星型聚合物是指一个核中至少引出三个聚合物臂的聚合物。一般分为两大类：一类为每条臂均具有相同化学结构的星型聚合物（AB），每条臂上可能是均聚物、共聚物或者三嵌段共聚物；另一类为至少两条臂化学结构不相同的杂臂星型聚合物，常见的有A₂B₂、A₃B₃、A₂B、A₃B、ABC、A₅B、AB₂C₂、ABCD等。星形聚合物其独特的化学结构使其具有一些特殊的物理化学性能，如流体力学半径小、特性粘度低、结晶度低、易于形成稳定的胶束等，将在更多的领域里得到广泛的应用。因为具有与聚合物胶束相似的拓扑结构，可提高胶束的热力学稳定性，星形聚合物非常适用于抗癌药物的控制释放。
作为树枝状聚合物的典型代表，星形聚合物主要通过先核后臂法（core‑first）或先臂后核法（arm‑first）方式合成。先核后臂法需要先合成多功能引发剂，合成的星型聚合物的臂长一致且臂数确定，可以精确控制聚合度。先臂后核法需要先合成单官能活性线性大分子，合成的星型聚合物的臂长一致但臂数难以确定。
目前已报道的星形嵌段共聚物经自组装所形成的聚集体的形态有球状、管状、囊泡状、蠕虫状和复合状等，从而促进了星形嵌段共聚物在诸多领域的潜在应用，如药物缓释、分离、光电材料和催化等。在药物缓释方面，Lang等（Journal of Colloid and Interface Science,2011,364:92.）采用直链聚乙二醇‑b‑聚己内酯（PEG‑b‑PCL）和六臂星形聚己内酯‑b‑聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（S(PCL‑b‑PDEAEMA)）制备了一种混合胶束，有效提高胶束的稳定性。将其包载硝苯地平后，利用PDEAEMA亲疏水性随pH值的变化来控制硝苯地平的释放速率。Cao等（Biomacromolecules,2011,12(7):2697.）制备了一种以聚丙交酯（PLLA）为内核，聚乙二醇（PEG）为亲水外壳，表面偶联叶酸的星形单分子胶束用于阿霉素的靶向给药，该胶束在pH7.4时释放速率很慢，而在pH5.0时释放速率明显加快。专利申请WO2003078489‑A1公布了一种制备亲水性两嵌段、三嵌段及星型聚合物的制备方法，在惰性气体保护下，由至少一种乙烯单体、大分子可降解性链转移剂及引发剂聚合制备而得。专利申请200810107054.2公布了一种三臂星型共聚物tri‑arm P(NIPAAm‑co‑DMAEMA)及其自组装胶束，利用外部的或体内固有的环境变化实现对药物的控释。专利申请200910024899.X公布了一种星型嵌段酸敏性纳米胶束，它是由笼型八聚硅倍半氧烷引发D,L‑丙交酯活性开环聚合，再与N,N‑二甲氨基乙基‑甲基丙烯酸酯（DMAEMA）进行ATRP反应所合成的，通过对温度和pH敏感实现对药物的控释。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物。
该星型共聚物结构为：以季戊四醇或二季戊四醇为核，分别依次接上疏水性基团，pH响应基团和亲水性基团形成两亲性pH响应4/6杂臂星形共聚物。
本发明另一目的在于提供一种上述星型聚合物的制备方法。
该方法为先用酰化剂将季戊四醇（或二季戊四醇）的两个或三个羟基进行酰化得到杂官能团引发剂，然后进行己内酯的ROP聚合，再采用连续聚合法依次进行pH响应单体和亲水大分子单体的ARGET ATRP聚合制得两亲性pH响应4/6杂臂星形聚合物。
本发明再一目的在于提供上述星型聚合物在制备装载水难溶性药物胶束系统中的应用。
采用透析法制备内层为疏水基团，中间层为pH响应基团、外壳为亲水基团的纳米级聚合物胶束，并包裹抗癌药物。这种纳米药物载体进入细胞后，能利用肿瘤细胞内的酸性环境促使其中间pH响应层发生质子化，从而实现药物在肿瘤细胞内的快速可控释放。这种pH响应杂臂星形共聚物结构可以在维持高载药量的前提下提高胶束的pH响应灵敏度，更有效的控制药物释放，提高药物的治疗效率。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物，具有公式（1）或公式（2）所示结构：


R₁为：
R₂为：
x=17～53，y=10～41，z=12～29。
所述两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物的数均分子量为30000～54000g/mol。
所述两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物的制备方法，包括以下具体步骤：
（1）制备聚己内酯大分子引发剂：将ε‑己内酯、辛酸亚锡及小分子引发剂混合，110～140℃下反应24～48h，减压蒸馏、沉淀、过滤、干燥，得到聚己内酯大分子引发剂；
(2)制备两亲性pH响应4/6臂杂臂星型共聚物：将步骤（1）制备的聚己内酯大分子引发剂、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、六甲基三亚乙基四胺、溴化铜溶于甲苯中，搅拌后加入辛酸亚锡，60～90℃下反应5～12h；再加入甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯连续聚合5～12h，去除催化剂，过滤，滤液后处理，得到两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物。
所述步骤（1）中反应物的重量份数配方如下：
小分子引发剂          2.35～13.43份
ε‑己内酯             86.51～97.52份
辛酸亚锡              0.06～0.13份；
所述步骤（2）中反应物的重量份数配方如下：

所述甲苯的用量为每1g聚己内酯大分子引发剂使用2～4mL甲苯。
步骤（1）所述的沉淀均指往旋转蒸发后溶液加入10倍体积的0℃体积分数为50%的甲醇水溶液进行沉淀。
步骤（2）所述的去除催化剂指将反应产物溶解于四氢呋喃后，过中性氧化铝层析柱，四氢呋喃洗脱，除去催化剂。
步骤（2）所述的滤液后处理指将滤液旋蒸蒸发、加入10倍体积的正己烷中沉淀、过滤、干燥。
当制备两亲性pH响应4杂臂星型共聚物时，所述小分子引发剂指2‑溴异丁酸季戊四醇二酯，由以下方法制备得到：将摩尔比为1:2:2的季戊四醇、2‑溴异丁酰溴、三乙胺溶解于四氢呋喃（THF）中，在冰水浴中反应4～6h，然后在室温下反应16～30h，经旋转蒸发、沉淀、过滤、干燥，得到2‑溴异丁酸季戊四醇二酯。
所述四氢呋喃的用量为每1g季戊四醇使用20～25mL THF。
当制备两亲性pH响应6杂臂星型共聚物时，所述小分子引发剂指2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯，由以下方法制备得到：将摩尔比为1:3:3的二季戊四醇、2‑溴异丁酰溴、三乙胺溶解于THF中，在冰水浴中反应4～6h，然后在室温下反应16～30h，经旋转蒸发、沉淀、过滤、干燥，得到2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯。
所述THF的用量为每1g二季戊四醇使用10～15mL THF。
上述两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物在制备装载水难溶性药物胶束系统中的应用。
所述装载水难溶性药物胶束系统由以下方法制备得到：将两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物和水难溶性药物溶于有机溶剂中，室温下搅拌4～6h，去离子水透析24～48h，冷冻干燥，得到装载水难溶性药物胶束系统。
所述的水难溶性药物指在1L水中溶解度小于或等于1g的药物。
所述的有机溶剂指二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的至少一种。
所述的装载水难溶性药物胶束系统可控制装载的药物在正常组织（pH7.4）时缓慢释放，在肿瘤细胞弱酸性条件（pH5～6）下快速可控释放。
本发明的机理为：
本发明公开的两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物是性能优异、具有pH敏感性的载药材料。聚己内酯（PCL）作为胶束的疏水内核，用于增溶难溶性抗癌药物。聚合得到的聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯结构（PDEAEMA）为pH响应中间层，在生理pH（7.4）下是疏水状态，收缩在PCL表面共同作为内核，可以有效防止药物突释现象；在肿瘤组织弱酸性条件下侧链的氨基发生质子化作用带正电，易与带负电的细胞膜发生吸附作用，进而被胞吞到细胞内；进入溶酶体的强酸性环境后，进一步质子化，胶束发生溶胀，将药物释放到细胞质和细胞核中。PPEGMA作为亲水外层，有利于提高胶束壳层密度，增强胶束表面的亲水性、抗蛋白和血小板吸附能力，提高胶束的稳定性，从而延长胶束在体内的循环时间，改善胶束载药体系的控释性能。可通过调节聚合物分子材料中各基团的含量来调控药物的释放速率，满足不同药物的释放要求。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
（1）本发明的制备方法操作简单，反应条件温和，易于调控两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物的臂长，分子量在较宽的范围内可调。
（2）本发明制备得到的两亲性pH响应4/6杂臂星型共聚物应用于制备装载水难溶性药物胶束系统，可满足不同药物的释放要求。
附图说明
图1为实施例1中(PCL)₂(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₂的GPC洗脱曲线。
图2为实施例1中(PCL)₂(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₂的¹H NMR谱，溶剂为d‑CDCl3。
图3为实施例4中(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃的GPC洗脱曲线。
图4为实施例4中(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃的¹H NMR谱，溶剂为d‑CDCl3。
图5为实施例8中(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃的临界胶束浓度测试曲线。
图6为实施例9中(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃载药胶束的扫描电镜（SEM）图。
图7为实施例10中(PCL)₂(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₂（实施例2产物）载阿霉素胶束的体外释放曲线。
图8为实施10中(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃（实施例4产物）载阿霉素胶束的体外释放曲线。
图9为实施11中(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃空白胶束的体外细胞毒性。
图10为实施11中(PCL)₂(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₂和(PCL)₃‑(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃载阿霉素胶束的体外细胞毒性。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：两亲性pH响应4杂臂星型共聚物的制备
（1）小分子引发剂2‑溴异丁酸季戊四醇二酯的制备：于250mL三口烧瓶中称取6.08g（0.05mol）季戊四醇（Alfa‑Aesar），加入150mL无水THF，通氩气10min除氧。密封烧瓶后，注入10.12g（0.1mol）三乙胺（TEA，AR，江苏永华）。0℃冰水浴中，逐滴注入22.98g（0.1mol）2‑溴异丁酰溴（Alfa‑Aesar），搅拌反应4h，再在室温25℃下搅拌反应30h。将反应液转入分液漏斗中，加入300mL乙醚，并依次用200mL水、200mL0.5M的碳酸氢钠溶液和200mL水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，溶液旋蒸得到白色固体（产率为56%），乙醚重结晶两次后在40℃、35mb真空干燥24h，合成反应式见公式（3），得到2‑溴异丁酸季戊四醇二酯。
（2）聚己内酯大分子引发剂（(PLC)₂‑Br₂）的制备：将0.43g步骤（1）制备得到的2‑溴异丁酸季戊四醇二酯加入烧瓶中，橡皮塞密封，抽真空‑通氩气3次，氩气保护下加入6gε‑己内酯（ε‑CL，Sigma‑Aldrich）和0.01g辛酸亚锡（Sn(Oct)₂，国药集团），用液氮进行三次冷冻‑抽气‑升温循环后，在氩气保护下置于130℃油浴中反应24h后用液氮终止反应。减压蒸馏后，用50mLTHF溶解，加入500mL体积分数为50%的冷甲醇水溶液，沉淀后过滤，产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末，合成反应式见公式（4）。产率为83%，M_n=5007，PDI=1.49。
（3）两亲性pH响应4杂臂星型共聚物（(PCL)₂(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₂）的制备：取4.8g步骤（2）制备得到的(PLC)₂‑Br₂、溴化铜（CuBr₂，上海新宝）于茄形瓶中，密封，抽真空‑通氩气3次，依次将18mL甲苯、单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（DEAEMA，TCI‑EP）、配体六甲基三亚乙基四胺（HMTETA，Sigma‑Aldrich）注入反应瓶中，搅拌10min使催化剂配合物Cu/HMTETA形成。将Sn(Oct)₂（0.26g）溶于2mL甲苯中，注入反应瓶。搅拌5min后转入70℃油浴中反应7h；再注入甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯（PEGMA，M_n=475，Sigma‑Aldrich）进行连续聚合，反应7h后，冷却至室温，加入50mL THF并搅拌溶解，过中性氧化铝柱子，去除催化剂，得到反应液浓缩至约50mL后加入到500mL正己烷中沉淀，过滤。产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末，合成反应式见公式（5），利用GPC测定其分子量，并进行核磁分析，见图1和图2。产率为93%，M_n=28200，PDI=1.28。
其中，各反应物的重量份数配方如下：





实施例2：两亲性pH响应4杂臂星型共聚物的制备
（1）小分子引发剂2‑溴异丁酸季戊四醇二酯的制备：于250mL三口烧瓶中称取6.08g（0.05mol）季戊四醇（Alfa‑Aesar），加入150mL无水THF，通氩气10min除氧。密封烧瓶后，注入10.12g（0.1mol）TEA（AR，江苏永华）。0℃冰水浴中，逐滴注入22.98g（0.1mol）2‑溴异丁酰溴（Alfa‑Aesar），搅拌反应6h，再在室温25℃下搅拌反应16h。将反应液转入分液漏斗中，加入300mL乙醚，并依次用200mL水、200mL0.5M的碳酸氢钠溶液和200mL水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，溶液旋蒸得到白色固体（产率为56%），乙醚重结晶两次后在40℃、35mb真空干燥24h，得到2‑溴异丁酸季戊四醇二酯。
（2）(PCL)₂‑Br₂的制备：将0.6g步骤（1）制备得到的2‑溴异丁酸季戊四醇二酯加入烧瓶中，橡皮塞密封，抽真空‑通氩气3次，氩气保护下加入9gε‑CL（Sigma‑Aldrich）和0.01g Sn(Oct)₂（国药集团），用液氮进行三次冷冻‑抽气‑升温循环后，在氩气保护下置于140℃油浴中反应24h后用液氮终止反应。减压蒸馏后，用50mL THF溶解，加入500mL体积分数为50%的冷甲醇水溶液，沉淀后过滤，产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为96%，M_n=8633，PDI=1.53。
（3）两亲性pH响应4杂臂星型共聚物（(PCL)₂(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₂）的制备：取7.2g步骤（2）制备得到的(PLC)₂‑Br₂、CuBr₂（上海新宝）于茄形瓶中，密封，抽真空‑通氩气3次，依次将18mL甲苯、单体DEAEMA（TCI‑EP）、配体HMTETA（Sigma‑Aldrich）注入反应瓶中，搅拌10min使催化剂配合物Cu/HMTETA形成。将Sn(Oct)₂（0.32g）溶于2mL甲苯中，注入反应瓶。搅拌5min后转入60℃油浴中反应5h；再注入PEGMA（M_n=475，Sigma‑Aldrich）进行连续聚合，反应12h后，冷却至室温，加入50mL THF并搅拌溶解，过中性氧化铝柱子，去除催化剂，得到反应液浓缩至约50mL后加入到500mL正己烷中沉淀，过滤。产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为98%，M_n=28524，PDI=1.43。
其中，各反应物的重量份数配方如下：

实施例3：两亲性pH响应4杂臂星型共聚物的制备
（1）小分子引发剂2‑溴异丁酸季戊四醇二酯的制备：于250mL三口烧瓶中称取6.08g（0.05mol）季戊四醇（Alfa‑Aesar），加入150mL无水THF，通氩气10min除氧。密封烧瓶后，注入10.12g（0.1mol）TEA（AR，江苏永华）。0℃冰水浴中，逐滴注入22.98g（0.1mol）2‑溴异丁酰溴（Alfa‑Aesar），搅拌反应5h，再在室温25℃下搅拌反应24h。将反应液转入分液漏斗中，加入300mL乙醚，并依次用200mL水、200mL0.5M的碳酸氢钠溶液和200mL水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，溶液旋蒸得到白色固体（产率为56%），乙醚重结晶两次后在40℃、35mb真空干燥24h，得到2‑溴异丁酸季戊四醇二酯。
（2）(PCL)₂‑Br₂的制备：将0.29g步骤（1）制备得到的2‑溴异丁酸季戊四醇二酯加入烧瓶中，橡皮塞密封，抽真空‑通氩气3次，氩气保护下加入6gε‑CL（Sigma‑Aldrich）和0.01g Sn(Oct)₂（国药集团），用液氮进行三次冷冻‑抽气‑升温循环后，在氩气保护下置于120℃油浴中反应48h后用液氮终止反应。减压蒸馏后，用50mL THF溶解，加入500mL体积分数为50%的冷甲醇水溶液，沉淀后过滤，产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为96%，M_n=5741，PDI=1.38。
（3）两亲性pH响应4杂臂星型共聚物（(PCL)₂(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₂）的制备：取4.8g步骤（2）制备得到的(PLC)₂‑Br₂、CuBr₂（上海新宝）于茄形瓶中，密封，抽真空‑通氩气3次，依次将18mL无水甲苯、单体DEAEMA（TCI‑EP）、配体HMTETA（Sigma‑Aldrich）注入反应瓶中，搅拌10min使催化剂配合物Cu/HMTETA形成。将Sn(Oct)₂（0.16g）溶于2mL甲苯中，注入反应瓶。搅拌5min后转入90℃油浴中反应10h；再注入PEGMA（M_n=475，Sigma‑Aldrich）进行连续聚合，反应8h后，冷却至室温，加入50mL THF并搅拌溶解，过中性氧化铝柱子，去除催化剂，得到反应液浓缩至约50mL后加入到500mL正己烷中沉淀，过滤。产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为76%，M_n=40470，PDI=1.37。
其中，各反应物的重量份数配方如下：


实施例4：两亲性pH响应6杂臂星型共聚物的制备
（1）小分子引发剂2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯的制备：于250mL三口烧瓶中称取12.72g（0.05mol）二季戊四醇（Alfa‑Aesar），加入150mL无水THF，通氩气10min除氧。密封烧瓶后，注入15.17g（0.15mol）TEA（AR，江苏永华）。0℃冰水浴中，逐滴注入34.48g（0.15mol）2‑溴异丁酰溴（Alfa‑Aesar），搅拌反应4h，再在室温25℃下搅拌反应30h。将反应液转入分液漏斗中，加入300mL乙醚，并依次用200mL水、200mL0.5M的碳酸氢钠溶液和200mL水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，溶液旋蒸得到白色固体（产率为43%），乙醚重结晶两次后在40℃、35mb真空干燥24h，得到2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯。
（2）(PCL)₃‑Br₃的制备：将0.93g步骤（1）制备得到的2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯加入烧瓶中，橡皮塞密封，抽真空‑通氩气3次，氩气保护下加入6gε‑CL（Sigma‑Aldrich）和0.01g Sn(Oct)₂（国药集团），用液氮进行三次冷冻‑抽气‑升温循环后，在氩气保护下置于130℃油浴中反应24h后用液氮终止反应。减压蒸馏后，用50mL THF溶解，加入500mL体积分数为50%的冷甲醇水溶液，沉淀后过滤，产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为100%，M_n=6090，PDI=1.28。
（3）两亲性pH响应6杂臂星型共聚物（(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃）的制备：取4.8g步骤（2）制备得到的(PLC)₃‑Br₃、CuBr₂（上海新宝）于茄形瓶中，密封，抽真空‑通氩气3次，依次将18mL无水甲苯、单体DEAEMA（TCI‑EP）、配体HMTETA（Sigma‑Aldrich）注入反应瓶中，搅拌10min使催化剂配合物Cu/HMTETA形成。将Sn(Oct)₂（0.26g）溶于2mL甲苯中，注入反应瓶。搅拌5min后转入80℃油浴中反应8h；再注入PEGMA（M_n=475，Sigma‑Aldrich）进行连续聚合，反应6h后，冷却至室温，加入50mL THF并搅拌溶解，过中性氧化铝柱子，去除催化剂，得到反应液浓缩至约50mL后加入到500mL正己烷中沉淀，过滤。产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末，利用GPC测定其分子量，并进行核磁分析，见图3和图4。产率为67%，M_n=23100，PDI=1.31。
其中，各反应物的重量份数配方如下：

实施例5：两亲性pH响应6杂臂星型共聚物的制备
（1）小分子引发剂2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯的制备：于250mL三口烧瓶中称取12.72g（0.05mol）二季戊四醇（Alfa‑Aesar），加入150mL无水THF，通氩气10min除氧。密封烧瓶后，注入15.17g（0.15mol）TEA（AR，江苏永华）。0℃冰水浴中，逐滴注入34.48g（0.15mol）2‑溴异丁酰溴（Alfa‑Aesar），搅拌反应6h，再在室温25℃下搅拌反应16h。将反应液转入分液漏斗中，加入300mL乙醚，并依次用200mL水、200mL0.5M的碳酸氢钠溶液和200mL水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，溶液旋蒸得到白色固体（产率为43%），乙醚重结晶两次后在40℃、35mb真空干燥24h，得到2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯。
（2）(PCL)₃‑Br₃的制备：将0.93g步骤（1）制备得到的2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯加入烧瓶中，橡皮塞密封，抽真空‑通氩气3次，氩气保护下加入12gε‑CL（Sigma‑Aldrich）和0.01g Sn(Oct)₂（国药集团），用液氮进行三次冷冻‑抽气‑升温循环后，在氩气保护下置于110℃油浴中反应48h后用液氮终止反应。减压蒸馏后，用50mL THF溶解，加入500mL体积分数为50%的冷甲醇水溶液，沉淀后过滤，产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为92%，M_n=11031，PDI=1.36。
（3）两亲性pH响应6杂臂星型共聚物（(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃）的制备：取6.36g步骤（2）制备得到的(PLC)₃‑Br₃、CuBr₂（上海新宝）于茄形瓶中，密封，抽真空‑通氩气3次，依次将18mL无水甲苯、单体DEAEMA（TCI‑EP）、配体HMTETA（Sigma‑Aldrich）注入反应瓶中，搅拌10min使催化剂配合物Cu/HMTETA形成。将Sn(Oct)₂（0.16g）溶于2mL甲苯中，注入反应瓶。搅拌5min后转入60℃油浴中反应12h；再注入PEGMA（M_n=475，Sigma‑Aldrich）进行连续聚合，反应5h后，冷却至室温，加入50mL THF并搅拌溶解，过中性氧化铝柱子，去除催化剂，得到反应液浓缩至约50mL后加入到500mL正己烷中沉淀，过滤。产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为81%，M_n=39270，PDI=1.43。
其中，各反应物的重量份数配方如下：

实施例6：两亲性pH响应6杂臂星型共聚物的制备
（1）小分子引发剂2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯的制备：于250mL三口烧瓶中称取12.72g（0.05mol）二季戊四醇（Alfa‑Aesar），加入150mL无水THF，通氩气10min除氧。密封烧瓶后，注入15.17g（0.15mol）TEA（AR，江苏永华）。0℃冰水浴中，逐滴注入34.48g（0.15mol）2‑溴异丁酰溴（Alfa‑Aesar），搅拌反应5h，再在室温25℃下搅拌反应24h。将反应液转入分液漏斗中，加入300mL乙醚，并依次用200mL水、200mL0.5M的碳酸氢钠溶液和200mL水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，溶液旋蒸得到白色固体（产率为43%），乙醚重结晶两次后在40℃、35mb真空干燥24h，得到2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯。
（2）(PCL)₃‑Br₃的制备：将0.07g步骤（1）制备得到的2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯加入烧瓶中，橡皮塞密封，抽真空‑通氩气3次，氩气保护下加入12gε‑CL（Sigma‑Aldrich）和0.01g Sn(Oct)₂（国药集团），用液氮进行三次冷冻‑抽气‑升温循环后，在氩气保护下置于130℃油浴中反应36h后用液氮终止反应。减压蒸馏后，用50mL THF溶解，加入500mL体积分数为50%的冷甲醇水溶液，沉淀后过滤，产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为88%，M_n=10500，PDI=1.45。
（3）两亲性pH响应6杂臂星型共聚物（(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃）的制备：取6.36g步骤（2）制备得到的(PLC)₃‑Br₃、CuBr₂（上海新宝）于茄形瓶中，密封，抽真空‑通氩气3次，依次将18mL无水甲苯、单体DEAEMA（TCI‑EP）、配体HMTETA（Sigma‑Aldrich）注入反应瓶中，搅拌10min使催化剂配合物Cu/HMTETA形成。将Sn(Oct)₂（0.32g）溶于2mL甲苯中，注入反应瓶。搅拌5min后转入90℃油浴中反应5h；再注入PEGMA（M_n=475，Sigma‑Aldrich）进行连续聚合，反应12h后，冷却至室温，加入50mL THF并搅拌溶解，过中性氧化铝柱子，去除催化剂，得到反应液浓缩至约50mL后加入到500mL正己烷中沉淀，过滤。产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为45%，M_n=33410，PDI=1.45。
其中，各反应物的重量份数配方如下：

实施例7：两亲性pH响应6杂臂星型共聚物的制备
（1）小分子引发剂2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯的制备：于250mL三口烧瓶中称取12.72g（0.05mol）二季戊四醇（Alfa‑Aesar），加入150mL无水THF，通氩气10min除氧。密封烧瓶后，注入15.17g（0.15mol）TEA（AR，江苏永华）。0℃冰水浴中，逐滴注入34.48g（0.15mol）2‑溴异丁酰溴（Alfa‑Aesar），搅拌反应5h，再在室温25℃下搅拌反应24h。将反应液转入分液漏斗中，加入300mL乙醚，并依次用200mL水、200mL0.5M的碳酸氢钠溶液和200mL水萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，溶液旋蒸得到白色固体（产率为43%），乙醚重结晶两次后在40℃、35mb真空干燥24h，得到2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯。
（2）(PCL)₃‑Br₃的制备：将0.29g步骤（1）制备得到的2‑溴异丁酸二季戊四醇三酯加入烧瓶中，橡皮塞密封，抽真空‑通氩气3次，氩气保护下加入12gε‑CL（Sigma‑Aldrich）和0.02g Sn(Oct)₂（国药集团），用液氮进行三次冷冻‑抽气‑升温循环后，在氩气保护下置于120℃油浴中反应48h后用液氮终止反应。减压蒸馏后，用50mL THF溶解，加入500mL体积分数为50%的冷甲醇水溶液，沉淀后过滤，产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为86%，M_n=10376，PDI=1.59。
（3）两亲性pH响应6杂臂星型共聚物（(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃）的制备：取6.36g步骤（2）制备得到的(PLC)₃‑Br₃、CuBr₂（上海新宝）于茄形瓶中，密封，抽真空‑通氩气3次，依次将18mL无水甲苯、单体DEAEMA（TCI‑EP）、配体HMTETA（Sigma‑Aldrich）注入反应瓶中，搅拌10min使催化剂配合物Cu/HMTETA形成。将Sn(Oct)₂（0.32g）溶于2mL甲苯中，注入反应瓶。搅拌5min后转入80℃油浴中反应7h；再注入PEGMA（M_n=475，Sigma‑Aldrich））进行连续聚合，反应12h后，冷却至室温，加入50mL THF并搅拌溶解，过中性氧化铝柱子，去除催化剂，得到反应液浓缩至约50mL后加入到500mL正己烷中沉淀，过滤。产物在40℃、35mb真空干燥24h，得到白色粉末。产率为55%，M_n=37295，PDI=1.59。
其中，各反应物的重量份数配方如下：


实施例8：两亲性pH响应6杂臂星型共聚物的临近胶束浓度
利用荧光探针法测试实施例4制备得到的两亲性pH响应6杂臂星型共聚物(PCL)_3‑(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃的临近胶束浓度。
（1）芘溶液的配置：用丙酮溶解芘（Sigma‑Aldrich），配置浓度为12×10^‑5M的芘溶液。
（2）样品溶液的配置：称取10mg(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃溶于5mL丙酮中，逐滴加入到100mL去离子水中，挥发丙酮后得到0.1mg/mL的溶液，稀释成一系列浓度（浓度范围为0.0001～0.1mg/mL）。取20支10mL容量瓶，分别加入0.1mL步骤（1）配置的芘溶液，然后分别加上上述不同浓度的共聚物溶液定容，摇匀，得到样品溶液。样品溶液中芘的浓度为12×10^‑7M。
（3）荧光光谱测试：以373nm作为发射波长，测试样品溶液在300～350nm的激发光谱，取波长为339nm和336nm的强度比值（I₃₃₉/I₃₃₆）对浓度对数logC作图，见图5，曲线转折点即为临界胶束浓度值。测得实施例4制备得到的(PCL)_3‑(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃的临近胶束浓度为3.4mg/L。
实施例9：两亲性pH响应6杂臂星型共聚物载药胶束的制备
采用透析法制备载药胶束：称取20mg阿霉素（DOX，北京华奉联博）溶于20mL二甲基甲酰胺（DMF）中，加入2倍摩尔量的TEA20μL，搅拌12h。称取40mg实施例4制备得到的两亲性pH响应6杂臂星型共聚物(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃溶于20mL二甲基亚砜（DMSO）中，将两种溶液混合，搅拌4h，去离子水透析24h，前12h每4h换一次水，随后6h换一次水。经0.45m过滤头过滤后冻干，即得到DOX载药胶束粉末。采用SEM观察其形貌为球形，粒径范围为100～180nm，见图6。
实施例10：载药胶束的体外释放
按照实施例9制备方法，利用实施例2制备得到的两亲性pH响应4杂臂星型共聚物(PCL)₂(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₂制备得到DOX载药胶束Ⅰ。实施例9制备得到DOX载药胶束Ⅱ。
体外释放试验：分别称取5mg DOX载药胶束Ⅰ和DOX载药胶束Ⅱ分散于5mL缓冲液中（醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液），缓冲液pH值分别为5.0、6.5和7.4。将上述分散于置于透析袋中，转入40mL相同pH值的缓冲液中，置于药物溶出仪，在37℃，110rpm转速下进行体外释放。定时取样3mL进行紫外分析，并同时补加3mL新鲜缓冲液。用紫外分光光度法测定不同时间释芳液中DOX浓度，绘制体外释放曲线，见图7和图8。
由图7可见，在正常组织的pH7.4环境下，DOX的释放速率非常慢，24h的累积释药量只有22%左右，96h的累积释药量为35%。当pH降低至6.5（即肿瘤组织附近条件）时，DOX的释放速率加快，24h以及96h的累积释放量与pH7.4相比分别增加了5%和10%左右。而在肿瘤细胞内涵体的pH5.0环境下，DOX的释放速率明显加快，24h累积释放量增加到50%，48h达到62%，96h释放了91%。
同理，由图8可见，在正常组织的pH7.4环境下，DOX的释放速率非常慢，24h的累积释药量只有25%左右，96h的累积释药量为38%。当pH降低至6.5（即肿瘤组织附近条件）时，DOX的释放速率加快，24h以及96h的累积释放量与pH7.4相比都增加了10%左右。而在肿瘤细胞内涵体的pH5.0环境下，DOX的释放速率明显加快，24h累积释放量增加到65%，48h达到80%，96h释放了96%。
实施例11：两亲性pH响应6杂臂星型共聚物胶束的细胞毒性测试
（1）空白胶束制备：按照实施例9的方法，不添加阿霉素，制备得到实施例4共聚物的空白胶束。
（2）毒性测试：取96孔平底组织培养板，将四周孔板中分别加入200μL细胞培养基（DMEM）作为空白组。中间60个孔中每孔以1x10⁴细胞/孔（200μL）的细胞浓度接种HepG2细胞（购买于ATCC），其中第2列作为对照，将96孔板放置到37℃，饱和湿度，5%CO₂培养箱中培养48h。
随后将游离阿霉素、空白胶束、DOX载药胶束粉末Ⅰ和DOX载药胶束粉末Ⅱ用DMEM稀释成不同的聚合物浓度（空白胶束1～400mg/L）或药物浓度（游离阿霉素或载药胶束，0.1～20mg/L）。在移走96孔板中从第2列到第11列所有孔中的细胞培养介质后，在第2列中加入新鲜的培养介质，作为对照。从第3列到第10列，向所有的孔中分别加入200μL的样品溶液，每个浓度的样品加入到6个孔中进行重复。
在经过48h的培养后，吸走所有含有细胞的孔中的上清液，加入200μL的PBS润洗细胞，然后吸走PBS。从第2列到第11列，分别向每个孔中加入20μL的MTT溶液和180μL的培养介质，然后将96孔板放置于培养箱中培养4h。随后吸走未还原的MTT溶液和培养介质。每个孔用200μL的PBS洗一遍，并吸走PBS。向每个孔中加入200μL的DMSO溶解MTT结晶。整个96孔板放在37℃摇床中振荡10min，然后利用酶标仪测定490nm处每个孔的吸光度，进而计算细胞存活率。
图9是空白胶束（实施例4产物）的毒性结果，从图中可知，(PCL)₃(PDEAEMA‑b‑PPEGMA)₃对HepG2细胞基本无毒，在400mg/L的高浓度下细胞存活率仍然高达90%。
图10是游离DOX、DOX载药胶束Ⅰ和DOX载药胶束Ⅱ的细胞毒性结果。从图中可知，经过48h培养后，低浓度（0.1mg/L）的载药胶束就可以杀死细胞，有明显的增强作用；在高浓度（20mg/L）时，载药胶束和游离DOX杀死细胞的效果是相似的，有超过80%的细胞被杀死。实施例4产物制备的DOX载药胶束Ⅰ与游离阿霉素有相近的细胞毒性，说明阿霉素经包载后可以有效的保持其抗癌活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。