一种用于治疗获得性免疫缺陷综合征的重组靶向融合蛋白.pdf

本发明涉及基因工程蛋白质药物领域。更具体地，本发明涉及靶向性抗HIV/SIV的蛋白质及编码它的融合基因。本发明还涉及CD4V1－TNFα ml和CD4V1－TNFα m2融合基因、包含所述融合基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和分离纯化的靶向融合蛋白－TNFα ml和CD4V1－TNFα m2以及这些融合蛋白中任意一种的用于治疗艾滋病用途。

1.  一种人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.  一种人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.  一种TNF-α的变异体的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

4.  一种TNF-α的变异体，它的氨基酸列如SEQ ID NO：4所示。

5.  一种TNF-α的变异体的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示。

6.  一种TNF-α的变异体，它的氨基酸列如SEQ ID NO：6所示。

7.  一种靶向融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白为包含能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽和具有杀细胞作用的杀伤多肽的靶向性融合蛋白。

8.  根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于所述的受体多肽是CD4，CD4V1V2或CD4V1，或者它们的相关片断，类似物或突变体，所述的杀伤多肽是包括TNFα、TNFβ、TNFγ或其衍生物或其突变体的TNF家族成员；或TNF超家族成员；或所述的多肽是来源于人体的穿孔素、补体成分C9及颗粒溶解素；或者来源于人体的颗粒酶家族的颗粒酶A，B，C，D，E、丝氨酸酯酶；或蛋白激酶C、蛋白激酶A、天冬氨酸激酶、细胞色素或DNA核酸内切酶；或可以抵御细菌的多肽和酶，如溶菌酶、防御素；或抗癌基因及其编码的蛋白质；以及一切来源于人体的具有致死细胞功能的基因及其编码蛋白质、或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物。

9.  根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于所述的TNF超家族成员是Trail，Light或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物。

10.  根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于所述的抗癌基因为P53。

11.  根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于编码所述的CD4V1的基因序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

12.  根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于所述的CD4V1基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

13.  根据权利要求7-8、11-12任一项所述的融合蛋白，其特征在于所述的杀伤多肽是TNFα的突变体TNFαm1，编码它的cDNA序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

14.  根据权利要求7-8、11-12任一项所述的融合蛋白，其特征在于所述的TNFαm1基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

15.  根据权利要求7-8、11-12任一项所述的融合蛋白，其特征在于所述的杀伤多肽是TNFα的突变体TNFαm2，编码它的cDNA序列为SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

16.  根据权利要求7-8、11-12任一项所述的融合蛋白，其特征在于所述的杀伤多肽是TNFαm2，它的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

17.  根据权利要求13所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

18.  根据权利要求14所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列是如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

19.  根据权利要求15所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

20.  根据权利要求16所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列是如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

21.  包括SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的融合基因的重组体pCW-CD4V1TNFαm1。

22.  含有权利要求21所述的重组体的载体。

23.  含有权利要求21所述的重组体的工程菌。

24.  含有能表达权利要求7所述的融合蛋白的构建质粒载体的真核或原核细胞。

25.  根据权利要求24所述的细胞，其特征在于所述的构建质粒载体是含有权利要求21所述的重组体的载体。

26.  根据权利要求24或25所述的细胞，其特征在于所述的细胞为真核细胞。

27.  制备权利要求8所述的融合蛋白的方法，包括：用权利要求17所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的包含能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽和具有杀细胞作用的杀伤多肽的靶向性融合蛋白。

28.  一种含有权利要求8所述的融合蛋白的药物组合物。

29.  权利要求8所述的融合蛋白在制备用于治疗获得性免疫缺陷综合征的药物中的用途。

30.  根据权利要求29所述的用途，其通过杀灭受HIV/SIV感染的细胞或中和游离的HIV/SIV来完成。

一种用于治疗获得性免疫缺陷综合征的重组靶向融合蛋白
技术领域
本发明涉及基因工程蛋白质药物领域。更具体地，本发明涉及靶向性抗HIV/SIV的蛋白质及编码它的融合基因。本发明还涉及CD4V1-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2融合基因、包含所述融合基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和分离纯化的靶向融合蛋白-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2以及这些融合蛋白中任意一种的用于治疗艾滋病用途。
背景技术
获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndromeAIDS)即艾滋病，是一种严重危害人类健康的疾病。AIDS是由人免疫缺陷性病毒(human immunodeficiency virus HIV)感染引起。HIV主要感染表达CD4分子的T细胞、单核/巨噬和树突状细胞，以及中枢神经细胞。据WHO2002年的数据，全球HIV感染者已超过6000万，其中1/3已死亡。在今后20年内，估计死亡人数将达到6800万。目前全球HIV/AIDS人数已居各种疾病的首位，艾滋病已成为全球的瘟疫。2002年我国31个省、市、自治区累计报告HIV感染者约89万例，但有关专家估计中国艾滋病实际感染者已达104万，以青壮年为主，其中已经死亡的约20万。如果不采取有效的控制措施，到2010年感染者数量有可能达到1000万。若防治得力在2010年可将感染者数量控制在150万以内。中国艾滋病防治形势相当严峻。
尽管目前HAART(High Active Antiretrovirus Therapy高活性抗逆转录病毒疗法)在发达国家中取得了瞩目的成绩，但大多数HIV感染者都集中在经济不发达地区，HAART昂贵的价格限制了它在这些发展中国家的应用。全球HIV感染者接受抗逆转录病毒治疗的不足100万。同时HAART本身存在一些无法克服的缺点，如HAART的毒副作用大、容易导致病毒的耐药和病毒的潜伏，而且价格昂贵。HAART不能彻底根治艾滋病。
现有的各种治疗手段，包括其它各种药物治疗，基因治疗和治疗性疫苗的研究均未取得成功。
靶向性治疗技术又称为“生物导弹”技术，正越来越引起人们的关注。一种生物导弹的设计思路是将单克隆抗体与药物、抗生素或核素偶联在一起用于临床治疗，其主要问题是靶向性差；另一种生物导弹的设计思路是运用基因工程技术将不同的功能区段拼接所构建的融合蛋白作为“分子导向”型导弹，如人工构建的融合蛋白TGF-PE40，IL2-PE40，CD4-PE40、CD4-TD(白喉毒素)，分别用于治疗恶性肿瘤，某些自身免疫性疾病与艾滋病。临床研究结果表明，此类融合蛋白虽具有良好的导向作用，但PE40、TD毒素蛋白质对人体而言是异源蛋白，具有很强的免疫原性，可迅速诱导体内产生特异针对PE40或TD的抗体，抗体产生中和效应使融合蛋白失效。因此，上述这些靶向性融合蛋白无一被应用于临床治疗。
所以在治疗AIDS领域急需低毒高效的靶向性药物。
发明内容
为了解决上述问题，因此，本发明提供了运用于抗HIV/SIV的一类融合蛋白，所述融合蛋白是包含受体多肽与来源于人体的具有杀细胞作用的杀伤多肽的靶向性融合蛋白。
本发明涉及一种人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述的SEQ ID NO：1的核苷酸序列用于融合蛋白的导向作用。
本发明进一步涉及一种人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明进一步涉及一种TNF-α的变异体的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明进一步涉及一种TNF-α的变异体，它的氨基酸列如SEQ IDNO：4所示。
本发明进一步涉及一种TNF-α的变异体的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
所述的SEQ ID NO：3和5的核苷酸序列用于融合蛋白的杀灭作用。
本发明进一步涉及一种TNF-α的变异体，它的氨基酸列如SEQ IDNO：6所示。
本发明进一步涉及一种靶向融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白为包含能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽和具有杀细胞作用的杀伤多肽的靶向性融合蛋白。
所述的受体多肽优选是CD4，CD4V1V2或CD4V1，或者它们的相关片断，类似物或突变体；所述的杀伤多肽是包括TNFα、TNFβ、TNFγ或其衍生物或其突变体的TNF家族成员；或TNF超家族成员，如Trail，Light或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物；或所述的多肽是来源于人体的穿孔素、补体成分C9及颗粒溶解素；或者来源于人体的颗粒酶家族的颗粒酶A，B，C，D，E、丝氨酸酯酶；或蛋白激酶C、蛋白激酶A、天冬氨酸激酶、细胞色素或DNA核酸内切酶；或可以抵御细菌的多肽和酶，如溶菌酶、防御素；或抗癌基因及其编码的蛋白质，如P53，以及一切来源于人体地具有致死细胞功能的基因及其编码蛋白质、或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物。
优选地，编码所述的CD4V1的基因序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
优选地，所述的CD4V1基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
优选地，所述的杀伤多肽是TNFα的突变体TNFαm1，编码它的cDNA序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
优选地，所述的TNFαm1基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
优选地，所述的杀伤多肽是TNFα的突变体TNFαm2，编码它的cDNA序列为SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
优选地，所述的杀伤多肽是TNFαm2，它的氨基酸序列为SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列。
本发明进一步涉及包括SEQ ID NO：1的cDNA和SEQ ID NO：3的cDNA的融合基因的重组体pCW-CD4V1TNFαm1。
本发明进一步涉及包括SEQ ID NO：1的cDNA和SEQ ID NO：5的cDNA的融合基因的重组体pCW-CD4V1TNFαm2。
本发明还涉及含有上述重组体的载体。
本发明还涉及含有能表达上述融合蛋白的构建质粒载体的真核或原核细胞，优选为真核细胞。
本发明还涉及制备上述的融合蛋白的方法，包括：用所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的包含能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽和具有杀细胞作用的杀伤多肽的靶向性融合蛋白。
本发明还涉及一种含有上述融合蛋白的药物组合物。
本发明进一步涉及所述的融合蛋白在制备用于治疗获得性免疫缺陷综合征的药物中的用途。
优选地，其通过杀灭受HIV/SIV感染的细胞或中和游离的HIV/SIV来完成。
本发明还提供了靶向融合蛋白CD4V1-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2分别对受HIV/SIV感染细胞具有特异杀伤作用以及对血循环中游离病毒的中和作用的细胞试验证据。
本发明由于靶向设计，可以既有效降低TNFα的毒性，又可以将TNFα的杀伤作用集中于受HIV/SIV感染的细胞，更有效发挥融合蛋白的杀伤作用，同时兼顾高效和安全。融和蛋白在杀伤受HIV/SIV感染的细胞的同时，其靶向分子CD4V1还能中和游离的HIV/SIV，实现对正常细胞的保护。因此这两种融和蛋白都是双功能的活性多肽。并且，实验设计得到细胞试验结果的支持。同时，由于CD4V1和TNFαm均来自人体，最大限度降低了免疫原性。不仅如此，在CD4V1和TNFαm之间还引入了富含柔性氨基酸的一个七氨基酸序列，可以帮助CD4V1和TNFαm各自以独立的的三维空间结构来行使其功能，并各自作为人体内源蛋白被免疫系统识别而不被免疫系统识别为异源蛋白产生免疫反应，最终导致药物失效。
附图说明
图1为重组体pCW CD4V1-TNFαm1的构建示意图。
图2为重组体pCWCD4V1-TNFαm2的构建示意图。
图3为重组体pBS-TNFαm1，pGEM-CD4V1-TNFαm1以及pCWCD4V1-TNFαm1的酶切鉴定示意图。
图4为融和蛋白CD4V1-TNFαm1 SDS-PAGE电泳图。其中
1：为未诱导的CD4V1-TNFαm1/DH5α菌体蛋白
2：为诱导的CD4V1-TNFαm1/DH5α菌体蛋白
3：为CD4V1-TNFαm1/DH5α菌体蛋白的包涵体
4：为切胶电洗脱后的CD4V1-TNFαm1蛋白样品
图5为融和蛋白CD4V1-TNFαm1 SDS-PAGE胶的激光密度扫描图。
图6为重组体pBS-TNFαm1的测序结果。
图7为重组体pCW-CD4V1TNFαm1的上游测序结果。
图8为重组体pCW-CD4V1TNFαm1的下游测序结果。
图9为重组体pBS-TNFαm2的测序结果。
图10为融合蛋白CD4V1-TNFαm1对被SIV感染CEMx-174细胞的杀伤作用。
图11为融合蛋白CD4V1-TNFαm1对正常CEMx-174细胞的作用。
图12为融合蛋白CD4V1-TNFαm1对被SIV感染CEMx-174细胞的中和作用。
图13为TNFα标准品对被SIV感染CEMx-174细胞的作用(纵坐标为测量的OD值)。
图14为融合蛋白CD4V1-TNFαm1在杀伤试验中对病毒滴度的影响。
图15为融合蛋白CD4V1-TNFαm1在中和试验中对病毒滴度的影响。
图16-1，2显示杀伤试验前后细胞的形态的荧光照片，其中图16-1为融合蛋白CD4V1-TNFαm1杀伤试验前细胞染色照片；图16-2为融合蛋白杀伤试验后细胞染色照片，放大倍数均为200X。
图17-1，2显示中和试验前后细胞的形态的荧光照片，其中图17-1为融合蛋白CD4V1-TNFαm1中和试验前细胞染色照片；图17-2为融合蛋白中和试验后细胞染色照片，放大倍数均为200X。
具体实施方案
本发明中融合蛋白是由靶向分子和杀伤分子两部分组成，这种靶向设计的关键是实现靶向分子的特异性结合和杀伤分子对目标细胞的高效杀伤。其中靶向分子是能与HIV或被HIV感染的细胞上的gp120特异结合的CD4或其衍生物，其一为CD4V1；杀伤分子是肿瘤坏死因子α(TNFα)或其衍生物，其中两种为TNFαm1和TNFαm2。CD4是作为gp120识别靶细胞的通用锚定物。因为只有游离的HIV病毒以及被HIV感染的细胞才会特异性地表达病毒的包膜蛋白gp120，因而运用CD4或其衍生物作为靶向分子可实现与被HIV感染细胞的特异性结合。CD4-TNFα编码基因及其突变型可经真核或原核系统表达获得融和蛋白。
TNFα是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生。此外，中性粒细胞、星状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞，也可产TNFα。TNFα发现于1975年，是一种人源性的细胞毒性因子，其毒性作用主要是通过与受体结合与内化，进而引发一系列的信号传递过程，导致细胞死亡。TNFα引起两种主要的细胞反应，细胞毒和选择性的转录激活。在NK和巨噬细胞介导的细胞毒中TNFα的作用是Ca²⁺非依赖性的。TNFα三聚体同受体(主要是P55)结合，聚集成簇，受体复合物内化，内化的TNFα受体复合物可传递多种信号。一个可能的机制是通过G蛋白偶联的活化作用激活磷脂酶A2通路，合成前列腺素和白三烯。同时，花生四烯酸等多不饱和脂肪酸的释放和代谢在线粒体的电子传递系统被扰乱，开始产生自由基，最终通过某些酶、脂的氧化和DNA降解作用杀死细胞。另一方面信息会很快导致转录因子NF KappaB的激活，活化的NF KappaB进入细胞核，激活一系列基因的转录。TNFα在已知细胞因子中的抗肿瘤活性最强。对包括神经纤维瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等在内的多种肿瘤细胞系都具有明显的杀伤作用，所以，美国政府早在1985年就批准了用TNFα来治疗恶性肿瘤的临床试验申请。但由于原型TNFα过强的毒副作用，以致迄今未能成为临床可用的治疗恶性肿瘤的常规药物。我们的一个关键的设计思想是认为，TNFα的杀细胞活性是它的基本功能，从其作用机制看，如能将其准确导入受HIV/SIV感染的细胞，同样可以把被HIV/SIV感染的细胞杀灭，从而阻止HIV/SIV病毒的复制和繁殖。因此，运用DNA重组技术将之构建成表达融和蛋白CD4V1-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2的表达重组体，经真核或原核表达系统表达出融和蛋白，然后纯化复性。细胞试验结果表明，两种融和蛋白可特异强烈杀灭被HIV/SIV感染的细胞，与此同时，该融和蛋白的靶向分子CD4V1还能高效中和游离的HIV/SIV，而使其失活。因此这两种融和蛋白都是双功能的活性多肽。并且，未被HIV/SIV感染的正常细胞在加入这两种融和蛋白以后，其生长不受影响，证明融和蛋白有良好的安全性。作为对照，原型TNFα既不能杀伤受HIV/SIV感染的细胞，也不能中和游离的HIV/SIV病毒，进一步验证了我们的设计。同时，由于CD4V1和TNFαm均来自人体，最大限度降低了免疫原性。因此，本发明构建的两种融合蛋白用于抗HIV/SIV有着良好的特异性和安全性，是一种富有前景的治疗艾滋病的潜在药物。
另外，关于该融合蛋白是否有免疫原性，CD4V1与TNFα均为人源蛋白，原则上说，已经尽可能地减小了免疫原性。鉴于融合蛋白可能改变其空间三维结构从而导致严重的免疫原性。这个顾虑，就本融合蛋白而言，情况可能不同：本融合蛋白中的CD4V1与TNFαm将更可能分别以各自独立的三维结构存在于溶液/血液中。如CD4V1-TNFαm2，它们的连接肽从N端至C端为Leu-Gly-Thr-Arg-lys-Arg-Lys-Pro-Val，其中，Leu属于CD4V1的C末端最后一个氨基酸，同时是一个刚性氨基酸；其后的7个氨基酸都是柔性氨基酸；而该连接肽C端的最后3个氨基酸属于原TNFα的N端切除7个氨基酸后的N端，其第三个氨基酸Val是一个刚性氨基酸。这样，便构成了CD4V1与TNFαm2以两个刚性氨基酸为始末、以其间7个柔性氨基酸为活链各自形成独立结构的很大可能性。如果确系形成这样的二个独立的三维空间结构，它们将分别是人体内源蛋白，将不至于被免疫系统错误识别以致诱导免疫反应，致使药物失效。细胞活性试验结果表明，CD4V1与TNFαm2均良好地发挥了各自的功能。这一结果也从一个侧面提示，CD4V1与TNFαm2各自保持了原有的三维结构的很大可能性。并且，连接肽中的N端的Gly-Thr是由于加入了kpnI酶切位点引入的，其后3个氨基酸是人为引进的，计5氨基酸，不超过6氨基酸，按普遍接受的观点，应无免疫原性。总的看来，该融合蛋白不至于会有强烈的免疫原性而在临应用中失效。而且E.coli系统研制的多数活性多肽药物均有一定的免疫原性，但并不影响其临床应用。本发明选取人工合成的密码子为E.coli.嗜好的编码CD4的胞外可变区V1区100个氨基酸的基因序列作为靶向分子，与利用PCR技术得到的强效肿瘤坏死因子α(TNFα)的衍生物TNFαm1和TNFαm2的基因片段重组，构建表达重组体pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm1和pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm2。
将以下描述的表达型重组体pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm1和pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm2分别转化大肠杆菌DH5α经筛选获高表达工程菌pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm1/DH5α和pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm2/DH5，行SDS-PAGE胶分析，重组融和蛋白pCW-CD4V1TNFαm1/DH5α和pCW-CD4V1TNFαm2/DH5分别约占菌体总蛋白的12％和13.7％。对pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm1/DH5α高表达株进行大规模培养诱导，提取包涵体，8M尿素溶解，经SDS-PAGE凝胶切割后电洗脱回收蛋白。经冰冻酸性丙酮除去SDS，经过透析、复性。
蛋白定量后，将融合蛋白CD4V1TNFαm1分别以8，16，32，64，128μg/ml的浓度处理被SIV感染的CMEx-174细胞。以正常的CMEx-174细胞及空白样品作为阴性对照。观察融合蛋白对细胞的杀伤作用。结果表明：该融合蛋白能有效地杀伤被SIV感染的CMEx-174，在128μg/ml时CD4-TNFαm的杀伤率可达到54.9％。并且，在杀伤实验中单独用TNFα蛋白作用被SIV感染的CEMx-174细胞，发现细胞的生长情况和未加TNFα蛋白的被SIV感染的CEMx-174细胞的生长情况无显著差异(P＞0.20)。说明本实验研究的融合蛋白的杀伤作用是通过靶向性分子的介导，单独的TNFα蛋白由于没有靶向性分子的介导，因而无法杀伤感染SIV的CEMx-174细胞，初步验证了作用机理。同时，将CD4TNFαm融合蛋白分别以4，8，16，32μg/ml的浓度进行中和实验，32μg/ml剂量的融合蛋白对游离病毒的保护率可达33.5％，说明融和蛋白对未感染细胞有保护作用。杀伤率与中和率均与融合蛋白呈剂量依赖关系，并有滴度试验支持以上结果。同时通过对照实验该融合蛋白对正常细胞的生长无明显影响。
细胞试验表明，本发明中的融合蛋白CD4-TNFαm，用于抗HIV/SIV，有着良好的特异性和安全性，是一种富有前景的治疗艾滋病的潜在药物。
本发明提供了包含所述融合蛋白基因以及含该基因的表达型重组体。
优选地，所述融合蛋白中的受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CD4，CD4V1V2或CD4V1，或者它们的相关片断，类似物或突变体。
优选地，由于V1区100个氨基酸对于CD4结合gp120分子是足够的，截取了CD4全长中的V1区100个氨基酸作为受体多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
更优选地，为了实现融合蛋白在E.coli.系统中的高效表达，CD4V1基因片段系人工合成的突变的E.coli.嗜好的DNA序列，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述的功能多肽是TNF家族成员，如TNFα，TNFβ(又名淋巴毒素，lymphotoxin，LT)，TNFγ，或其衍生物或其突变体，或TNF超家族成员，如Trail(Tumor related Apoptosis inducedligand)，Light(for homologous tolymphotoxins，exhibitsInducible expression，and competes with HSVGlycoprotein D forHVEM，a receptor expressed byT lymphocytes，Light；，又称为HEVMLherpesvirus entry mediator ligand)以及是它们的活性功能区域、突变体或类似物。或者是具有裂解细胞作用来源于人体的穿孔素(human perforin，HP；pore forming protein，PFP)，可形成补体攻击复合物的补体成分C9，颗粒溶解素(granulysin)；或者可引起凋亡的来源于人体的颗粒酶家族的颗粒酶A，B，C，D，E(GranzymeA，B，C，D，E)，丝氨酸酯酶(serine esterases)；直接参与细胞凋亡的的蛋白激酶C(PKC)，蛋白激酶A(APK)，天冬氨酸激酶(caspases)，细胞色素，DNA核酸内切酶；可以抵御细菌的多肽和酶，如溶菌酶(Lysosome)，防御素(defensin)；具有抑制肿瘤作用的P53以及是它们的活性功能区域、突变体或类似物。
更优选地，其中所述功能多肽是TNFα的突变体TNFαm1和TNFαm2。本发明依据相关文献的报导，采用两种方式改造TNFα的结构，其一是在TNFαN端第一位氨基酸Val前增加两个氨基酸Gly，Thr在其后增加三个氨基酸Arg，Gly，Pro成为采用TNFαm1；其二是将原型TNFα的N端前7个氨基酸缺失突变，并将Pro8，Ser9，Asp10突变为Arg8，Lys9，Arg10，获得减毒增效的TNFαm2，以降低其毒副作用使之可以更适用于临床，同时提高其抗肿瘤活性。
本发明提供了两种编码抗肿瘤新药靶向融合蛋白CD4V1-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2的基因CD4V1-TNFαm1，CD4V1-TNFαm2，分别具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了包含所述基因CD4V1-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2的表达型重组体pCWCD4V1-TNFαm1和pCWCD4V1-TNFαm2以及工程菌pCWCD4V1-TNFαm1/DH5α和pCWCD4V1-TNFαm2/DH5α以及大量制备、纯化和复性蛋白的技术路线。
以下通过实施例进一步描述本发明，而非限制本发明。
实施例1.编码重组靶向融合蛋白的基因CD4V1TNFαm1的获得
1.PCR引物及其序列
1.1博亚公司合成TNFαm1引物：
Forward primer 5’-aaagtaagaggtccaagat-3’25bp含KpnI位点
Reverse primer 5’-aaattatcacagggcaatg-3’25bp含BamHI位点
1.2博亚公司合成pCW111的测序引物：
Forward primer 5’-AAAAAGGGCATCAAATTAAACC-3’
Reverse primer 5’-TCGGCGATATAGGCGCCAGC-3’
PCR反应条件为：94℃变性3分钟后开始循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒。经25个循环后，72℃延伸10分钟。使用的扩增酶高保真Pfu。以1.0％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到514bp左右的DNA片段。
2.突变型TNFαm1的获得
利用TNFαm1 PCR引物对对本实验室构建的TNFαcDNA进行特异扩增，其结果是在TNFαcDNA的5’端引入1个KpnI位点(GGTACC)和几个额外的编码氨基酸的密码子GGT ACC GTAAGA GGTCCA(其中带下划线的为较原型比多出来的密码子)，这段DNA序列对应的氨基酸序列为Gly Thr ValArg Gly Pro(带下划线的为较原型比多出来的氨基酸)。同时，还在其3’端引入1个BamHI位点(GGA TCC)和2个终止密码子(UAA UGA)。将pfu酶扩增得到的平端PCR产物回收后，与经过EcoRV酶切处理的PBSSK平端连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与目的基因相符。因插入方向不同，得到两种产物，通过BamHI单酶切，舍去无法切出约500bp的片段反向插入产物，获测序重组体pBS-TNFαm1。pBS-TNFαm1酶切鉴定结果见图3，测序结果见图6。
3.融合基因CD4V1TNFαm1的获得
用ApaI、KpnI双酶切处理定向的pBS-TNFαm1正向连接产物，回收534bp的片段。从博亚公司合成的pGEM-CD4质粒含大肠杆菌嗜好的CD4V1基因序列，将用ApaI、KpnI双酶切(购自大连宝生物生物公司)处理pGEM-CD4后回收的大片段，与用pBS-TNFαm1ApaI、KpnI双酶切处理后回收的小片段连接，获得重组体pGEM-CD4V1TNFαm1。重组体pGEM-CD4V1TNFαm1酶切鉴定结果见图3。
实施例2.融合基因CD4V1-TNFαm1温控型表达型重组体pCW-CD4V1TNFαm1的构建
用BamHI，NdeI双酶切处理分别处理及pCW111载体，回收pGEM-CD4TNFαm1酶切产物中的CD4 TNF 797bp片段及pCW111的大片段并连接，得到重组体pCW-CD4V1TNFαm1，从而将CD4V1TNFαm1融合蛋白的编码基因置于温控启动子P_RP_L的控制之下。重组体pCW-CD4V1TNFαm1酶切鉴定结果见图3，测序结果见图7，8。
实施例3.编码TNFα突变体TNFαm2基因的获得
3.1博亚公司合成TNFαm2引物：
Forward primer 5’-aaacgtaaacgcaagcct-3’含PstI和XhoI
                  位点
Reverse primer 5’-aaattatcacagggcaatg-3’25bp含BamHI酶
                  切位点
3.2突变型TNFαm2的获得
利用TNFαm2PCR引物对对质粒pCW-CD4V1TNFαm1进行特异扩增，其结果是获得将原型TNFα的N端前7个氨基酸缺失突变，并将Pro8，Ser9，Asp10突变为arg8，Lys9，Arg10，获得的减毒强效突变的TNFαm2。同时，还在其3’端引入1个BamHI位点(GGA TCC)和2个终止密码子(UAA UGA)。将pfu酶扩增得到的PCR产物经BamHI和XhoI双酶切，玻璃奶回收酶切产物后，与经过BamHI和XhoI双酶切处理的PBSSK粘端连接，获得重组质粒pBS-TNFαm2，酶切鉴定结果见图3，测序结果见图9。
实施例4.融合基因CD4V1TNFαm2温控型表达型重组体pCW-CD4V1TNFαm2的构建
将质粒pBS-TNFαm2经KpnI和BamHI双酶切后，玻璃奶回收约500bp酶切产物，并与pCW-CD4V1TNFαm2经KpnI和BamHI双酶切处理后回收的5187bp酶切产物粘端连接，获得温控型表达型重组体pCW-CD4V1TNFαm2。
实施例5.融合蛋白CD4V1TNFαm1在大肠杆菌中的表达
1.目的蛋白的表达与鉴定
将pCW-CD4V1TNFαm1转化DH5α，然后接种于5ml LB培养基，同时加入终浓度为100mg/ml的氨苄青霉素，32℃振摇培养过夜。按2％接种量重新接种两管5ml LB/Amp+培养液。在32℃下振摇培养至OD600约为0.6时。然后分出一管置于42℃摇床，振摇培养诱导5h；另一管继续在32℃振荡培养5h，作为对照。4000g离心收集菌体，加入上样缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，100mmol/L DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，混匀，置于100℃沸水浴保持5min。10000g离心1min，取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。目的蛋白质表达量通过Chromscan3快速凝胶扫描仪于626nm波长处扫描，并计算表达量。详细方法参见参见卢圣栋主编的《现代分子生物学实验技术》第二版，365-387页。
2.结果：
经SDS-PAGE分析显示，pCW-CD4V1TNFαm1/DH5α表达的目的蛋白在约30KD处有明显的蛋白带出现，而未诱导样品在相应位置上没有该条带，蛋白大小与预期一致，初步断定为目的蛋白，见图4。经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白占细胞总蛋白的12.0％，见图5。
实施例6融合蛋白CD4V1TNFαm1的大量制备与纯化
1.大体积培养：
工程菌pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm1/DH5α接种于50ml LB培养基，同时加入终浓度为100mg/ml的氨苄青霉素，32℃振摇培养过夜。按2％接种量重新接种于两瓶分别含有500ml LB/Amp+培养液的2L三角瓶中。在32℃下振摇培养至OD600约为0.6时。然后置于42℃继续振摇培养诱导5h。4000g离心、收集菌体，置于-20℃反复冻融。
2.包涵体的制备
2.1洗涤细胞：
6000g×15分钟离心收集细菌，称重湿菌体。
用3％Triton X-100洗涤菌体，搅拌器上搅匀30分钟，6000g×15分钟离心收集用量为10ml-50ml缓冲液/1g湿菌体(包括下列各种洗涤缓冲液)。
2.2破细胞
用缓冲液将细胞悬浮，缓冲液配制：50mmol/LTris.Cl(pH8.5-9.0)，2mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％Triton X-100，溶菌酶1mg/ml)。用搅拌器在室温下搅拌，使得悬浮液因溶菌酶的作用而粘稠。
2.3超声处理
每次超打10秒，间隔15秒，20-50次作用(视菌体浓度而定)，至菌体不再粘稠为止。然后离心收集，6000g×15分钟。上述操作应在冰水中进行，为防止炭化，超声功率不宜过大，在玻璃烧杯中进行较好，超声波探头深入液面大于3厘米，距杯底2厘米位好。
2.4 5％Triton X-100洗涤
用缓冲液彻底悬浮沉淀，搅拌并超声波处理30次，参见上述步骤2.3。缓冲液为：50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，2mmol/L EDTA，5％Triton X-100。离心收集沉淀，6000g×15分钟。
2.5包涵体的保存与溶解：
2.5.1用少量8M尿素逐渐溶解包涵体，取20μl溶液加入2×上样缓冲液，混匀，沸水中煮3-5分钟。取20ul进行SDS-PAGE电泳分析。其余包涵体可冻存于-70℃。
2.5.2如果过柱纯化，应按下述步骤操作：用含体溶解液(50mmol/LTris.Cl，pH8.0，2mmol/L EDTA，10mMDTT，7M盐酸胍)溶解包涵体，包涵体浓度约为10mg/ml。将溶解的包涵体12000g离心后，取上清，得到可以上柱的样品溶液。
3.目的蛋白的纯化
取2.3步骤中所制备的包涵体溶液，加入等体积2×上样缓冲液中，进行15％的SDS-PAGE电泳。
3.1.凝胶切割：切下蛋白Marker泳道所在的胶条和少部分样品胶条，将其放入快速染色液中速染15分钟，剩余凝胶用保鲜膜包好置于4℃冰箱。速染的胶条脱色显出条带后，将胶条与剩余的凝胶对比，切下含目的带部分的凝胶条。
3.2.电洗脱：将切下的凝胶条及凝胶浸泡液装入透析袋中并置于水平电泳槽中，加入蛋白电泳洗脱进行恒压100v电泳。电泳10～12h后将洗脱液还位透析液再电泳10～12h。将透析袋中的浸泡液倒入50ml离心管中，如溶液较多可先用适量PEG10000浓缩。
3.3.痕量SDS的去除：在离心管中加入5倍体积以上的冰冻酸性丙酮-甲醇蛋白沉淀液，20℃沉淀过夜。10,000r/m离心10分钟，去掉上清收集沉淀。将收集的沉淀用蛋白沉淀液洗涤1次。
实施例7.融合蛋白的复性
将洗涤后的蛋白沉淀用变性缓冲液(6mol/L盐酸胍，0.1mol/L tris-HCl，PH8.6，1mmol/L EDTA，0.05mmol/L NaCl，10mmol/L DDT)在冰浴中溶解后转入透析袋内，同时在透析袋内加入蛋白复性液(50mmol/LTris-HCl，PH8.0，1mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl，0.25mol/L左旋精氨酸，5mmol/L DDT)中，于蒸馏水中4℃透析48小时以使蛋白复性。
实施例8重组靶向融合蛋白CD4V1-TNFαm1对SIV感染的CEMX-174的杀伤作用
8.1模式细胞的制备：
由于HIV不感染其它动物的CD4阳性细胞，因而迄今尚无一种人的艾滋病动物模型。猩猩感染HIV-1后仅仅表现为暂时性的T细胞数量的改变以及产生抗体，并不发展成艾滋病临床症状。研究发现HIV-2和SIVMAC9亚洲短尾猴种分离的免疫缺陷病毒的核苷酸序列有大约75％甚至更高的同源性，与HIV-1仅有45％的同源性。但由于SIV和HIV-1在感染、复制、和调控方面基本相似，可通过研究SIV引起的灵长类动物艾滋病作为研究人类艾滋病的基础。因此本实验采用SIV进行初步的体外实验来反应靶向融和蛋白地抗HIV/SIV作用。
本试验所使用的模式细胞为CEMX-174细胞株(中国医学科学院试验动物研究所病毒室)。具体地，首先将液氮保存的CEMX-174细胞复苏，转接于含10％胎牛血清(天津三得利公司)的1640培养基(Gibco-BRL公司，洛克维尔，马里兰州，美国)的100ml的培养瓶中，37℃、5％CO₂的培养箱中培养，48小时后换液，随后在培养液中加入病毒滴度大于5120的SIV，来感染CEMX-174细胞。由于该细胞易于被感染且效率高，所以每隔6-8小时在显微镜下观察细胞被感染情况，包括被感染细胞的百分率以及细胞的形态改变等。经过4-5天的培养和反复感染，用免疫荧光检测感染效率，平均感染率约47％。
8.2实验方法与结果
8.2.1MTT法测定细胞活性
以往细胞试验都是通过细胞计数来估计细胞活性的，这样因其主观因素和自身许多缺陷使得结果可信度不高。本发明采用MTT法测定细胞活性。MTT的商品名为噻唑蓝，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源的MTT还原成难溶性的蓝紫色结晶，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其OD值，可间接反映活性细胞的数量。在一定范围内，MTT结晶物形成量与细胞数量成正比。所以本发明采用MTT测定细胞活性，提高结果的客观性、可信度。
8.2.2实验结果及说明
本试验采用5个剂量组，使药物终浓度分别为8、16、32、64、128μg/ml。于24孔细胞培养板中分别处理1.25×10⁵/ml被SIV感染的CEMx-174细胞及未被病毒感染的正常细胞。为了验证融合蛋白的作用是通过靶向性分子介导的，而不是由TNFα单独起作用的，还设计了用TNFα单独作用于SIV感染了的细胞。用正常培养的CEMx-174细胞作为正常组，以未加细胞的1640培养基为调零组，以蛋白处理过的感染SIV的CEMx-174细胞为试验组，以未加蛋白的感染SIV的CEMx-174细胞为对照组。48小时后通过荧光计数得出试验组和对照组的荧光百分比，同时用MTT法测定细胞活性，算出融合蛋白的杀伤率。所得各孔存活细胞数进行方差分析(analysis of variance)和T检验(T-test)分析，结果见表1、2、3。统计学分析结果表明P＜0.05，说明感染SIV的CEMx-174细胞加入CD4V1TNFαm1后，出现了明显的杀伤作用，而且杀伤作用基本上是随着剂量的增大而增强的。其中最大剂量组128μg/ml，CD4V1TNFαm1的杀伤率是54.9％。以上结果说明该融合蛋白可杀伤被SIV感染的细胞，见图10。融合蛋白CD4V1-TNFαm1在8、16、32、64、128μg/ml剂量下对未感染SIV的CEMx-174细胞作用后，观察细胞的生长状况，用OD值反应细胞的存活情况，发现细胞的生长情况和正常细胞的生长情况无显著差异，P＞0.20。这些结果说明，融合蛋白CD4V1-TNFαm1对正常的未感染SIV的CEMx-174细胞并无毒性杀伤作用，融合蛋白的安全性得以保障，符合实验设计要求，见图11。同时，TNFα蛋白单独作用于感染了SIV的CEMx-174细胞后，用OD值反应细胞的存活情况。OD值1.072为对照组的。通过T检验发现试验组与对照组数据无显著差异。见图13。杀伤率＝1-【(对照组OD值-调零组OD值)×对照组感染率】÷【(试验组OD值-调零组OD值)×试验组感染率】
表1.杀伤试验结果
分组        剂量     MTT法测得的     荧光计数    滴度       杀伤
            ug/ml    OD值            百分比                 ％
NC          /        1.072±0.013    0％         0          /
NC/SIV      /        0.560±0.005    75.3％      1∶1280    /
培养基      /        0.061±0.006    0％         /          /
NC/SIV+     8        0.498±0.006    72.1％      1∶320     17.3％
CD4V1       16       0.442±0.012    66.2％      未测       32.9％
TNFαm1     32       0.421±0.015    64.0％      1∶80      38.7％
            64       0.397±0.007    61.2％      1∶40      45.4％
            128      0.363±0.004    56.1％      1∶10      54.9％
说明：1每组剂量有3个平行孔，每个孔用MTT法测定3次
2 NC代表正常的CEMx-174细胞，NC/SIV代表感染了SIV的CEMx-174细胞，荧光计数百分比即为感染率
3试验组测定的OD值与对照组(NC/SIV)相比较，均有显著性差异P＜0.05
4数值的计算方法见正文说明
表2.两种融合蛋白作用于未感染SIV的CEMx-174细胞后，对细胞生长的影响
分组            剂量         MTT法测得的             统计学检查
                (ug/ml)      OD值                 F检验        T检验
NC              /            1.072±0.011         /            /
                8            1.088±0.022         2.905        1.145
NC+             16           1.055±0.044         4.140        0.655
CD4V1-TNFαm    32           1.093±0.035         6.578        -0.967
1               64           1.075±0.017         0.608        -0.227
                128          1.078±0.069         6.586        -0.145
说明：融合蛋白CD4V1-TNFαm1在8、16、32、64、128μg/ml剂量下对未感染SIV的CEMx-174细胞作用后，观察细胞的生长状况，发现细胞的生长情况和正常细胞的生长情况无显著差异，P＞0.20。这些结果说明，融合蛋白CD4V1-TNFαm1对正常的未感染SIV的CEMx-174细胞并无毒性杀伤作用，融合蛋白的安全性得以保障，符合实验设计要求。
表3.TNFα蛋白单独作用于SIV感染了的CEMx-174细胞后，对细胞生长的影响
分组           剂量         MTT法测得的             统计学检查
               (ug/ml)      OD值                 F检验       T检验
NC/SIV         /            0.370±0.011         /           /
               8            0.359±0.096         0.051       1.337
NC/SIV+        16           0.359±0.096         0.132       -1.335
TNFα                      32           0.370±0.022         1.730       -0.024
               64           0.379±0.046         3.213       -1.352
               128          0.366±0.011         0.029       0.464
说明：单独用TNFα蛋白在8、16、32、64、128μg/ml剂量下对感染SIV的CEMx-174细胞后，观察细胞的生长状况，发现细胞的生长情况和未加TNFα蛋白的感染了SIV的CEMx-174细胞的生长情况无显著差异，P＞0.20。这种结果说明了本实验研究的两种融合蛋白对感染SIV的CEMx-174细胞的杀伤作用是通过靶向性分子的介导，TNFα被内吞入感染的细胞后启动其杀伤作用的。单独的TNFα蛋白由于没有靶向性分子的介导，因而无法杀伤感染SIV的CEMx-174细胞，符合实验设计要求。
实施例9重组靶向融合蛋白CD4V1TNFαm1对SIV感染的CEMX-174的保护作用
9.1模式细胞的制备同8.1
9.2实验方法与结果
9.2.1MTT法测定细胞活性同8.2.1
9.2.2实验结果及说明
用正常培养的CEMx-174细胞作为正常组，以未加细胞的1640培养基为调零组，以蛋白处理过的CEMx-174细胞和SIV病毒颗粒混合物为试验组，以未加蛋白的CEMx-174细胞和SIV病毒颗粒混合物为对照组，分4个剂量组，分别用4、8、16、32μg/ml的融合蛋白作用。(实验结果见表4)将“正常CEMx-174细胞+SIV+融合蛋白”各组与“正常CEMx-174细胞+SIV”组6天后对剩余细胞用MTT法测定其活性，进行统计学分析，结果表明P＜0.05，说明正常CEMx-174细胞混合SIV后加入CD4V1TNFαm1，出现了明显的中和作用，抑制了游离病毒颗粒对细胞的感染，而且中和作用基本上是随着剂量的增大而增强的。其中最大剂量组32μg/ml的CD4V1TNFαm1的保护率是33.5％。由于中和试验其实的效果既有中和作用又有杀伤作用，很难定义一个纯粹的中和率，所以以保护率来反应融合蛋白的中和效应。以上结果说明该融合蛋白可中和游离的SIV，抑制SIV对CEMx-174细胞感染，可有效保护正常的CEMx-174细胞。见图12。
保护率＝【(试验组OD值-调零组OD值)-(对照组OD值-调零组OD值)】÷(试验组OD值-调零组OD值)
表4.中和试验结果
分组            剂量          MTT法测得的OD       滴度        保护％
                (ug/ml)       值
NC              /             2.816±0.014        /           /
NC+SIV          /             1.146±0.005        1∶1280     /
1640培养基      /             0.071±0.004        /           /
                4             1.302±0.002        1∶1280     12.7％
NC+SIV+         8             1.346±0.003        1∶320      15.7％
CD4V1TNFαm     16            1.435±0.005        1∶80       21.2％
                32            1.688±0.006        1∶40       33.5％
说明：1每组剂量有3个平行孔，每个孔用MTT法测定3次
2NC代表正常的CEMx-174细胞，NC+SIV代表混合有SIV颗粒的正常的CEMx-174细胞
3试验组测定的OD值与对照组(NC+SIV)相比较，均有显著性差异P＜0.05
4数值的计算方法见正文说明
实施例10杀伤试验及中和试验的病毒滴度试验
将融合蛋白杀伤处理后培养48h的细胞培养液混匀，(中和试验要处理7天)，按照10、20、40、80、160、320、640、1280倍以培养基进行稀释。分别取各稀释液100μl于新的无菌96孔板中，加等量的1.0×10⁵/ml CEMx-174细胞，置37℃CO₂培养箱(95％空气，5％CO₂)中孵育，每48小时更换一半新鲜培养基。7天后观察结果，以细胞融合形成的多核大细胞为指标确定滴度。(结果见表1，4)细胞培养物上清中的病毒完全是由于受病毒感染的细胞在病毒繁殖后裂解而释放到上清中的。上清中的病毒数量可通过病毒滴度试验来确定。在一定的稀释度下，上清中的病毒被稀释到滴度实验的检测灵敏度范围以下，这样的稀释物加入正常细胞培养物中不导致合胞体的产生。我们采用2ⁿ梯度稀释上清以感染细胞的方法，经过一段时间的培养，以培养细胞中合胞体的产生与否为标准确定病毒感染细胞的情况，可以直接得出在何稀释度下病毒浓度低于滴度试验的检测灵敏度范围的结果。以此为根据可推断上清中原来含有的病毒的相对浓度，该指标可作为病毒学检验的客观指标。从滴度示意图(图14和图15)中可看出实验组与阳性对照组之间在病毒滴度试验结果上明显差异，并呈明显的剂量关系，从图中可以看出随着药物剂量的增加，杀伤组和中和组病毒滴度逐渐下降。
实施例11感染细胞的荧光计数及显微照相
将杀伤试验和中和试验中各培养孔的细胞充分混悬，取1ml细胞培养液，3000rpm离心3分钟，弃上清。再用1ml的PBS洗一次，弃上清，在逐渐加入PBS，混悬细胞，调整细胞浓度为2×10⁵/ml。取15μl混悬液滴加在载玻片上的环内，自然晾干，在丙酮中4℃固定20分钟，取出晾干，加入gp120的抗体(猴抗SIV抗体，来自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分钟。然后用pH7.2的PBS冲洗，并置于其中浸泡10分钟，其间不断振摇。取出片子后，再加入用万分之二的Evens兰配制的兔抗猴抗体(即二抗)，37℃水浴30分钟，用PBS冲洗，晾干后在荧光显微镜下观察、计数荧光细胞数并拍照。在荧光显微镜下观察被SIV/HIV感染的细胞在蓝色光的激发下发黄绿色荧光，可以看到细胞周边呈黄绿色，而未被感染的细胞则不呈黄色，呈暗红色。杀伤试验和保护试验结果中的荧光感染率见表1。杀伤试验前后的荧光照片见图16-1和图16-2。图16-1中可见被SIV/HIV感染的细胞，而图16-2中可见许多细胞碎片，为被融合蛋白杀伤的SIV/HIV感染的细胞。保护试验前后的荧光照片见图17-1和图17-2。图17-1中可见被SIV/HIV感染的细胞，而图16-2中多见未受SIV/HIV感染的正常细胞，说明细胞受到了融合蛋白的有效保护。
                        序列表
<110>中国医学科学院基础医学研究所
中国医学科学院输血研究所
中国医学科学院实验动物研究所
<120>一种用于治疗获得性免疫缺陷综合征的重组靶向融合蛋白
<130>
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>303
<212>DNA
<213>人
<400>1
atgaaaaaag tagttctggg taaaaagggt gacaccgttg aactgacttg caccgcttcc     60
cagaaaaagt ctatccagtt ccactggaaa aactccaacc agatcaaaat cctaggtaac    120
cagggttcct tcctgaccaa aggtccgtct aaactgaacg atcgtgctga ctcccgccgt    180
tctctatggg accagggtaa cttcccgctg attatcaaaa acctgaaaat cgaagattcc    240
gacacctaca tctgtgaagt tgaagaccag aaagaagaag ttcaactact ggttttcggt    300
ctg                                                                  303
<210>2
<211>101
<212>PRT
<213>人
<400>2
His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu
1               5                   10                  15
Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn
            20                  25                  30
Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys
        35                  40                  45
Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp
    50                  55                  60
Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp
65                  70                  75                  80
Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln
                85                  90                  95
Leu Leu Val Phe Gly
            100
<210>3  <211>486  <212>DNA  <213>人  <400>3
gtaagaggtc caagatcatc ttctaaaacc ccgagtgaca agcctgtagc ccatgttgta     60
gcaaaccctc aagctgaggg gcagctccag tggctgaacc gccgggccaa tgccctcctg    120
gccaatggcg tggagctgag agataaccag ctggtggtgc catcagaggg cctgtacctc    180
atctactccc aggtcctctt caagggccaa ggctgcccct ccacccatgt gctcctcacc    240
cacaccatca gccgcatcgc cgtctcctac cagaccaagg tcaacctcct ctctgccatc    300
aagagcccct gccagaggga gaccccagag ggggctgagg ccaagccctg gtatgagccc    360
atctatctgg gaggggtctt ccagctggag aagggtgacc gactcagcgc tgagatcaat    420
cggcccgact atctcgactt tgccgagtct gggcaggtct actttgggat cattgccctg    480
tgataa                                                               486
<210>4
<211>161
<212>PRT
<213>人
<400>4
Thr Val Arg Gly Pro Arg Ser Ser Ser Lys Thr Pro Ser Asp Lys Pro
1               5                   10                  15
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
            20                  25                  30
Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
        35                  40                  45
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
    50                  55                  60
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
65                  70                  75                  80
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
                85                  90                  95
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
            100                 105                 110
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
        115                 120                 125
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
    130                 135                 140
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
145                 150                 155                 160
Leu
<210>5
<211>456
<212>DNA
<213>人
<400>5
cgtaaacgca agcctgtagc ccatgttgta gcaaaccctc aagctgaggg gcagctccag     60
tggctgaacc gccgggccaa tgccctcctg gccaatggcg tggagctgag agataaccag    120
ctggtggtgc catcagaggg cctgtacctc atctactccc aggtcctctt caagggccaa    180
ggctgcccct ccacccatgt gctcctcacc cacaccatca gccgcatcgc cgtctcctac    240
cagaccaagg tcaacctcct ctctgccatc aagagcccct gccagaggga gaccccagag    300
ggggctgagg ccaagccctg gtatgagccc atctatctgg gaggggtctt ccagctggag    360
aagggtgacc gactcagcgc tgagatcaat cggcccgact atctcgactt tgccgagtct    420
gggcaggtct actttgggat cattgccctg tgataa                              456
<210>6
<211>151
<212>PRT
<213>人
<400>6
Thr Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala
1               5                   10                  15
Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala
            20                  25                  30
Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly
        35                  40                  45
Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro
    50                  55                  60
Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser
65                  70                  75                  80
Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln
                85                  90                  95
Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile
            100                 105                 110
Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala
        115                 120                 125
Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val
    130                 135                 140
Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145                 150
<210>7
<211>798
<212>DNA
<213>人
<400>7
catatgaaaa aagtagttct gggtaaaaag ggtgacaccg ttgaactgac ttgcaccgct     60
tcccagaaaa agtctatcca gttccactgg aaaaactcca accagatcaa aatcctaggt    120
aaccagggtt ccttcctgac caaaggtccg tctaaactga acgatcgtgc tgactcccgc    180
cgttctctat gggaccaggg taacttcccg ctgattatca asascctgaa aatcgaagat    240
tccgacacct acatctgtga agttgaagac cagaaagaag aagttcaact actggttttc    300
ggtctgggta ccgtaagagg tccaagatca tcttctaaaa ccccgagtga caagcctgta    360
gcccatgttg tagcaaaccc tcaagctgag gggcagctcc agtggctgaa ccgccgggcc    420
aatgccctcc tggccaatgg cgtggagctg agagataacc agctggtggt gccatcagag    480
ggcctgtacc tcatctactc ccaggtcctc ttcaagggcc aaggctgccc ctccacccat    540
gtgctcctca cccacaccat cagccgcatc gccgtctcct accagaccaa ggtcaacctc    600
ctctctgcca tcaagagccc ctgccagagg gagaccccag agggggctga ggccaagccc    660
tggtatgagc ccatctatct gggaggggtc ttccagctgg agaagggtga ccgactcagc    720
gctgagatca atcggcccga ctatctcgac tttgccgagt ctgggcaggt ctactttggg    780
atcattgccc tgtgataa                                                  798
<210>8
<211>264
<212>PRT
<213>人
<400>8
His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu
1               5                   10                  15
Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn
            20                  25                  30
Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys
        35                  40                  45
Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp
    50                  55                  60
Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp
65                  70                  75                  80
Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln
                85                  90                  95
Leu Leu Val Phe Gly Leu Gly Thr Val Arg Gly Pro Arg Ser Ser Ser
            100                 105                 110
Lys Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
        115                 120                 125
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu
    130                 135                 140
Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu
145                 150                 155                 160
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys
                165                 170                 175
Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val
            180                 185                 190
Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
        195                 200                 205
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro
    210                 215                 220
Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser
225                 230                 235                 240
Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln
                245                 250                 255
Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
            260
<210>9
<211>768
<212>DNA
<213>人
<400>9
catatgaaaa aagtagttct gggtaaaaag ggtgacaccg ttgaactgac ttgcaccgct     60
tcccagaaaa agtctatcca gttccactgg aaaaactcca accagatcaa aatcctaggt    120
aaccagggtt ccttcctgac caaaggtccg tctaaactga acgatcgtgc tgactcccgc    180
cgttctctat gggaccaggg taacttcccg ctgattatca aaaacctgaa aatcgaagat    240
tccgacacct acatctgtga agttgaagac cagaaagaag aagttcaact actggttttc    300
ggtctgggta cccgtaaacg caagcctgta gcccatgttg tagcaaaccc tcaagctgag    360
gggcagctcc agtggctgaa ccgccgggcc aatgccctcc tggccaatgg cgtggagctg    420
agagataacc agctggtggt gccatcagag ggcctgtacc tcatctactc ccaggtcctc    480
ttcaagggcc aaggctgccc ctccacccat gtgctcctca cccacaccat cagccgcatc    540
gccgtctcct accagaccaa ggtcaacctc ctctctgcca tcaagagccc ctgccagagg    600
gagaccccag agggggctga ggccaagccc tggtatgagc ccatctatct gggaggggtc    660
ttccagctgg agaagggtga ccgactcagc gctgagatca atcggcccga ctatctcgac    720
tttgccgagt ctgggcaggt ctactttggg atcattgccc tgtgataa                 768
<210>10
<211>254
<212>PRT
<213>人
<400>10
His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu
1               5                   10                  15
Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn
            20                  25                  30
Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys
        35                  40                  45
Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp
    50                  55                  60
Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp
65                  70                  75                  80
Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln
                85                  90                  95
Leu Leu Val Phe Gly Leu Gly Thr Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His
            100                 105                 110
Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
        115                 120                 125
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln
    130                 135                 140
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu
145                 150                 155                 160
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
                165                 170                 175
Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
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Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
        195                 200                 205
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu
    210                 215                 220
Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
225                 230                 235                 240
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
                245                 250