一种抗SARS－COVIGY抗体及其制备方法.pdf

本发明的公开一种新型的用于治疗、预防SARS－CoV的鸡抗SARS－CoV IgY抗体蛋，同是本发明公开一种新型的用于治疗、预防诊断SARS－CoV的鸡抗SARS－CoV IgY抗体。本发明抗体能特异消灭SARS－CoV，对非典型肺炎的治疗和预防有很好的效果。

1.  一种特异性鸡抗SARS-CoV的IgY抗体，其特征在于该抗体是由如下方法制备的：
1)纯化的灭活SARS-CoV抗原与等量不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，经胸肌及大腿内侧肌肉免疫检疫的育龄来亨鸡母鸡，间隔10天免疫一次，共免疫3次，免疫前后当提纯的鸡蛋黄抗体对流电泳效价达1∶64、间接ELISA抗体效价达1∶6400以上收集鸡蛋；
2)生产抗SARS-CoV IgY抗体的鸡，每间隔一个月再用纯化灭活SARS-CoV抗原与福氏不完全佐剂加强免疫，收集抗体鸡蛋；
3)弃蛋壳、蛋清及卵黄膜，取出卵黄与蒸馏水按1∶8稀释，充分混匀后4℃过夜，取上清液离心，再弃沉淀及上层脂质，取中层清液加入19％(w/v)固体硫酸钠，45℃水浴，充分溶解再离心。沉淀溶于适量蒸馏水，6万超滤柱超滤除盐、浓缩和去杂蛋白，滤液为纯化的鸡抗SARS-CoV IgY抗体，制备喷雾剂型及冻干制品。
4)分离蛋清和蛋黄，及去外膜的蛋黄用7倍无菌蒸馏水稀释，并调pH5.0，离心，上清液干燥获得粗制分离的IgY，再经硫酸铵、硫酸纳依次沉淀，沉淀溶于生理盐水，获得纯化的IgY抗体。

2.  如权利要求1所述的特异性鸡抗SARS-CoV的IgY抗体，其特征在于制备该抗体中免疫经检疫的鸡优选25-30周来亨鸡；并在两侧翅腹下肌肉四点注射，间隔两周后用弗氏不完全佐剂乳化制备免疫原，进行第2、3、4次加强免疫，并在免疫前和免疫后7、14、28、35、42、49、56、70、80、90、100天收集鸡血清。

3.  一种鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋，其特征在于该抗体蛋是由如下方法制备的：
1)纯化的灭活SARS-CoV抗原与等量不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，经胸肌及大腿内侧肌肉免疫检疫的育龄来亨鸡母鸡(Leghorn)，间隔10天免疫一次，共免疫3次，免疫前后当提纯的鸡蛋黄抗体对流电泳效价达1∶64、间接ELISA抗体效价达1∶6400以上收集鸡蛋；
2)生产抗SARS-CoV IgY抗体的鸡，每间隔一个月再用纯化灭活SARS-CoV抗原与福氏不完全佐剂加强免疫，收集抗体鸡蛋；
3)取免疫后所产鸡蛋，弃蛋壳、蛋清及卵黄膜，取出卵黄与蒸馏水按1∶8稀释，充分混匀后4℃过夜，取上清液离心，再弃沉淀及上层脂质，取中层清液加入适量硫柳汞并用生理盐水稀释所需含量冷冻干燥，钴60照射消毒后，制备鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋黄抗体软胶囊口服剂型成品。

4.  如权利要求3所述的鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋，其特征在于制备该抗体蛋中免疫经检疫的鸡优选25-30周来亨鸡；并在两侧翅腹下肌肉四点注射，间隔两周后用弗氏不完全佐剂乳化制备免疫原，进行第2、3、4次加强免疫，并在免疫前和免疫后7、14、28、35、42、49、56、70、80、90、100天收集鸡血清。

5.  如权利要求1-2所述的特异性鸡抗SARS-CoV的IgY抗体，其特征在于该抗体所用的纯化的灭活SARS-CoV的制备包括如下步骤：
1)绿猴肾细胞的复苏、培养，取细胞种子库冻存Vero细胞株，用DMEM培养基并加入10％小牛血清培养，提供培养SARS-CoV的Vero细胞；
2)SARS冠状病毒滴定，对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV，扩增培养SARS-CoV，采用组织培养半数感染量测定SARS-CoV的毒力10⁶-10⁸，对滴定的SARS-CoV分装冻存；
3)SARS-CoV感染Vero细胞生产SARS-CoV，用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV，用无血清DMEM培养SARS-CoV；
4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液，反复冻融三次，冰冻-37℃或不冻融，收集SARS-CoV细胞培养液；
5)向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯，4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV，取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代，检测SARS-CoV灭活效果；
6)灭活的SARS-CoV培养液，4℃、离心12000rpm/min 30min，弃沉淀杂蛋白，上清为SARS-CoV液；
7)用分子量30万超滤柱超滤SARS-CoV液，浓缩和去杂蛋白，滤液为粗制灭活SARS-CoV；
8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B分子筛纯化，对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B柱层析，0.01Mtris-HCl PH7.4缓冲液洗脱，收集SARS-CoV，合并浓缩收集初步纯化SARS-CoV；
9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析纯化，用0.03MNacl、50mMTris PH8.0缓冲液洗脱，收集SARS-CoV峰，合并浓缩收集纯化SARS-CoV；
10)对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55％、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92％；
11)对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85％、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5％、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml；
12)对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC显示病毒纯度为97％；采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5％；用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带，并与恢复期SARS病人的血清发生反应，纯化灭活SARS-CoV分装放-70℃保存。

6.  如权利要求3-4所述的特异性鸡抗SARS-CoV的抗体蛋，其特征在于该抗体蛋所用的纯化的灭活SARS-CoV的制备包括如下步骤：
1)绿猴肾细胞的复苏、培养，取细胞种子库冻存Vero细胞株，用DMEM培养基并加入10％小牛血清培养，提供培养SARS-CoV的Vero细胞；
2)SARS冠状病毒滴定，对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV，扩增培养SARS-CoV，采用组织培养半数感染量测定SARS-CoV的毒力10⁶-10⁸，对滴定的SARS-CoV分装冻存；
3)SARS-CoV感染Vero细胞生产SARS-CoV，用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV，用无血清DMEM培养SARS-CoV；
4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液，反复冻融三次，冰冻-37℃或不冻融，收集SARS-CoV细胞培养液；
5)向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯，4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV，取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代，检测SARS-CoV灭活效果；
6)灭活的SARS-CoV培养液，4℃、离心12000rpm/min 30min，弃沉淀杂蛋白，上清为SARS-CoV液；
7)用分子量30万超滤柱超滤SARS-CoV液，浓缩和去杂蛋白，滤液为粗制灭活SARS-CoV；
8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B分子筛纯化，对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B柱层析，0.01Mtris-HCl PH7.4缓冲液洗脱，收集SARS-CoV，合并浓缩收集初步纯化SARS-CoV；
9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析纯化，用0.03MNacl、50mMTris PH8.0缓冲液洗脱，收集SARS-CoV峰，合并浓缩收集纯化SARS-CoV；
10)对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55％、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92％；
11)对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85％、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5％、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml；
12)对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC显示病毒纯度为97％；采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5％；用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带，并与恢复期SARS病人的血清发生反应，纯化灭活SARS-CoV分装放-70℃保存。

7.  如权利要求1-3所述的特异性鸡抗SARS-CoV的IgY抗体，其特征在于该抗体可以制备成喷雾剂型及冻干制品。

一种抗SARS-CoV IgY抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV IgY抗体抗体，特别涉及一种鸡抗SARS-CoV卵黄IgY抗体，属于生物制药和保健食品领域。
背景技术
世界卫生组织在今年3月12日发出关于非典型肺炎(atypical pneumonia)的全球性警告之后，随后WHO命名为严重急性呼吸综合征(Severe AcuteRespiratory Syndrome，SARS)。在世界科学家的高度重视、协调和组织下，引起SARS的病原体很快被确认为一种新的或变异的冠状病毒，并相应命名为SARS-CoV。自SARS爆发后很快在全球传播，现已蔓延到世界30多个国家和地区，严重地影响人们的健康和生命，成为21世纪初危害人类的头号大敌。已证实SARS-CoV是以呼吸道、消化道等部位感染为主的传染病，特别是在胃液和粪便等部位分离出SARS-CoV病原体，有很强的致病性。因此寻找一种能特异与消化道SARS-CoV中和并消灭其感染致病，将是有效治疗与预防SARS的重大问题。鉴于口服鸡蛋卵黄IgY在消化道能特异消灭一些病毒、细菌等病原体的可靠证据，并且鸡产生IgY抗体的机制与哺乳动物血清抗体通过胎盘母系获得一样，为有效治疗与预防SARS奠定了基础。基于鸡蛋黄中抗体其含量比血清高，每个蛋黄含100-200mg IgY、一只鸡每年能产生30g IgY、一年能下100个蛋，并且鸡蛋黄IgY抗体具有生产简单、价格低廉、对酸碱稳定，给药方便的优势，是其它动物生产抗体不可比拟的。
因此，研制有防治SARS的鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋，是非常有重要价值的食品保健和防治性抗体药物。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种新型的用于治疗、预防SARS-CoV的鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋；本发明的另一个目的在于公开一种新型的用于治疗、预防诊断SARS-CoV的鸡抗SARS-CoV IgY抗体。
本发明所述的鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋的制备包括以下步骤：
1)纯化的灭活SARS-CoV抗原与等量不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，经胸肌及大腿内侧肌肉免疫检疫的育龄来亨鸡母鸡(Leghorn)，间隔10天免疫一次，共免疫3次，免疫前后当提纯的鸡蛋黄抗体对流电泳效价达1∶64、间接ELISA抗体效价达1∶6400以上收集鸡蛋；
2)生产抗SARS-CoV IgY抗体的鸡，每间隔一个月再用纯化灭活SARS-CoV抗原与福氏不完全佐剂加强免疫，收集抗体鸡蛋；
3)取免疫后所产鸡蛋，弃蛋壳、蛋清及卵黄膜，取出卵黄与蒸馏水按1∶8稀释，充分混匀后4℃过夜，取上清液离心，再弃沉淀及上层脂质，取中层清液加入适量硫柳汞并用生理盐水稀释所需含量冷冻干燥，钴60照射消毒后，制备鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋黄抗体软胶囊口服剂型成品。
上述免疫经检疫的鸡优选来亨鸡(25-30周左右)。
本发明所述的鸡抗SARS-CoV IgY抗体的制备方法为：在上述鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋制备步骤1)、2)得到免疫鸡蛋基础上，弃蛋壳、蛋清及卵黄膜，取出卵黄与蒸馏水按1∶8稀释，充分混匀后4℃过夜，取上清液离心，再弃沉淀及上层脂质，取中层清液加入19％(w/v)固体硫酸钠，454℃水浴，充分溶解再离心。沉淀溶于适量蒸馏水，6万超滤柱超滤除盐、浓缩和去杂蛋白，滤液为纯化的鸡抗SARS-CoV IgY抗体，制备喷雾剂型及冻干制品。
本发明所用纯化的灭活SARS-CoV可以通过如下步骤制得：
1)绿猴肾细胞(Vero细胞)的复苏、培养，取细胞种子库冻存Vero细胞株，用DMEM培养基并加入10％小牛血清培养，提供培养SARS-CoV的Vero细胞；
2)SARS冠状病毒(SARS-CoV)滴定，对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV，扩增培养SARS-CoV，采用组织培养半数感染量(TCID₅₀)测定SARS-CoV的毒力(10⁶-10⁸)，对滴定的SARS-CoV分装冻存；
3)SARS-CoV感染Vero细胞生产SARS-CoV，用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV，用无血清DMEM培养SARS-CoV；
4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液，反复冻融三次(冰冻-37℃)或不冻融，收集SARS-CoV细胞培养液；
5)向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯，4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV，取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代，检测SARS-CoV灭活效果；
6)灭活的SARS-CoV培养液，4℃、离心12000rpm/min 30min，弃沉淀杂蛋白，上清为SARS-CoV液；
7)用分子量30万超滤柱超滤SARS-CoV液，浓缩和去杂蛋白，滤液为粗制灭活SARS-CoV；
8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B分子筛纯化，对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B柱层析，0.01Mtris-HCl PH7.4缓冲液洗脱，收集SARS-CoV，合并浓缩收集初步纯化SARS-CoV；
9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析纯化，用0.03MNacl、50mMTris PH8.0缓冲液洗脱，收集SARS-CoV峰，合并浓缩收集纯化SARS-CoV；
10)对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55％、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92％；
11)对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85％、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5％、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml；
12)对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC显示病毒纯度为97％；采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5％；用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带，并与恢复期SARS病人的血清发生反应，纯化灭活SARS-CoV分装放-70℃保存。
本发明蛋黄IgY抗体能特异与病原体特异中和和阻止病原体的感染致病，达到有效治疗与预防的作用，并且蛋黄IgY抗体具有成本低、产量高、对酸和热稳定等优势。研制抗鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋黄，用于SARS的治疗与预防是可行的，纯化抗SARS-CoV IgY用于体外免疫诊断有很高的灵敏性及特异性。
以下实验例进步说明本发明。
实验例1本发明鸡抗SARS-CoV卵黄IgY抗体防治SARS效果的评价
1)在16孔细胞培养板加入4×10⁵/孔Vero-6，培养24h加入100CTID₅₀BJ01 SARS-CoV 200ul，建立SARS-CoV感染Vero-6细胞模型，24h后用0.5mg/500mL鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体软胶囊口服剂型、用0.2mg/200mL鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体黏膜喷雾剂型分别加入SARS-CoV感染的细胞，经细胞病变法、MTT法和空斑减数法检测鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体软胶囊口服剂型和黏膜喷雾剂型具有治疗SARS-CoV的效果；
2)用0.5mg/500mL鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体软胶囊口服剂型、用0.2mg/200mL鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体黏膜喷雾剂分别加入16孔细胞培养板加入4×10⁵/孔Vero-6细胞，12h用100CTID₅₀ BJ01 SARS-CoV200ul感染Vero-6细胞，观察72h，经细胞病变法、MTT法和空斑减数法检测鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体软胶囊口服剂型和黏膜喷雾剂型具有预防SARS-CoV的效果；
3)通过对每只恒河猴1×10⁸BJ01株SARS-CoV滴鼻感染建立了感染模型，感染后6h、12h、24h、48h分别用2.0mg/粒鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体软胶囊口服剂型、用2mg/2mL鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体黏膜喷雾剂，观察15天解剖，从症状表现治疗组减轻到无、白细胞及免疫细胞逐渐恢复正常。从病原学观察到治疗组肺、肝、肾、脑、胸腺、脾脏、淋巴结、拭胭子、血液、粪便等部位分离病原体，及PCR检测S、N、M、E和X4主要病原体蛋白基因，经病毒培养和PCR扩增病原体均为阴性。从病理改变观察到治疗组肺、肝组织病理改变有不同程度的好转，并产生有效的抗SARS-CoV抗体。说明了鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体有一定的治疗SARS效果；
4)分别用2.0mg/粒鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体软胶囊口服剂型、用2mg/2mL鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体黏膜喷雾剂，每12h一次，共用4次给恒河猴预防，再用1×10⁸滴鼻感染BJ01株SARS-CoV感染攻击恒河猴，观察30天预防组恒河猴没有出现症状、发烧逐渐恢复正常、血细胞正常，没发病，分离拭胭子、血液、胃液、粪便、肺、肺、肝、肾、脑、胸腺、脾脏、淋巴结等组织器官经病毒培养和PCR扩增病原体为阴性，观察无病理改变，证明鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体有较好的预防SARS效果。实验例2  鸡抗SARS-CoV IgY鉴定
1)采用细胞病变法、蚀斑减数法检测鸡抗SARS-CoV IgY口服软胶囊蛋白含量为1∶400/1.0mg，按现有国家对人抗SARS-CoV免疫球蛋白注射液1∶40/mg为1个治疗单位(1IU)，则鸡抗SARS-CoV IgY口服软胶囊蛋成品10IU/mg，即口服软胶囊每粒1mg(10IU)；
2)采用细胞病变法、蚀斑减数法检测鸡抗SARS-CoV IgY黏膜喷雾剂蛋白含量为1∶1200/1.0mg，按现有国家对人抗SARS-CoV免疫球蛋白注射液1∶40/mg为1个治疗单位(1IU)，则鸡抗SARS-CoV IgY黏膜喷雾剂成品30IU/mg，即黏膜喷雾剂1mg(30IU)；
3)鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄IgY抗体回收率及纯度分析，制品用高压液相色谱法进行分析IgY抗体回收率及纯度：鸡抗SARS-CoV IgY抗体喷雾剂型抗体回收率64％、纯度92％，软胶囊口服剂型成品回收率90％、纯度48％；
4)鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄IgY抗体SDS-PAGE检测，采用4％的浓缩胶，7.5％的分离胶，电泳恒压150V，样品用G250考马斯亮蓝染色后再按标准程序脱色，可见在有含量高而特异的IgY蛋白条带；
5)鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋白质含量测定，采用Lowry法测鸡抗SARS-CoV IgY抗体口服软胶囊剂型、黏膜喷雾剂型成品蛋白含量：喷雾剂型蛋白含量为8.0mg/mL、喷雾剂型蛋白含量为15.0mg/mL；
6)鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄IgY的稳定性测定，制品在不同温度下(4℃、37℃)和不同时间(1周、2周、4周、2个月、3个月)观察中和抗体的活性无明显的改变；
7)鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄IgY的抗酸稳定性测定，制品用HCL调PH在2.4-7之间观察到中和抗体的活性无明显的改变，有很好的稳定性；
8)鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄IgY抗体黏膜喷雾剂型成品在兔和小鼠体内进行热源、内毒素、异常毒性观察，口服软胶无异常毒性和细菌超标；
9)鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄IgY成品，通过免疫组化证实与正常人心、肝、肺、肾、脑、脾、淋巴结、肠主要组织器官没有免疫交叉反应，通过免疫组化证实与正常猴心、肝、肺、肾、脑、脾、淋巴结、肠主要组织器官没有免疫交叉反应，证实鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄IgY没有抗人的组织成分，用于人的防治是安全地。
以下实施例均能达到上述实验例的效果。
实施例1 SARS-CoV的培养、灭活及纯化
1)绿猴肾细胞(Vero细胞)的复苏、培养，取细胞种子库冻存Vero细胞株，用DMEM培养基并加入10％小牛血清培养，提供培养SARS-CoV的Vero细胞；
2)SARS冠状病毒(SARS-CoV)滴定，对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV，扩增培养SARS-CoV，采用组织培养半数感染量(TCID₅₀)测定SARS-CoV的毒力(10⁶-10⁸)，对滴定的SARS-CoV分装冻存；
3)SARS-CoV感染Vero细胞生产SARS-CoV，用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV，用无血清DMEM培养SARS-CoV；
4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液，反复冻融三次(冰冻-37℃)或不冻融，收集SARS-CoV细胞培养液；
5)向SARS-CoV培养液加入1/4000的β-丙内酯(1/2000-1/8000均可)，4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV，取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代，检测SARS-CoV灭活效果；
6)灭活的SARS-CoV培养液，4℃、离心12000rpm/min 30min，弃沉淀杂蛋白，上清为SARS-CoV液；
7)用分子量30万超滤柱超滤SARS-CoV液，浓缩和去杂蛋白，滤液为粗制灭活SARS-CoV；
8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B分子筛纯化，对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B柱层析，0.01Mtris-HCl PH7.4缓冲液洗脱，收集SARS-CoV，合并浓缩收集初步纯化SARS-CoV；
9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析纯化，用0.03MNacl、50mMTris PH8.0缓冲液洗脱，收集SARS-CoV峰，合并浓缩收集纯化SARS-CoV；
10)对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55％、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92％；
11)对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85％、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5％、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml；
12)对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC显示病毒纯度为97％；采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5％；用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带，并与恢复期SARS病人的血清发生反应，纯化灭活SARS-CoV分装放-70℃保存。
实施例2抗SARS-CoV IgY抗体鸡蛋黄胶囊剂及抗SARS-CoV IgY抗体黏膜喷雾剂
1)纯化的灭活SARS-CoV抗原与等量不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，经胸肌及大腿内侧肌肉免疫检疫的育龄来亨鸡母鸡(Leghorn)，间隔10天免疫一次，共免疫3次，免疫前后当提纯的鸡蛋黄抗体对流电泳效价达1∶64、间接ELISA抗体效价达1∶6400以上收集鸡蛋；
2)产抗SARS-CoV IgY抗体的鸡，每间隔一个月再用纯化灭活SARS-CoV抗原与福氏不完全佐剂加强免疫，收集抗体鸡蛋；
3)SARS-CoV IgY抗体鸡蛋黄抗体中和效价的滴定，用Vero细胞或Vero-6细胞对SARS-CoV毒力测定SARS-CoV毒力是10^6-8，采用细胞病变法、蚀斑减数法检测鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋黄抗体中和效价均达1∶6400。且不同SARS-CoV标准株免疫鸡产生的中和抗体均与其它SARS-CoV毒株呈现非常好的中和抗体活性；
4)取免疫后所产鸡蛋，弃蛋壳、蛋清及卵黄膜，取出卵黄与蒸馏水按1∶8稀释，充分混匀后4℃过夜，取上清液离心，再弃沉淀及上层脂质，取中层清液冷冻干燥，钴60照射消毒后，制备鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋黄抗体软胶囊口服剂型成品。采用细胞病变法、蚀斑减数法检测鸡抗SARS-CoVIgY口服软胶囊蛋白含量为1∶400/1.0mg，按现有国家对人抗SARS-CoV免疫球蛋白注射液1∶40/mg为1个治疗单位(1IU)，则鸡抗SARS-CoV IgY口服软胶囊蛋成品10IU/mg，即口服软胶囊每粒1mg(10IU)；
5)取免疫后所产鸡蛋，弃蛋壳、蛋清及卵黄膜，取出卵黄与蒸馏水按1∶8稀释，充分混匀后4℃过夜，取上清液离心，再弃沉淀及上层脂质，取中层清液加入19％(w/v)固体硫酸钠，45℃水浴，充分溶解再离心。沉淀溶于适量蒸馏水，6万超滤柱超滤除盐、浓缩和去杂蛋白，滤液为纯化的鸡抗SARS-CoVIgY抗体，加入适量的硫柳汞防腐剂和成型剂制备鸡抗SARS-CoV IgY抗体卵黄抗体黏膜喷雾剂型成品。采用细胞病变法、蚀斑减数法检测鸡抗SARS-CoVIgY黏膜喷雾剂蛋白含量为1∶1200/1.0mg，按现有国家对人抗SARS-CoV免疫球蛋白注射液1∶40/mg为1个治疗单位(1IU)，则鸡抗SARS-CoV IgY黏膜喷雾剂成品30IU/mg，即黏膜喷雾剂1mg(30IU)。