一种肿瘤细胞特异性真核表达载体 【技术领域】
本发明涉及一种真核表达载体的构建。具体地说是一种肿瘤细胞特异性真核表达载体的构建及更直观、简便、快捷的活性检测方法的建立。
背景技术
对于肿瘤基因治疗，无论采用何种治疗策略，目前面临的一个难题都是治疗的靶向性或特异性问题。因为如果所有细胞都可接受外源基因并表达，产生生物学效应，必将带来一些副作用，尤其是对于具有细胞杀伤作用的基因，这个问题尤为突出。因此，肿瘤靶向基因治疗日益受到重视。所谓肿瘤靶向基因治疗，就是使治疗基因靶向、有效的导入特定的肿瘤组织、细胞，并实现靶向高效表达，从而特异性杀伤肿瘤细胞，减少毒副作用。解决肿瘤基因治疗所面临的这一关键问题的主要策略是通过利用肿瘤组织/细胞特异性启动子调控治疗基因靶向表达。但目前发现肿瘤组织/细胞特异性启动子在嵌合基因中通常存在活性较低的问题。因此肿瘤细胞特异性的高效启动子的发现势必为肿瘤靶向基因治疗开辟新途径。
Lin CS等1993年在J Biol Chem，1993，268：2781-2801中发现L-plastin肌动蛋白结合蛋白在大量实体瘤细胞(＞90％)内高表达，参与肿瘤的发生发展，是实体瘤细胞中表达的一个新的重要标志物，L-plastin启动子能够在具有内源性L-plastin表达的肿瘤细胞和转化细胞内激活报告基因的表达，而在没有内源性L-plastin表达地正常的成纤维细胞、HeLa等细胞中没有活性。美国的Deisseroth研究组利用截短的2.4kb的L-plastin启动子构建了腺病毒载体AdLP，并对其在肿瘤治疗中的应用进行了系列研究。1999年他们在Cancer Gene Ther，1999，6(2)：99-106文章中构建了重组腺病毒载体AdLPLacZ，同时以带有CMV启动子的AdCMVLacZ为对照进行细胞转染实验，发现AdLPLacZ和AdCMVLacZ转染的乳腺癌、卵巢癌以及成纤维细胞瘤细胞中都有LacZ基因的高水平表达，而且L-plastin启动子与CMV启动子的活性相当。但AdCMVLacZ在正常成纤维细胞中高水平表达LacZ基因，而AdLPLacZ在成纤维细胞中不能启动LacZ基因的表达，转染细胞中检测不到LacZ活性。研究结果还提出2.4kb的L-plastin启动子是肿瘤细胞特异性的高效启动子。2001年他们在Cancer Res，2001，61：4405-4413文章中又将L-plastin启动子应用于自杀基因治疗，分别构建了重组自杀基因CD的腺病毒载体Ad-Lp-CD和Ad-CMV-CD，动物模型实验结果显示Ad-Lp-CD和Ad-CMV-CD具有同样的抑制肿瘤生长的能力，但Ad-Lp-CD明显使肿瘤缩小，而且研究显示含有L-plastin启动子的重组腺病毒不仅具有肿瘤细胞特异性，而且能增强肿瘤细胞对放疗和化疗药物的敏感性。上述研究结果提示2.4kb L-plastin启动子具有肿瘤细胞特异性强、活性高，能增强肿瘤细胞对放疗和化疗药物的敏感性等优点，因此L-plastin启动子的应用将为肿瘤靶向基因治疗开辟一条新途径。
但上述将2.4kb的L-plastin启动子用于肿瘤靶向基因治疗的研究中存在如下问题和缺点：首先，他们构建的腺病毒载体属于病毒类载体，存在引起的宿主炎性免疫反应较强，可能通过重组产生致病的野生型病毒，并且生产成本较高等问题；其次，研究中都是以LacZ为报告基因检测2.4kb的L-plastin启动子活性，需对转染细胞进行固定等一系列处理，并且需要相应的酶底物，如X-gal进行显色，才能分析相对活性，此方法相对较费时、繁琐。
【发明内容】
鉴于上述存在的问题，本发明的目的是提供一种相对低毒、低成本、高活性的非病毒肿瘤特异性真核表达载体以及更直观、简便、快捷的载体活性检测方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：通过分子克隆技术，利用2.4kb L-plastin启动子序列PLN置换真核表达载体pcDNA3.1上的巨细胞病毒CMV启动子，从而获得非病毒真核表达载体pcDNA3.1PLN。为了检测真核表达载体pcDNA3.1PLN的活性及肿瘤细胞特异性，特采用了一种不需抗体、辅因子、酶底物等其他成分，而且不影响宿主细胞的独特的报告蛋白——绿色荧光蛋白GFP。将GFP重组在L-plastin启动子的下游，构建报告表达载体pcDNA3.1PLN-GFP，转染肿瘤细胞和成纤维细胞后48小时收获细胞，仅用PBS洗涤两至三次，就可采用荧光激发细胞分选技术FACS在流式细胞仪上检测表达GFP细胞，根据发光细胞比率就可以分析L-plastin启动子的相对活性。检测结果表明pcDNA3.1PLN载体中L-plastin启动子启动下游基因仅在存在内源性L-plastin的肿瘤细胞和转化细胞内表达，而且启动子活性较高，与CMV启动子活性相当。在2.4kb的L-plastin启动子序列下游的多克隆位点插入肿瘤治疗基因，构建治疗表达载体，具体可为，在2.4kb的L-plastin启动子序列下游的多克隆位点EcoRI和XhoI之间插入p16基因。
本发明具有如下优点：本发明所构建的真核表达载体pcDNA3.1PLN是一种非病毒的肿瘤细胞特异性的高效表达载体，为肿瘤靶向基因治疗提供了强有力的技术支撑。以GFP为报告基因结合流式细胞术分析启动子活性较以往研究中以LacZ等报告基因更直观、简便、快捷。用本发明所构建的真核表达载体pcDNA3.1PLN介导p16，CD，p53，p21等肿瘤治疗基因进行肿瘤治疗，不仅能充分发挥治疗基因的抑瘤作用，而且具有肿瘤特异性，降低毒副作用，确保治疗的安全有效。
【附图说明】
图1为PLN片段制备示意图pcDNA3.1PLN和报告表达载体pcDNA3.1PLN-GFP的构建图
图2为PLN片段的制备及酶切鉴定
1：1kb DNA ladder；2：pBluescript SK-PLN质粒；3：pBluescript SK-PLN质粒用EcoRI+SmaI酶切；4：pBluescript SK-PLNa质粒；5：pBluescript SK-PLNa质粒用HindIII+BamHI酶切；6：回收的PLN DNA片段
图3为真核表达载体pcDNA3.1PLN，pcDNA3.1PLN-GFP，pcDNA3.1PLN-p16质粒构建示意图
图4为重组质粒pcDNA3.1-CMV-PLN的限制性内切酶分析
1：pcDNA3.1质粒；2：pcDNA3.1-CMV-PLN质粒；3：pcDNA3.1用EcoRI酶切；4：pcDNA3.1-CMV-PLN质粒用HindIII酶切；5：pcDNA3.1-CMV-PLN质粒用HindIII+BamHI酶切；6：1kb DNA ladderMaker
图5为重组pcDNA3.1PLN质粒的限制性内切酶分析
1：1kb DNA ladder Maker；2：pcDNA3.1-CMV-PLN质粒；3：pcDNA3.1-CMV-PLN用HindIII+NruI酶切；4：pcDNA3.1PLN质粒；5：pcDNA3.1PLN用EcoRI酶切；6：DNA DL-2000 Maker
图6为重组质粒pcDNA3.1PLN-GFP的限制性内切酶分析
1：1kb DNA ladder Maker；2：pcDNA3.1PLN质粒；3：pcDNA3.1PLN-GFP质粒；4：pcDNA3.1PLN质粒用EcoRI+NotI酶切；5：pcDNA3.1PLN-GFP质粒用EcoRI+NotI酶切；6：1kb DNA ladderMaker
图7为重组质粒pcDNA3.1PLN-p16的限制性内切酶分析
1：1kb DNA ladder Maker；2：pcDNA3.1PLN质粒；3：pcDNA3.1PLN-p16质粒；4：pcDNA3.1PLN质粒用EcoRI+XhoI酶切；5：pcDNA3.1PLN-p16质粒用EcoRI+XhoI酶切；6：1kb DNA ladderMaker
图8为pcDNA3.1PLN-GFP质粒转染细胞中GFP阳性细胞比率的FACS分析结果
图9为Western blot分析pcDNA3.1PLN-p16/MCF-7，pcDNA3.1PLN/MCF-7，MCF-7细胞中p16蛋白的表达
1：阳性对照HeLa细胞；2：pcDNA3.1PLN-p16/MCF-7细胞；3：pcDNA3.1PLN/MCF-7细胞；4：MCF-7细胞
图10为MCF-7，MCF-7/pcDNA3.1，MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16细胞生长曲线
图11为p16对MCF-7细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响
【具体实施方式】
实施例1 L-plastin启动子调控下肿瘤细胞特异性真核表达载体pcDNA3.1PLN的构建
一、实验材料
1.质粒和菌株
(1)pcDNA3.1(+)质粒购自Invitrogen公司，Bluescript SK质粒购自Strategen公司。
(2)大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自北京鼎国生物技术有限责任公司。
2.分子克隆主要相关试剂
(1)限制性内切酶HindIII，BamHI，EcoRI，SmaI，NruI购自大连宝生物工程有限公司。
(2)大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段(Large fragment E.coli DNA polymerase I)，T4 DNA连接酶(ligase)及其相应缓冲液，购自大连宝生物工程有限公司。
(3)dNTP(脱氧核苷三磷酸)，购自Promega公司。
(4)核酸分子量标准(1kb DNA Ladder)购自北京鼎国生物技术有限责任公司。
(5)质粒提取、纯化试剂盒，购自Promega公司。
(6)DNA回收试剂盒，购自北京鼎国生物技术有限责任公司。
(7)细菌培养用胰化蛋白胨(tryptone)，酵母提取物(yeast extract)，购自Oxid公司。
(8)琼脂糖凝胶电泳所需的琼脂糖、溴化乙锭、Tris等购自Sigma公司。
(9)其他试剂均为分析纯的国产生化试剂。
(10)Eppendorf管、移液器枪尖等塑料耗材，购自北京鼎国生物技术有限责任公司。
二、实验方法
(一)2.4kb L-plastin启动子PLN基因片段的获得
2.4kb L-plastin启动子PLN基因片段的获得具体参照文献Lin CS等J Biol Chem，1993，268：2781-2801的两篇文章及Lin CS等1993年在Mol.Cell Biol，1990，10：1818-1821获得，获得的两端带有ScaI酶切位点的2382bp的片段插入到Bluescript SK质粒的EcoRV位点后，即获得重组2.4kbL-plastin启动子的克隆载体Bluescript SK-PLN。
1.新鲜感受态细胞的制备
(1)将冻存的E.coli DH5α种植在LB固体培养基上，37℃培养过夜；
(2)挑取单个克隆接种于3mL LB液体培养基中，37℃ 180rpm振荡培养过夜；
(3)次日将菌液按1∶100转接于新鲜的LB液体培养基中，37℃ 200rpm继续振荡培养2-4h，使OD600值达到0.4；
(4)冰浴15min，使培养物冷却到0℃；
(5)将菌液移入预冷的Eppendorf管中，4000rpm，4℃离心10min；
(6)弃上清，将管倒置于滤纸上1min后，将细菌重新悬浮于500μl冰预冷的0.1mol/L CaCl2中，轻轻混匀后，置冰浴30min；
(7)4000rpm，4℃离心10min；
(8)弃上清，将管倒置于滤纸上1min；
(9)每管中加入200μl冰预冷的0.1mol/L CaCl2，重悬菌体，冰浴中保存备用。
2.大肠杆菌转化
(1)在每管200μl的感受态细菌中加入1-2μl Bluescript SK-PLN质粒，轻轻混匀，冰浴30min；
(2)将管放入预加温到42℃的循环水浴中，热休克2min；
(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(4)每管加入800μl 37℃预热的LB液体培养基，37℃ 150rpm振荡培养45min；
(5)5000rpm离心10min；
(6)弃上清，剩余100μl液体重悬菌体，并涂布于LB氨苄青霉素抗性选择固体培养基上，静置10min；
(7)倒置平皿于37℃恒温培养箱中培养12-16h。
3.质粒DNA的小量提取与纯化
按Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System试剂盒操作说明进行。
(1)挑取单个阳性克隆接种于5mL LB氨苄青霉素抗性选择液体培养基中，37℃振摇培养过夜，OD600值达到0.6；
(2)将菌液室温下10000rpm离心10min，菌体收集于1.5mL Eppendorf管中，弃上清后，将管倒置于滤纸上1min；
(3)加入250μl Cell Resuspension Solution，重新混旋菌体；
(4)加入250μl Cell Lysis Solution，颠倒离心管4次使之混匀，室温放置1-5min；
(5)加入10μl Alkaline Protease Solution，颠倒离心管4次使之混匀，室温放置5min；
(6)加入350μl Neutralization Solution，立即颠倒离心管4次使之混匀，12000rpm室温离心10min；
(7)将上清小心移入Spin Column上，12000rpm室温离心1min；
(8)弃掉管中液体，加入750μl Column Washing Solution，12000rpm室温离心1min；
(9)弃掉管中液体，加入250μl Column Washing Solution，12000rpm室温离心2min；
(10)将Spin Column转移入一新的无菌的1.5mL Eppendorf管中，用100μl Nuclease-FreeWater洗脱，12000rpm室温离心1min；
(11)弃掉Spin Column，于-20℃保存Eppendorf管中的DNA，备用。
4.PLN基因片段的制备
(1)将Bluescript SK-PLN质粒进行EcoRI和SmaI双酶切反应，37℃水浴2h；
(2)酶切反应完成后，加入大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段和dNTP，室温下温育15min将酶切片段的3′凹端补平；
(3)于75℃水浴中加热10min，以灭活反应液中的大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段和限制酶；
(4)琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，在5.34kb处可见一目标片段Bluescript SK-PLN；
(5)用DNA回收试剂盒回收目标片段Bluescript SK-PLN：
1)电泳结束后，在紫外观测仪上用手术刀片切取含有目标DNA片段的琼脂糖；
2)放入预先称量好的Eppendorf管中，称量、捣碎，按重量比1∶3加入溶液B；
3)50℃水浴10min，直至胶完全溶化，其间旋涡振荡三次；
4)将溶液置于离心柱中，静置1-2min，≥8000rpm离心30s-60s；
5)倒掉液体，加入500μl溶液C(用无水乙醇1∶1稀释)于离心柱中，8000rpm离心30s-60s；
6)倒掉液体，用稀释好的溶液C 500μl再洗一遍，8000rpm离心30s-60s；
7)≥15000rpm再次离心30s-60s，以甩干剩余液体；
8)将离心柱置于新的离心管中，加入≥50℃预热的50μl溶液D，混匀，50℃水浴中温育60min；
9)≥15000rpm离心60s，管底即为所需DNA，将DNA保存于-20℃备用。取少量DNA进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定回收片段。
(6)将回收获得的Bluescript SK-PLN片段用T4DNA连接酶进行连接反应，获得重组质粒Bluescript SK-PLNa；
(7)感受态细菌DH5α的制备及连接产物转化，方法同上；
(8)提取和纯化重组质粒Bluescript SK-PLNa，方法同上；
(9)将正确重组的质粒Bluescript SK-PLNa进行HindIII和BamHI双酶切反应，37℃水浴2h；
(10)酶切反应完成后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，在2.4kb处可见一目标片段PLN；
(11)用DNA回收试剂盒回收目标片段PLN(方法同上)，-20℃保存备用。Bluescript SK-PLN质粒进行EcoRI和SmaI双酶切反应体系
Bluescript SK-PLN 20μl
10×T Buffer 4μl
EcoRI 2μl
SmaI 2μl
0.1％BSA 4μl
ddH2O 8μl
总体积 40μl
37℃水浴2h酶切结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。
酶切片段补平反应体系
Bluescript SK-PLN质粒双酶切反应液 34μl
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段 2μl
dNTP mix 4μl
总体积 40μl
室温下温育15min后于75℃水浴中加热10min，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，回收Bluescript SK-PLN质粒大片段备用；
连接反应体系
补平的Bluescript SK-PLN质粒大片段 1μl
10×连接酶缓冲液 2μl
T4DNA连接酶 1μl
ddH2O 16μl
总体积 20μl
充分混匀，16℃连接反应过夜。
Bluescript SK-PLNa质粒HindIII和BamHI双酶切反应体系
Bluescript SK-PLNa 20μl
10×K Buffer 4μl
HindIII 2μl
BamHI 2μl
ddH2O 12μl
总体积 40μl
37℃水浴2h酶切结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，回收PLN片段备用；
(二)pcDNA3.1PLN真核表达载体的构建
1.pcDNA3.1-CMV-PLN中间载体的构建
用HindIII和BamHI双酶切含有CMV启动子的pcDNA3.1质粒，获得pcDNA3.1-CMV大载体片段后，通过连接反应将已经获得的PLN基因片段与pcDNA3.1-CMV连接构成pcDNA3.1-CMV-PLN中间重组质粒，转化感受态细菌E.coli DH5α，提取和纯化连接产物，酶切分析鉴定。
(1)限制性酶切反应
pcDNA3.1 20μl
10×K Buffer 4μl
HindIII 2μl
BamHI 2μl
ddH2O 12μl
总体积 40μl
37℃水浴2h酶切结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，回收pcDNA3.1-CMV大载体片段备用；
(2)连接反应
pcDNA3.1-CMV大载体片段 1μl
PLN基因片段 3μl
10×连接酶缓冲液 2μl
T4DNA连接酶 1μl
ddH2O 13μl
总体积 20μl
充分混匀，16℃连接反应过夜。pcDNA3.1-CMV-PLN重组中间载体的构建如图3所示。
(3)感受态细菌的制备和连接产物的转化：方法同上；
(4)质粒的提取与纯化：方法同上；
(5)pcDNA3.1-CMV-PLN重组中间载体的酶切分析鉴定
pcDNA3.1-CMV-PLN 10μl
10×K Buffer 2μl
HindIII 1μl
BamHI 1μl
ddH2O 6μl
总体积 20μl
pcDNA3.1 10μl
10×H Buffer 2μl
EcoRI 1μl
ddH2O 7μl
总体积 20μl
pcDNA3.1-CMV-PLN 10μl
10×M Buffer 2μl
HindIII 1μl
ddH2O 7μl
总体积 20μl
37℃水浴2h酶切结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。获得正确重组的pcDNA3.1-CMV-PLN中间载体。
2.pcDNA3.1PLN真核表达载体的构建
通过NruI和HindIII双酶切反应，从pcDNA3.1-CMV-PLN中间载体中去除CMV启动子部分，再通过大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段补平载体大片段后，进行连接反应，使其环化，构成pcDNA3.1PLN真核表达载体，转化感受态细菌E.coli DH5α，提取和纯化质粒并进行酶切分析鉴定。
(1)pcDNA3.1-CMV-PLN质粒的NruI和HindIII双酶切反应
pcDNA3.1-CMV-PLN 20μl
10×NruI Buffer 4μl
NruI 2μl
HindIII 2μl
0.1％BSA 4μl
ddH2O 8μl
总体积 40μl
37℃水浴2h后，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。酶切结束后，进行补平反应。
(2)酶切片段补平反应
pcDNA3.1-CMV-PLN质粒双酶切反应液 34μl
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段 2μl
dNTP mix 4μl
总体积 40μl
室温下温育15min后于75℃水浴中加热10min，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，回收补平的pcDNA3.1PLN质粒大片段备用；
(3)连接反应
补平的pcDNA3.1PLN质粒大片段 1μl
10×连接酶缓冲液 2μl
T4DNA连接酶 1μl
ddH2O 16μl
总体积 20μl
充分混匀，16℃连接反应过夜。pcDNA3.1PLN重组真核表达载体的构建如图3所示。
(4)感受态细菌的制备和连接产物的转化：方法同上；
(5)质粒的提取与纯化：方法同上；
(6)pcDNA3.1PLN重组真核表达载体的酶切分析鉴定
pcDNA3.1PLN 10μl
10×H Buffer 2μl
EcoRI 1μl
ddH2O 7μl
总体积 20μl
37℃水浴2h酶切结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。获得正确重组的pcDNA3.1PLN质粒载体
(7)由上海生工生物工程有限公司进行测序，序列如Sequence 1。
三、实验结果与分析
(一)PLN基因片段的获得和鉴定Bluescript SK-PLNa重组克隆载体的酶切分析和酶谱鉴定
2.4kb L-plastin启动子(PLN)基因片段的获得具体参照文献Lin CS等J Biol Chem，1993，268：2781-2801的两篇文章及Lin CS等1993年在Mol.Cell Biol，1990，10：1818-1821获得，获得的两端带有ScaI酶切位点的2382bp的片段插入到Bluescript SK质粒的EcoRV位点后，即获得重组2.4kbL-plastin启动子的克隆载体Bluescript SK-PLN。转化入大肠杆菌DH5α，提取质粒，为了后续表达载体构建需要，首先将Bluescript SK-PLN克隆载体中的EcoRI酶切位点去除，构建了重组克隆载体Bluescript SK-PLNa。Bluescript SK-PLN质粒经EcoRI和SmaI双酶切，并通过大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段补平后回收，得到一约5.3kb的DNA大片段。将回收的已补平的载体大片段，进行自身连接环化，得到重组克隆载体Bluescript SK-PLNa，重组质粒构建图见图1。Bluescript SK-PLNa重组质粒经HindIII和BamHI酶切后，其产物通过琼脂糖凝胶电泳，在约2.9kb和2.4kb处各出现一DNA条带，与实验预计的片段大小一致，将2.4kb的DNA条带进行回收，即获得了两端带有所需酶切位点的PLN基因片段，见图2。
(二)pcDNA3.1-CMV-PLN重组中间载体的酶切分析和鉴定
将含有CMV启动子的pcDNA3.1真核表达载体经HindIII和BamHI酶切后，酶切产物大片段与经HindIII和BamHI酶切Bluescript SK-PLNa重组质粒获得的PLN基因片段相连接，转化入大肠杆菌DH5α，提取质粒，将在琼脂糖凝胶电泳中滞后于空质粒的重组质粒样品进行酶切鉴定。经HindIII单酶切的空质粒和重组质粒，通过琼脂糖凝胶电泳时分别在大约5.4kb和7.8kb处出现一明显DNA条带，这一结果与实验设计的质粒大小一致。将重组质粒经HindIII和BamHI双酶切后，其产物通过琼脂糖凝胶电泳，在约2.4kb处出现一清晰DNA条带。以上结果表明PLN基因已经克隆入pcDNA3.1，pcDNA3.1-CMV-PLN重组中间载体的构建结果与实验设计一致。参见图3，4。
(三)pcDNA3.1PLN真核表达载体的构建
pcDNA3.1-CMV-PLN重组中间载体经HindIII和NruI双酶切后，产物经琼脂糖凝胶电泳，在7.1kb和0.7kb处分别出现一清晰DNA条带，结果与实验设计的一致，说明我们已经成功地从pcDNA3.1-CMV-PLN重组中间载体中消化掉了CMV启动子序列。将不含CMV启动子的大载体片段补平回收后进行连接反应，使其自身环化，得到pcDNA3.1PLN真核表达载体。图3为质粒构建图。获得的连接产物进行酶切鉴定分析。产物经EcoRI单酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳，得到一条DNA条带，该片段大小与pcDNA3.1-CMV-PLN重组中间载体经HindIII和NruI双酶切得到的大片段大小一致，见图5。结果表明，获得的连接产物即为pcDNA3.1PLN真核表达载体。测序结果也进一步表明我们已经成功将pcDNA3.1中的CMV启动子置换为2.4kbL-plastin启动子，构建了全长为7.1kb的L-plastin启动子调控下的肿瘤细胞特异性pcDNA3.1PLN真核表达载体。
实施例2报告表达载体pcDNA3.1PLN-GFP的构建及活性检测方法的建立
为了检测本发明中构建的真核表达载体pcDNA3.1PLN的活性及肿瘤细胞特异性，本发明特采用了一种不需抗体、辅因子、酶底物等其他成分，而且不影响宿主细胞的独特的报告蛋白——绿色荧光蛋白GFP。将GFP基因重组在pcDNA3.1PLN的L-plastin启动子的下游构建报告表达载体pcDNA3.1PLN-GFP，转染肿瘤细胞和成纤维细胞后，采用荧光激发细胞分选技术在流式细胞仪上检测表达GFP细胞，根据发光细胞比率就可以分析L-plastin启动子的相对活性及载体的肿瘤细胞特异性。具体如下：
一、实验材料
1.分子生物学相关材料及试剂
(1)质粒pEGFP-C1为Clontech公司产品。
(2)编码GFP的序列是通过聚合酶链反应(PCR)，以质粒pEGFP-C1为模板，利用如下引物(正向引物5′-GGAATTCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3′；反向引物5′-GCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′)合成具有EcoRI和NotI酶切位点的0.7kb的GFP片段，序列如Sequence 2。具体参照文献Kneen M等Biophys J，March1998，Vol.74，No.3，p.1591-1599。
(3)限制性内切酶NotI购自大连宝生物工程有限公司。
(4)菌株及其他分子克隆主要相关试剂同实施例1
2.细胞株
(1)人胶质瘤细胞系：U343细胞株由加拿大阿尔伯塔大学郝春海博士提供。
(2)人胚肾细胞系：HEK293细胞株由深圳大学刘士德老师惠赠
(3)人宫颈癌细胞系HeLa细胞株、鼠成纤维细胞系L929细胞株由吉林大学免疫教研室提供。
3.真核细胞转染所需主要材料及试剂
(1)DMEM，脂质体(Lipofectin) GIBCO公司产品。
(2)新生牛血清 杭州四季清生物工程公司。
(3)胰酶 Sigma公司产品
(4)EDTA 北京化工厂产品
(5)0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，蒸馏水定容至1000ml。
(6)细胞培养板为COSTAR产品
二、实验方法
1.pcDNA3.1PLN-GFP真核表达载体的构建
将质粒pcDNA3.1PLN进行EcoRI和NotI双酶切反应后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，，回收目标载体大片段，再通过连接反应将具有相同酶切位点的GFP片段正向插入载体pcDNA3.1PLN的多克隆位点EcoRI和NotI之间，得到重组子pcDNA3.1PLN-GFP，转化感受态细菌E.coli DH5α，提取和纯化连接产物，酶切分析鉴定。(1)限制性内切酶酶切反应
pcDNA3.1PLN 20μl
10×H Buffer 4μl
EcoRI 2μl
NotI 2μl
0.1％ BSA 4μl
ddH2O 8μl
总体积 40μl
37℃水浴2h酶切结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，DNA回收试剂盒回收pcDNA3.1PLN大载体片段备用；
(2)连接反应
pcDNA3.1PLN大载体片段 1μl
GFPcDNA片段 3μl
10×连接酶缓冲液 2μl
T4DNA连接酶 1μl
ddH2O 13μl
总体积 20μl
充分混匀，16℃连接反应过夜。pcDNA3.1PLN-GFP重组载体的构建如图3所示。
(3)感受态细菌的制备和连接产物的转化：方法同上；
(4)质粒的提取与纯化：方法同上；
(5)pcDNA3.1PLN-GFP重组载体的酶切分析鉴定
pcDNA3.1PLN 10μl
10×H Buffer 2μl
EcoRI 1μl
NotI 1μl
0.1％BSA 2μl
ddH2O 4μl
总体积 20μl
pcDNA3.1PLN-GFP 10μl
10×H Buffer 2μl
EcoRI 1μl
NotI 1μl
0.1％BSA 2μl
ddH2O 4μl
总体积 20μl
37℃水浴2h酶切结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。获得正确重组的pcDNA3.1PLN-GFP重组载体。
(6)送样品到上海生工生物工程有限公司测序。
2.pcDNA3.1-GFP载体的构建
参照质粒pcDNA3.1PLN-GFP的构建方法，将两端带有EcoRI和NotI酶切位点GFP片段正向插入载体pcDNA3.1的多克隆位点EcoRI和NotI之间，得到重组子，转化感受态细菌E.coliDH5α，提取和纯化连接产物，酶切分析鉴定。
3.细胞的培养
细胞培养于含10％新生牛血清的DMEM完全培养基中，37℃饱和湿度，5％CO2孵箱中培养。细胞贴壁生长，每3-5天，用0.25％胰酶和0.02％EDTA消化细胞，传代培养。
4.脂质体介导的细胞瞬时转染实验
(1)收获细胞，将1-2×105个细胞重悬于2ml完全培养基，转接于6孔培养板中；
(2)37℃饱和湿度，5％CO2孵箱中培养18-24小时，待细胞达40-60％融合，进行转染。转染前，将细胞培养液弃掉，用2ml无血清且无抗生素的DMEM洗涤一次；
(3)在无菌管中配制如下溶液：
溶液A：将1-2μg质粒DNA溶于100μl无血清培养基中；
溶液B：将2-20μl脂质体溶于100μl无血清培养基中，室温孵育30分钟。
(4)轻轻混合溶液A和B，置室温15分钟；
(5)加入0.8ml无血清培养基至脂质体-DNA混合物中，混匀后，小心滴加到细胞上，轻轻混匀；
(6)37℃饱和湿度，5％CO2孵箱中培养5-24小时后，弃掉转染液，加入2ml不含抗生素的完全培养基，继续培养；
(7)转染后48小时，收集细胞，进行下一步检测。
5.流式细胞术分析转染细胞发光率
细胞转染48小时后，用0.25％胰酶和0.02％EDTA消化收集细胞，用冷的PBS(pH7.4)洗涤细胞三次，每次充分悬起细胞后，用水平转头常温低速离心机1000转/分钟离心5分钟，最后，用流式细胞仪检测发光细胞比例。
三、实验结果
(一)pcDNA3.1PLN-GFP真核表达载体的构建
如图1所示，将具有EcoRI和NotI双酶切位点的GFP片段通过连接反应正向插入载体pcDNA3.1PLN的多克隆位点EcoRI和NotI之间，得到重组子pcDNA3.1PLN-GFP，转化感受态细菌E.coli DH5α，提取和纯化连接产物，将在琼脂糖凝胶电泳中滞后于空质粒的重组质粒样品进行酶切鉴定。分别将pcDNA3.1PLN和pcDNA3.1PLN-GFP质粒进行EcoRI和NotI双酶切反应后，通过琼脂糖凝胶电泳结果发现，pcDNA3.1PLN-GFP质粒得到两条DNA条带，一条在7.1kb处，与pcDNA3.1PLN进行EcoRI和NotI双酶切反应后的载体片段大小一致，另一条在0.7kb处，该片段大小与GFP片段一致，酶切鉴定结果与实验设计相符。见图3，6。
参照质粒pcDNA3.1PLN-GFP的构建方法，将两端带有EcoRI和NotI酶切位点GFP片段正向插入载体pcDNA3.1的多克隆位点EcoRI和NotI之间，成功构建了pcDNA3.1-GFP载体，以其用于活性分析的平行对照实验中。
(二)pcDNA3.1PLN真核表达载体的活性分析
将pcDNA3.1PLN-GFP和带有CMV启动子的pcDNA3.1-GFP及空质粒pcDNA3.1分别转染人的肿瘤细胞株(U343，HeLa)和转化的人胚肾细胞(HEK293)及鼠成纤维细胞株(L929)，转染48小时后收集细胞，利用流式细胞仪进行FACS(fluorescence activated cell sorting)分析，通过分析表达GFP的发光细胞百分率来确定启动子的相对活性和载体的转染效率。FACS结果如图7显示，pcDNA3.1PLN-GFP和pcDNA3.1-GFP转染的U343，HEK293的发光细胞比率明显高于空质粒(pcDNA3.1)的，而HeLa(没有内源性的L-plastin蛋白表达的肿瘤细胞株)，L929细胞中，pcDNA3.1-GFP转染后的发光率明显高于pcDNA3.1PLN-GFP和空质粒pcDNA3.1的，并且pcDNA3.1PLN-GFP和空质粒pcDNA3.1转染后的发光率差异不显著。从L-plastin启动子/CMV启动子活性比值来看，在转染的U343，HEK293细胞中L-plastin启动子的活性与CMV启动子的活性基本相当(如表所示)。检测结果表明pcDNA3.1PLN载体中L-plastin启动子启动下游基因仅在存在内源性L-plastin的肿瘤细胞和转化细胞内表达，而且启动子活性较高，与CMV启动子活性相当。这一结果与以往以LacZ为报告基因的检测结果一致。这表明我们的检测方法及报告基因的选择是可行的。以LacZ为报告基因检测L-plastin启动子活性时，需对转染细胞进行固定等一系列处理，并且需要相应的酶底物(如X-gal)进行显色，才能分析相对活性，因此，以GFP为报告基因分析启动子活性较以LacZ等报告基因更直观、简便、快捷。
表 用GFP作报告蛋白对转染细胞中L-plastin和CMV启动子的相对活性分析
启动子相对活性(GFP阳性细胞百分比)
细胞株
L-plastin CMV 相对活性(L-plastin/CMV)
U343 15.86 14.65 1.08
HeLa 6.3 23.21 0.27
HEK293 28.57 28.97 0.98
L929 7.58 36.64 0.21
实施例3 治疗表达载体pcDNA3.1PLN-p16的构建及其抑瘤效应分析
一、实验材料
1.分子生物学相关材料及试剂
(1)两端带有EcoRI和XhoI酶切位点的编码p16的序列通过反转录PCR(RT-PCR)从淋巴细胞中获得，序列如Sequence3。
(2)限制性内切酶EcoRI和XhoI购自大连宝生物工程有限公司。
(3)其他材料及试剂同实施例1和实施例2
2.细胞株 缺少p16表达的乳腺癌细胞系MCF-7细胞株由吉林大学免疫教研室提供。
3.抗体
(1)小鼠抗人p16INK4a单克隆抗体购于晶美生物工程有限公司。
(2)山羊抗小鼠IgG-HRP购于北京中山生物技术有限公司。
4.主要试剂
(1)细胞培养及稳定转染所需主要试剂
除G418为GIBCO公司产品，DMSO为Sigma公司产品外，其余同实施例2。
(2)SDS-PAGE和Western blot所需主要试剂
丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、BSA购于上海生工生物工程有限公司
SDS、Tris、甘氨酸、PMSF、DAB均为Sigma公司产品
(3)主要试剂配制
1)细胞裂解液：0.15mol/L NaCl，10m mol/L Tris-Cl(pH7.4)，5m mol/L EDTA，
1％TritonX-100，1m mol/L PMSF
2)SDS-PAGE用试剂及其他相关试剂的配置参照Sambrook J等编著的《分子克隆实验指南》第二版
二、实验方法
(一)重组p16基因的表达载体pcDNA3.1PLN-p16的构建
将质粒pcDNA3.1PLN进行EcoRI和XhoI双酶切反应，获得载体大片段，再通过连接反应将p16cDNA正向插入载体pcDNA3.1PLN的多克隆位点EcoRI和XhoI之间，得到重组子pcDNA3.1PLN-p16，转化感受态细菌E.coli DH5α，提取和纯化连接产物，酶切分析鉴定。
1.限制性内切酶酶切反应
pcDNA3.1PLN 20μl
10×H Buffer 4μl
EcoRI 2μl
XhoI 2μl
ddH2O 12μl
总体积 40μl
37℃水浴2h酶切结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，DNA回收试剂盒回收pcDNA3.1PLN大载体片段备用；
2.连接反应
pcDNA3.1PLN大载体片段 1μl
P16cDNA片段 3μl
10×连接酶缓冲液 2μl
T4DNA连接酶 1μl
ddH2O 13μl
总体积 20μl
充分混匀，16℃连接反应过夜。pcDNA3.1PLN-p16重组载体的构建如图3所示。
3.感受态细菌的制备和连接产物的转化：方法同上；
4.质粒的提取与纯化：方法同上；
5.pcDNA3.1PLN-p16重组载体的酶切分析鉴定
pcDNA3.1PLN 10μl
10×H Buffer 2μl
EcoRI 1μl
XhoI 1μl
ddH2O 6μl
总体积 20μl
pcDNA3.1PLN-p16 10μl
10×H Buffer 2μl
EcoRI 1μl
XhoI 1μl
ddH2O 6μl
总体积 20μl
37℃水浴2h酶切结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。获得正确重组的pcDNA3.1PLN-p16重组载体。
6.送样品到上海生工生物工程有限公司测序。
(二)稳定转染细胞株的建立
1.收获细胞，将1.5×105个细胞重悬于2ml完全培养基，转接于6孔培养板中；
2. 37℃饱和湿度，5％CO2孵箱中培养18-24小时，待细胞达30-50％融合，进行转染。转染前，将细胞培养液弃掉，用2ml无血清且无抗生素的DMEM洗涤一次；
3.在无菌管中配制如下溶液：
溶液A：将2μg质粒DNA(pcDNA3.1PLN或pcDNA3.1PLN-p16)溶于100μl无血清培养基中；
溶液B：将10μl脂质体溶于100μl无血清培养基中，室温孵育30分钟。
4.参照实施例2中瞬时转染的(4)-(6)；
5.转染后48小时，收集细胞，将细胞按1∶10比例转移至含有1mg/mlG418的选择培养基培养；
6.约3-5天后，更换筛选液，G418浓度降至200μg/ml，以维持筛选作用。每3天换液一次，大约2周后，2-3mm的抗性克隆形成；
7.克隆化：用无菌滤纸蘸取0.25％胰酶将阳性克隆消化下来，转移至24孔培养板中，用选择培养基继续培养；
8.扩大培养：待细胞在24孔培养板中长满后，转移至T25方瓶中培养，再转移至100ml培养瓶中扩大培养。
9.连续传代，检测外源基因的表达；
10.继续培养获得MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16和MCF-7/pcDNA3.1PLN细胞系，保存细胞。
(三)Western blot检测转染细胞中p16INK4a基因的表达
分别收集1×106个MCF-7，MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16和MCF-7/pcDNA3.1PLN细胞，冷的0.01mol/L PBS洗细胞2次后，加入100μl细胞裂解液，充分混匀，冰浴30分钟，4℃10000rpm离心10分钟，取上清测蛋白含量。将蛋白变性，经12％SDS-PAGE胶电泳分离后，通过半干式转移电泳槽将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上。转移结束后，将NC膜在3％BSA-TBST中4℃封闭过夜，TBST洗膜3次，15min 1次，5min 2次，加入抗p16INK4a单克隆抗体(抗体用封闭液按1∶200稀释)，室温作用2小时，TBST洗膜3次，15min 1次，5min 2次，加入羊抗小鼠IgG-HRP(用封闭液按1∶5000稀释)，室温孵育2小时，TBST洗3次，每次10min，与底物(DAB)在过氧化氢存在的条件下显色，蒸馏水漂洗终止反应。
(四)MCF-7细胞增殖特性分析
将1×105细胞接种于24孔细胞培养板，常规培养，每24小时计数一次，连续5天，绘制生长曲线。
(五)流式细胞仪分析p16INK4a表达对细胞周期和细胞凋亡的影响
细胞培养至对数生长期时，收集细胞，冷PBS洗2次，70％冷乙醇固定，PI染色后，以流式细胞仪进行FACS分析。
三、实验结果与分析
参照实施例2中报告载体pcDNA3.1PLN-GFP的构建方法，通过连接反应将治疗基因p16cDNA正向插入载体pcDNA3.1PLN的多克隆位点EcoRI和XhoI之间，得到重组子pcDNA3.1PLN-p16，转化感受态细菌E.coli DH5α，提取和纯化连接产物，将在琼脂糖凝胶电泳中滞后于空质粒的重组质粒样品进行酶切鉴定。分别将pcDNA3.1PLN和pcDNA3.1PLN-p16质粒进行EcoRI和XhoI双酶切反应后，通过琼脂糖凝胶电泳结果发现，pcDNA3.1PLN-p16质粒得到两条DNA条带，一条在7.1kb处，与pcDNA3.1PLN进行EcoRI和XhoI双酶切反应后的载体片段大小一致，另一条在0.8kb处，该片段大小与p16cDNA片段一致，酶切鉴定结果与实验设计相符(图3，7)。结果表明，已经成功构建治疗载体pcDNA3.1PLN-p16。
将重组p16基因的pcDNA3.1PLN-p16以及空载体pcDNA3.1PLN分别通过脂质体稳定转染乳腺癌细胞MCF-7，经新霉素G418抗性筛选后，进行如下实验分析：①分别裂解MCF-7，MCF-7/pcDNA3.1PLN及MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16细胞，以抗p16的抗体为探针进行免疫印迹分析。结果如图9显示：仅MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16细胞在约16千道尔顿处检测到一条明显的杂交带，说明在该细胞克隆中存在p16的表达，而MCF-7/pcDNA3.1PLN及MCF-7对照细胞没有检测到p16的表达。这说明p16基因已被转入MCF-7细胞，并在L-plastin启动子的调控下得到有效表达。②通过细胞生长曲线如图10，可以看出，pcDNA3.1PLN-p16的转染显著抑制了MCF-7细胞的增殖能力，而转入空质粒pcDNA3.1PLN细胞与MCF-7对照细胞增殖速度的差异不显著。③通过流式细胞仪的FACS分析细胞周期结果如图11显示：MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16细胞中G1期细胞比例较对照组(MCF-7/pcDNA3.1PLN及MCF-7对照细胞)增加近24％，S期细胞比例较对照组(MCF-7/pcDNA3.1PLN及MCF-7对照细胞)下降近15％，这一结果表明pcDNA3.1PLN-p16的转染使MCF-7细胞产生明显的G1期阻滞，抑制细胞进入S期，从而抑制细胞分裂。④通过流式细胞仪的FACS分析细胞凋亡结果见图11显示：MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16细胞中凋亡细胞百分比为23.61％，而MCF-7/pcDNA3.1PLN细胞和MCF-7对照细胞的凋亡细胞百分比分别为9.17％和11.27％，凋亡细胞百分比较对照组提高了近13％。这一结果说明pcDNA3.1PLN-p16的转染使MCF-7细胞产生明显的细胞凋亡。细胞实验结果说明pcDNA3.1PLN-p16真核表达载体能够表达功能性p16蛋白，抑制肿瘤细胞生长和增殖，并产生明显的细胞凋亡。如果用pcDNA3.1PLN-p16真核表达载体导入p16进行肿瘤治疗，不仅能充分发挥p16的抑瘤作用，而且具有肿瘤特异性，降低毒副作用，确保治疗的安全有效。
序列表
<110>OrganizationName：吉林大学
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<120>Title：一种肿瘤细胞特异性真核表达载体
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gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgag cttgatacta tgctgcacaa gcaatttaaa 240
acaccaacag caaaaaaata cacttctctg aaaaagtctt ggtctaggac ctaaacaatt 300
gcctgaaact gggtagactt acaccaatga gaggcagata aagagattaa gattgaggga 360
gtagggcagg gcttgcaatg gtgccggcca ggatgtggct gagggggtgt gggtgcctgc 420
cgtggatgct agggtagaag acgactctat taactgggtg gctgtaagca gtacccaggt 480
caatgccttt catcttctac aacctcgacg ttgcctggaa tcctaaatct ttttcttcac 540
ttaacaaaca tcacctctgc tcaaatctgc aactgctttg atatcacact gcctttttca 600
cccctctatt atagatggca tttatttact tacatgtttt ttccccacta gactatactc 660
cttgagaaca gcgattgtgt cttatttatt tctgaatcac caattcagac aggcatgcaa 720
acacttgctg aaccaatgca caaatatatt ttgctcttct tcatagattc ctccggcctc 780
agatgaccag gcaccactag atacagaaca ctgtgctttc cttctccaag gtaaaggaat 840
aaatatctgt tccccttcat gaagtgttac tgttgggcct ttatgccatc ctgaagccac 900
caggatgtgg aaccagatca gggaggtcca cagttacaac cccttgtatc tgtaacacca 960
gcaggacatt atctacagag tcctgctgca gggccccgaa tgaagacagc attttgctgc 1020
tttgtagcgt gagcagtgct gtaacagtga tgcatggatg ttcctctggt gtcctgaaag 1080
aatgtaggtg cttcttgaaa gctctctgca acttattaat tgggagtgat tatgcgatgg 1140
agaaaacaga gtccccatca ccccctcagt cttccctggg aaatcacaag agggctgata 1200
gctctctgtg aggtgaaccg tttctagaat ccccaccgtc tcgtcctgtt cttccgccca 1260
cccagttcct caagatagcc cctgtgggct tctgatgaag tcaccacacc actggctaat 1320
gaagtagata aaccagaaca gtttggttta acatttaagg tcagaaacag gaactttcta 1380
gaggagaaat caaaaaagca aaagaagtat aagggcagcc ctccaaccag tcagaatacc 1440
gtgaccacct gagaggcccg tggcccagcg gacacggacg catgtcaact ctggagcaga 1500
tatcttcagc gcagcatctg acctgggagt acagccacat accctcattc ctaaacggca 1560
gattgactac tggagtcaca cacagtctcc gggcaatgtg gagacatgtc taatatttag 1620
tcaacataac tcagggtgcc acagtcttca caactgttgt gagcacttga ggatgctcca 1680
tttgaagata ggaatttgcc ctcaagcatc tggggtttgg gtacagaaca gagcttcccc 1740
tgccaccacc tgctaatttt ataaatgtgc attcaaaaaa aaatcctgcc tgtaagaagg 1800
aattaagcta cccatttaaa tataacagct gcctgtgcaa tctactgctg ctctttatag 1860
gaaacgctta aataattgag atacttaatt gggttaaaga gatccctagc acatagatgt 1920
tctataaata aaagaatgag taaataatct agtaaccttc cttttcatgt ccttcactta 1980
aagagatcgt tctgttttgt ttgcaccaat aagatcactg ttagaggact ccagagaggt 2040
ttgatttcag gtggggtggg gctttcccaa ggaagtccct tttcattgtt tcaggtgtac 2100
tgccaccttt ttccctggct ctttcactaa aaatgaaaaa tttgttgatc tttgctgtaa 2160
gtaggtaggc atctgggctt tgcttttgca actagagtca aagaagtcaa gttatcaggc 2220
tgatcttgcc ttgctatcta gaatcagaaa ggtttaagta gcccagggac tactcaaaga 2280
cagctggagg agaaagggag agagaaaaat gcttataaag aggtgggcaa aagagcggga 2340
ccttgtctca aaaaaaaaaa aaaaaaagag gaagtggtag gaggtgtctg aatttcactg 2400
tgacctgttc tgtcaggtga tttttggtgg ggcggggaca tgaaaaaaaa gttaaaatgt 2460
ccttataaag acaaaatctt tttctttcct ggctgatgat ttgtcattct agtcacttcc 2520
tgccttgtga ccacacaccc aggcttgaca aagctgttct gcagatcaga aagaaggggt 2580
tcctggtcat acaccagtat cgaattgggg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg 2640
cagatatcca gcacagtggc ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc 2700
agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc 2760
cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc 2820
gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg 2880
ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga 2940
ggcggaaaga accagctggg gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt 3000
aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc 3060
gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca 3120
agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc 3180
caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt 3240
tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac 3300
aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc 3360
ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaattaat tctgtggaat 3420
gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 3480
atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 3540
agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc 3600
atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 3660
tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 3720
ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat atccattttc 3780
ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 3840
gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 3900
atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 3960
gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 4020
tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 4080
agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 4140
cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 4200
gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 4260
gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 4320
gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 4380
ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 4440
tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 4500
gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 4560
cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 4620
tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 4680
ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 4740
tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag 4800
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 4860
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac 4920
cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 4980
gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 5040
gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 5100
cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 5160
tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 5220
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 5280
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 5340
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 5400
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 5460
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 5520
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 5580
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 5640
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 5700
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 5760
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 5820
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 5880
ccgctggtag cggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 5940
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 6000
aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 6060
aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 6120
gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 6180
gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 6240
caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 6300
ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 6360
attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 6420
ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 6480
gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 6540
ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 6600
tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 6660
gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 6720
cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 6780
gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 6840
tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 6900
ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 6960
gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 7020
tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 7080
catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 7109
<212>Type：DNA
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SequenceName：pcDNA3.1PLN
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Other Information：
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Feature
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<221>FeatureKey：Multiple cloning site
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Other Information：
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Feature
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<221>FeatureKey：pcDNA3.1 bases 1011-5428
<222>LocationFrom：2691
<222>LocationTo：7109
Other Information：
CDSJoin：No
Journal
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Sequence：pcDNA3.1PLN：
<301>Authors：Chung I，Schwartz P E，Crystol R G，Pizzorno G，Leavitt J，
Deisseroth A
<302>Title：Use of L-plastin promoter to develop an adenoviral system that
confers transgene expression in ovarian cancer cells but not in
normal mesothelial cells
<303>JournalName：Cancer Gene Therapy
<304>Volume：6
<305>Issue：2
<306>PageRange：99-106
<307>Date：1999-03-04
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<313>To：2609
Journal
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Sequence：pcDNA3.1PLN：
<301>Authors：Lin C S，Chen Z P，Park T，Ghosh K，Leavitt J
<302>Title：Characterization of the human L-plastin gene promoter in normal
and neoplastic cells
<303>JournalName：THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
<304>Volume：268
<305>lssue：4
<306>PageRange：2793-2801
<307>Date：1993-02-05
<308>DBAccessionNumber：
<309>DBEntryDate：＿＿-＿-＿
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<213>OrganismName：Plasmid pEGFP-C1
<400>PreSequenceString：
gaattcacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 60
gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 120
gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 180
tggcccaccc tcgtgaccac cttcacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 240
cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 300
accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 360
gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 420
ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 480
cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 540
cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 600
gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 660
cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 720
tacaagtaag cggccgc 737
<212>Type：DNA
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Feature
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<221>FeatureKey：CDS
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Other Information：
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Journal
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Sequence：GFP：
<301>Authors：Kneen M，Farinas J，Li Y，Verkman A S
<302>Title：Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH
indicator
<303>JournalName：Biophysical Journal
<304>Volume：74
<305>Issue：3
<306>PageRange：1591-1599
<307>Date：1998-03-01
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<313>To：
Sequence3
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<213>OrganismName：HUMAN LYMPHOCYTE
<400>PreSequenceString：
cggagagggg gagaacagac aacgggcggc ggggagcagc atggagccgg cggcggggag 60
cagcatggag ccttcggctg actggctggc cacggccgcg gcccggggtc gggtagagga 120
ggtgcgggcg ctgctggagg cgggggcgct gcccaacgca ccgaatagtt acggtcggag 180
gccgatccag gtcatgatga tgggcagcgc ccgagtggcg gagctgctgc tgctccacgg 240
cgcggagccc aactgcgccg accccgccac tctcacccga cccgtgcacg acgctgcccg 300
ggagggcttc ctggacacgc tggtggtgct gcaccgggcc ggggcgcggc tggacgtgcg 360
cgatgcctgg ggccgtctgc ccgtggacct ggctgaggag ctgggccatc gcgatgtcgc 420
acggtacctg cgcgcggctg cggggggcac cagaggcagt aaccatgccc gcatagatgc 480
cgcggaaggt ccctcagaca tccccgattg aaagaaccag agaggctctg agaaacctcg 540
ggaaacttag atcatcagtc accgaaggtc ctacagggcc acaactgccc ccgccacaac 600
ccaccccgct ttcgtagttt tcatttagaa aatagagctt ttaaaaatgt cctgcctttt 660
aacgtagata taagccttcc cccactaccg taaatgtcca tttatatcat tttttatata 720
ttcttataaa aatgtaaaaa agaaaaacac cgcttctgcc ttttcactgt gttggagttt 780
aaaaatgtaa aaaagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 818
<212>Type：DNA
<211>Length：818
SequenceName：P16
SequenceDescription：
Journal
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Sequence：P16：
<301>Authors：Serrano M，Hannon GJ，Beach D
<302>Title：A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific
inhibition of cyclinD/CDK4
<303>JournalName：Nature
<304>Volume：366
<305>Issue：47
<306>PageRange：704-707
<307>Date：1993-12-16
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