东方田鼠特异DNA序列及其用途 本发明公开了一种从东方田鼠分子遗传学标志序列和其抗日本血吸虫相关基因序列。属于基因工程、生物技术、分子遗传学标志领域。
东方田鼠是我国血吸虫病疫区唯一对日本血吸虫病具有抗性的啮齿类哺乳动物，国内从60年开始，对东方田鼠为什么能对抗日本血吸虫感染进行了一系列研究，当人工感染日本血吸虫尾蚴于东方田鼠后，尽管日本血吸虫虫体在感染后11天内能正常发育，但从第12天开始，虫体发育停滞，到第20～28天虫体在东方田鼠体内全部消亡。经解剖数以万计的东方田鼠，无一只发现日本血吸虫或虫卵。说明东方田鼠具有对抗日本血吸虫感染的特性。1999年国家科技部将东方田鼠抗日本血吸虫机理研究作为“九五”国家科技攻关项目予以立项支持，对其进行分子遗传学标志的建立和抗性基因克隆研究，从东方田鼠基因组内获得对抗日本血吸虫的这一特异性DNA片段。东方田鼠的分子遗传学背景是一片空白，经国际互联网查询，在几个国际知名的基因数据库中均无有关东方田鼠的DNA序列资料，更无任何有关东方田鼠分子遗传学标志序列和抗日本血吸虫相关基因序列，本发明的东方田鼠特异性DNA序列是世界首次克隆、测序获得，并被美国基因数据库Genbank中登录(登录号：AF277394)。
本发明的目的是将东方田鼠具有对抗日本血吸虫感染的遗传特性和分子遗传学标志，并从中获得这一基因DNA片段进行克隆、测序，再使用基因重组技术得到该抗血吸虫病的基因产品，应用于人类对日本血吸虫病感染的预防和治疗。
实现本发明目的的方法是采用DNA提取技术、基因体外扩增、分子杂交、基因重组技术、DNA序列分析技术、生物信息分析技术等；首先设计出小鼠H2基因外显子2引物，用该引物扩增东方田鼠基因组DNA，得到DNA片段并经测序后，再设计内引物进行体外扩增东方田鼠基因组DNA，将得到的DNA片段经测序后，获得了东方田鼠的特异性DNA片段的核苷酸序列。
以下是对本发明基因序列作进一步说明：
一种东方田鼠抗日本血吸虫特异DNA相关基因序列的获得，首先设计合成小鼠H2基因外显子2(包括外显子2及两测序列)的引物扩增东方田鼠基因组DNA。设计出小鼠H2基因外显子2引物，其序列是：
H2E2．1 5’-ATGTACCAAGTACCGTTTGCGT-3’
H2E2．2 5’-CTGCTTAGCCTCCCTGAGCTG-3’
扩增东方田鼠基因组DNA后将其产物(DNA片段)回收、测序，再合成内引物进行体外扩增。内引物序列是：MF上游引物：741MF2．1 5’-ACCACTGCGACCTGGTGGTTGTGT-3’ A741mf2．1 5’-CACTGCGACCTGGTGGTTGTGTTC-3’MF下游引物：741MF2．2 5’-TCCTTCTTACTCCGTGGGTGACC-3’ B741mf2．2 5’-TTCCTTCTTACTCCGTGGGTGAC-3’
将上游引物和下游引物交替配对(741MF2．1对741MF2．2；741MF2．1对B741MF2．2；A741MF2．1对741MF2．2；A741MF2．1对B741MF2．2)，组成4对引物或者4种引物混合使用，进行东方田鼠基因组DNA体外扩增，用于基因分型、物种鉴定、分子遗传学标志确定产品开发。由内引物扩增东方田鼠基因组DNA，得到一条特异性的区带。将特异的PCR产物克隆、序列测定，切除两端多余部分，其长度为618bp，在Genbank中进行同源性比较，没有发现高度同源序列。经证实用这些特异引物同时扩增人、昆明小鼠、Balb／小鼠、C57小鼠和东方田鼠基因组DNA，只有东方田鼠地样品能够扩增出这样一条特异性区带，其他样品均为阴性(无特异性区带)。以东方田鼠618bp特异片段作为探针，进行斑点杂交，只有在东方田鼠DNA样品中能得到阳性信号，而在所检测的几种其它物种样品中均无特异阳性信号。用MF上游引物和MF下游引物扩增东方田鼠基因组所获得特异性DNA片段其核苷酸序列是：
1 tccttcttactccgtgggtgaccgggtgactgggtgactgacccctgatattctcctgtc 60
61 cttgttctcttgctcctccttctcccttctctcagGGTTCTCCTTCTATTTATCCTCTCT 120 V L L L F I L S
121 TCCTGCCAGCCCCACCTATCCTTGCCCCTGCATCGTTATTGGCCAGTCATCTTTTTATTA 180 S C Q P H L S L P L H R Y W P V I F L L
181 GGACCATCAGGTGTTTTAGACAGACACAGTAACACAGCTTCAGAGTTAAACAAATACAGC 240 G P S G V L D R H S N T A S E L N K Y S
241 ATAAACAAAAGTTACACACCTGAAAATAATATTCCCCCAAATTCACTCTTTCCTTGCCTC 300 I N K S Y T P E N N I P P N S L F P C L
301 TTgtcatcctttctgctttggccaccagggcactagcagcagtcatcagattccagagcc 360 L
361 aagacacagaagaggcgaagacacgtaaaggaaattatagacactcttgccatttgcatt 420
421 gaaaatagcacaaccgccggatggtggtgtgcacacctttaattccagcactcgagaggc 480
481 agaggcaagcgggatctctgtgagttcgaggccagcctggtctacaagagctagttccag 540
541 gacaggctccaaagctacagagagaccctatatgtgcagcgggatggggaggaggaacac 600
601 aaccaccaggtcgcagtg 618
东方田鼠特异DNA序列由于其单个苷酸多态性(SNP)形成的等位基因，根据东方田鼠特异DNA序列的等位基因序列，可设计引物或通过其它方式进行东方田鼠基因分型、物种鉴定、分子遗传学标志确定产品开发。将扩增所得到的特异性东方田鼠基因组DNA序列及其等位基因进行基因分型、物种鉴定、分子遗传学标志确定。对东方田鼠特异DNA片段进行进一步分析得到编码的多肽产物，这种多肽编码产物的序列是：VLLLFILSSCQPHLSLPLHRYVVPVIFLLGPSGVLDRHSNTASELNKYSINKSYTPENNIPPNSLFPCLLSSFLLVVPPGH 利用多肽编码产物(部分或全部)可以进行抗日本血吸虫的系列产品开发。东方田鼠特异DNA序列及其等位基因编码的多肽产物序列，两头延伸，但包含了上述序列进行抗日本血吸虫病防治产品开发。
将东方田鼠特异DNA序列的等位基因(部分或全部)插入真核表达载体、原核表达载体和其它表达载体，生产抗日本血吸虫的蛋白质，用于抗日本血吸虫病的防治。将东方田鼠特异DNA序列及其等位基因序列两头延伸，但包含了上述序列，插入真核表达载体、原核表达载体或其它表达载体，生产抗日本血吸虫病的蛋白质基因药物。
本发明的用途在于利用MF上游引物和MF下游引物可以扩增东方田鼠基因组DNA，进行基因分型、物种鉴定、分子遗传学标志的确定。同时，利用东方田鼠特异DNA片段的核苷酸序列及其等位基因，设计引物或通过其它方式，进行东方田鼠基因分型、物种鉴定，分子遗传标志确定。根据东方田鼠特异DNA片段的核苷酸序列及其等位基因和以上序列编码的多肽产物，可以生产出抗日本血吸虫的相关蛋白质，进行抗日本血吸虫病的产品开发与研究。
附图说明：
图1为东方田鼠基因组DNA体外扩增结果显示图。
图2为东方田鼠620bp片段与其它几种基因组DNA的斑点杂交结果显示图。
实施例：如图1所示，经证实东方田鼠基因组DNA体外扩增结果M：100bpDNA ladder1-5为东方田鼠基因组DNA，而人、昆明小鼠、Bbalb／c小鼠、C57小鼠基因组DNA无扩增产物。如图2所示，经东方田鼠618bp片段与其它几种基因组DNA的斑点杂交后，A1～A6显示东方田鼠基因组DNA；B1～B3显示Balb／c小鼠基因组DNA，B4～B6显示C57小鼠基因组DNA，C1～C6显示昆明小鼠基因组DNA，D1～D6显示人基因组DNA。