薄荷同源多倍体的诱导和检测方法 【技术领域】
本发明属于农业技术领域，涉及薄荷育种工作中的多倍体诱导和快速检测技术。
背景技术
薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)的茎、叶中富含挥发油，被广泛地应用于食品、医药、化妆品、香料、烟草等工业。薄荷全草入药，用于治疗风热感冒、风温初起、头痛、目赤、喉痹、咽喉肿痛、口舌生疮、牙痛、荨麻疹、风疹等。薄荷是我国重要的香料和药用植物之一，在江苏、安徽、江西等地广为栽培，已成为当地重要的农业特种经济作物。但是在薄荷生产中出现的品种单一、品种退化现象，使薄荷的育种工作越来越引人注目。培育薄荷优良新品种，对现行生产中的品种进行更新是一项亟待开展的工作。多倍体有很多二倍体所没有的优势性状，如植株的巨大性、抗性增加、有机合成速率加快及克服远源杂交不育性，多倍体育种用于薄荷的新品种选育具有良好的前景。多倍体育种在许多植物材料上已经成功运用，但在薄荷上的应用尚未见报道。本发明来源于多年地研究结果，提供了一种薄荷同源多倍体的诱导和检测技术，可用于薄荷的多倍体育种。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种薄荷同源多倍体的诱导和检测方法。采用本方法进行薄荷的多倍体诱导，诱导率高(可达13％)，变异株成活率高(90％以上)，鉴定和扩繁同步进行，可以大大缩短育种周期。主要内容包括如下：
1.无菌体系的建立。用薄荷茎尖做为外植体，在初代培养基上建立无菌体系。初代培养基为MS基本培养基+1.0mg·L-1 6-BA+0.2mg·L-1NAA+5.5g·L-1琼脂+30g·L-1蔗糖，pH5.5～5.8，培养条件为温度25℃，光照时间8～10h/d，光照强度1500～2000lx。
2.多倍体的诱导。取初代培养的无菌离体不定芽，用0.1％～0.2％秋水仙素溶液浸泡24～48h后，接种在不含秋水仙素的继代培养基上；或取初代培养的无菌薄荷离体不定芽，接种在添加20mg·L-1秋水仙素的继代培养基中，培养30d后转入不含秋水仙素的继代培养基中继续培养。继代培养的培养基、培养条件与初代培养相同。
3.多倍体的鉴定。处理株继代培养20d后，取其叶片，用流式细胞仪检测染色体变异状况。
4.多倍体植株的增殖培养。将染色体加倍植株的离茎尖最近的前两个带节茎段接种在含2.0mg·L-1 6-BA+0.2mg·L-1 NAA的MS增殖培养基上，培养基中含5.5g·L-1琼脂、30g·L-1蔗糖，pH 5.5～5.8，培养条件同上。培养20d，转接增殖2次。
5.多倍体植株的生根培养。将增殖苗接种在含0.5mg·L-1 6-BA+0.2mg·L-1NAA的1/2MS生根培养基上，培养基中含5.5g·L-1的琼脂、30g·L-1蔗糖，pH 5.5～5.8，培养条件同上。
6.炼苗和成苗。生根培养20d后，将生根苗培养瓶移出培养室，打开瓶盖，喷水保湿，室温炼苗4～5d，取出加倍株，洗去培养基，栽入填有腐殖土、珍珠岩和沙(4∶3∶2)的穴盘内，放在室内遮阴保湿，3～5d后将穴盘移至田间遮阴棚内，常规方法管理。
【具体实施方式】
实施例1：以薄荷品种‘68-7’为例。
切取薄荷品种‘68-7’的大田苗茎尖，肥皂水清洗15min，流水冲洗30min，75％乙醇浸泡30s，0.1％HgCl2浸泡7min，无菌水冲洗3次，接种于含1.0mg·L-16-BA和0.2mg·L-1NAA的MS初代培养基，培养基中含5.5g·L-1琼脂、30g·L-1蔗糖，pH 5.5～5.8。培养条件为温度25℃，光照时间8～10h，光照强度1500～2000lx。
取初代培养30d后的无菌苗不定芽，置于0.2％秋水仙素溶液中，保持25℃±1，在转速为90r·min-1的摇床上浸泡24h后，用无菌水冲洗干净，接种在继代培养基上培养。继代培养的培养基与培养条件同初代培养相同。培养20d后，取叶片进行倍性鉴定。
倍性鉴定采用流式细胞仪测定法。取幼叶50mg，在提取缓冲液[100mmol·L-1柠檬酸+0.5％(V/V)吐温-20(pH 2.30)]中研成粉末，500目尼龙网过滤，离心(1000r·m-1)，收集沉积细胞，加入染色液[提取缓冲液+400mmol·L-1Na2HPO4·12H2O(pH约8.9)+3000U·mL-1RNA酶A+10ug·mL-1PI]，暗处低温下染色30min。500目尼龙网过滤，滤液用Coulter Epics XL型流式细胞仪(美国Beckman公司)检测，观察细胞染色体是否加倍。
检测结果显示染色体加倍的植株即为同源多倍体。取这些植株离茎尖最近的前两个带节茎段接种在含2.0mg·L-1 6-BA和0.2mg·L-1NAA的MS增殖培养基上，培养基中含5.5g·L-1琼脂、30g·L-1蔗糖，pH 5.5～5.8。培养条件同上，培养20d，转接增殖2次。
将增殖苗接种在含0.5mg·L-1 6-BA和0.2mg·L-1NAA的1/2MS生根培养基上，培养基中含5.5g·L-1琼脂、30g·L-1蔗糖，PH 5.5～5.8。培养条件同上。
20d后将生根苗培养瓶移出培养室，打开瓶盖，喷水保湿，室温炼苗4～5d，取出后洗去根部培养基，栽入填有腐殖土、珍珠岩和沙(4∶3∶2)的穴盘内，室内放置3～5d后，移至室外遮阴棚内，1个月后移入大田。
实施例2：以薄荷品种‘73-8’为例。
除以下区别外，其他步骤和方法与实施例1相同。
取初代培养30d后的无菌苗不定芽，接种在添加20mg·L-1秋水仙素的培养基(同初代培养基)中，培养30d后，转移到不含秋水仙素的继代培养基上培养20d，用于倍性检测。