猪单精子微卫星DNA标记分型方法 本发明属于动物微卫星DNA标记分型技术领域，具体涉及猪的单精子DNA标记分型技术领域。
鉴别单个精子中的基因型，对于性别鉴定和控制，遗传疾病的诊断，高精度遗传作图等方面均具有重要的应用价值。但由于技术难度大，除了人类中有少量报道外，家畜中的报道仅限于牛。Lewin等(1992，Genomics，13：44-48)研究了牛23号染色体上淋巴细胞抗原(BoLA)DRB3基因与促乳素(PRL)基因间的重组率，他们分析了一个双杂合子牛的300个精子，最大似然法的估计结果为0.04，二者的紧密连锁说明可选择到同时含抗病力强且产奶量高的等位基因个体；Lie等(1993，Anim.Biotech，5：33-45)分析了3个酪蛋白(CASAS1、CASB、CASK)基因之间的遗传图距并作了排序，他们分析了一个三杂合子牛的330个精子，发现CASAS1与CASB、CASAS1与CASK间的重组率均为0.0075。且研究的均为功能基因。
单配子中的微卫星DNA分型的报道3篇仅限于人类(Crouau-Roy等，1992，Mol.and Cell Bio.，3：239-242；Hubert等，1992，Am.J. Hum.Genet.，51：985-991；Furlong等，1993，Am.J.Hum.Genet.，52：1191-1199)，且都依赖于价值昂贵的流式细胞分离仪进行单精子的分离工作，均是基于同位素扩增，通过放射自显影辨别单精子单倍型，且需时长，不安全。猪中尚未建立单精子分型技术。
目前已发表的单精子分型技术用于微卫星研究的三篇报道仅限于人遗传作图(Crouau-Roy等，1992；Hubert等，1992；Furlong等，1993)，而且所采用地方法均为两轮PCR，并在第二轮中加入同位素扩增，放射自显影鉴别等位基因，该法需时长且不安全。
本发明的目的在于克服已有技术的不足，建立一种猪单精子微卫星DNA标记分型方法，以达到简便、快速、安全和经济有效的鉴别猪单精子基因型的效果。
本发明通过以下技术方案实现：
一种猪微卫星DNA标记分型方法，含有猪微卫星位点引物，其步骤包括PCR(聚合酶链式反应，下同)和等位基因检测，其特征在于，对每个位点设计一个半嵌套引物，所述的步骤包括收集猪精液，分离单精子，选择检测位点，引物及内嵌引物的设计，单精子裂解，PCR扩增，等位基因检测，所述的PCR为三轮，按照以下步骤操作：
1)采用琼脂糖电泳法分离猪的单个精子，在小离心管中直接裂解：
2)第一轮PCR使步骤1)所述的单精子DNA拷贝数大量增加，使其适合于对多个位点的检测和分型；
3)第二轮PCR对所涉及的特定目的位点进行扩增，获得大量目的微卫星DNA片段；
4)第三轮PCR采用所述的内嵌引物，对目的位点的基因型进行分型；
5)采用聚丙酰胺凝胶电泳和银染方法对步骤4)所述的基因型进行分析和鉴别。
本发明采取以下步骤分离单精子：
取洗涤后的精液2μl悬浮于1ml PBS中，再从中取2μl加入到20ml 0.7％低溶点琼脂糖溶液中，混匀后铺于玻片上，37℃烘烤1h后，在倒置显微镜下，将只含有单个精子的琼脂糖碎片挑起，放入0.2ml Ep管中备用。
本发明采取以下步骤对单精子进行裂解：
向每个含有单个精子的反应管中加入5μl单精子裂解液，覆盖矿物油后，65℃保温30min；再加入5μl单精子中和液，离心，混匀后，-20℃保存备用。
本发明采取以下步骤对单个精子进行PCR扩增：
1)所述的PEP反应体系为：500μl 10×不含K+的Buffer；含15个碱基的500μl 400mM随机引物，250μl 2mM 4种dNTP混合液，100μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，补H2O至4.0ml，将上述混合液用于100个反应之用；
2)向每个已裂解的单精子Ep管中加入40μl PEP反应液，混匀，覆盖矿物油后放入PCR仪中扩增，扩增条件为：95℃，5min→50×(37℃，2min→55℃，4min→92℃，1min)→72℃，5 min。其中从37℃→55℃的升温速度为10S/℃，扩增完毕后，4℃保存备用；
3)两轮PCR扩增步骤为：
第一轮PCR，其反应体系为：500μl 10×PCRBuffer，250μl 2mM dNTP，10μl 100μM正向引物，10μl 100μM反向引物，20μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，加H2O至4.5ml，将上述混合液以每管45μl分装至100个0.2ml Ep管中，然后加5μl单精子PEP产物，覆盖矿物油，放入PCR仪中扩增，扩增条件为：96℃，5min→10×(94℃，1min→60℃，4min)→15×(94℃，1min→60℃，3min)→72℃，5min→扩增产物4℃保存备用；
第二轮PCR：其反应体系：500μl 10×PCR Buffer，250μl 2mM 4种dNTP的混合液，45μl 100μM正向或反向引物，45μl 100μM内嵌引物，20μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加水至4.8ml将上述混合液以每管48μl分装至100个反应管中，每管加入2μl第一轮反应产物，覆盖矿物油后扩增，反应条件为：95℃，5min→23×(94℃，1min→60℃，1min)→72℃，5min。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步描述：
附图1，是本发明内嵌引物的设计示意图，图中(GT)n为微卫星DNA序列，P1，P2为第一轮PCR所用引物，P3为本发明设计的内嵌引物。本发明设计出的内嵌引物序列见表1。每个位点中标号为3的引物即为本发明的半嵌套引物。
实施例1：
1、精液的制备：
共检测了6头公猪的精液，这些品种分别是“长白猪”3头，“清平猪”1头，“湖北白猪3系”1头和“大约克”1头。
2、引物设计：
以猪12号染色体上4个猪微卫星位点(Sw1553、Sw1350、Sw874、Sw957)的引物序列(Rohrer等，1994a，Genetics，136：231-245；1996，Genome Res.，6：371-392)，见表1。用于内嵌引物设计的全序列由美国农业部肉畜研究中心Gary A.Rohrer博士通讯提供，顺序如下(5′-3′)：Sw1553：
CCTTAACCCACTGAGCCACAAGAGAATTCCAGTATTATGCCTTTTAAAATTTTATGTGTTTTTAAAAATATCCCTCACTTGTTTTCCTCCAAATTATATGAATTTGGGGATATATAATAATACAAATTAATGTTGTAACAAGTAATGATAAAACAAAGTGAACCCCATAAAGTGTGAATAAGAATAAAGCTAGTCATTCTACTCCTCACAAGTAACCAGTGTTGGAAGCCTGGTGCGTTTTTCCATACCTTTCTCTCTGCTTTTACAAACATATACACACACATACACAGAGATTTTATTTGTTATTATTACCTGCATATGCATATGTATACATATATGTGTGTGTGTGAGTATGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATAACTTTACAGCCAATTTGCTTTTAGGAGCTGGTCAAAGGATCASw1350：
GGAACATGCTTTGAGATTGTAAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACCCCTTAAAAAAATCAAAAGTTCAATAACCAAAGAACACAGTAACTCTTCTAGCTCTGCCCCACCCATCTSw957：
CTCTTGGCATAAGGACCCCAGGGGTAGGAAGTGAGCTCAGAAAGTGCTGACTTGATTATTCACTCCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTGTACCCTTCCATCAGAATATAAGCTCTAGAGGAAAACCAAGCTTGTCCATCCCCSw874：
GATCTCTGGCTGGTAACTCCATGTGCCTGCATGGGGAAAAGAAAAAAGGAAAAAAAAAAAGAACCCAACTACAGCAGCGCAGTGGATTAAAGGACCTTGCAGAGCTGCTCAGTCCCTGGGCCAGGAACTTCCATATGCCTCAGGTGCCCATGAAAAAAAATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTATATATTTAAAGTGTATACGTATTCAAATACATATTTTAAGGTGTCAGGATACCCTCATAAAGGATC
表1 PCR引物序列和两轮扩增的引物浓度
Table 1 Primer sequences and concentrat ions
引物浓度位点 引物(5’-3’) Primer concentrationsLocus Primer(5’-3’) 第一轮 第二轮
1st round 2nd roundSw874 1 TTTATGAGGGTATCCTGACACC 0.2 09
2 TGGCTGGTAACTCCATGTGCC 0.2本发明 3 AAAAGAACCCAACTACAGC 0.9Sw1553 1 AGCTCCTAAAAGCAAATTGGC 0.2 0.9
2 ATTCTACTCCTCACAAAGTAAC 0.2本发明 3 GTGTTGGAAGCCTGGTGC 0.9Sw1350 1 AACATGCTTTGAGTTGAAACA 0.2 0.9
2 TGGGTGGGGCAGAGCTAG 0.2本发明 3 AAAAGAACCCAACTACAGC 0.9Sw957 1 ATGGACAAGCTTGGTTTTCC 0.2 0.9
2 ATGGACAAGCTTGGTTTTTCC 0.2本发明 3 AGGAAGTGAGCTCAAAGTAAC 0.93、试剂及其配制(1)精子洗涤液：0.5mol/l NaCl，10mmol/l Tris-Cl及10mmol/l EDTA，pH8.0，高压灭菌；(2)1M DTT：DTT 3.9g溶于20ml 10mM NaAc(pH5.2)中，过滤除菌；(3)生理盐水：100ml水中溶解0.8gNaCl；(4)单精子裂解液：贮存液为：a)222mMKOH，20ml双蒸水中溶解0.248gKOH，现配现用；b)500mMDTT：DTT 1.95g溶于10ml双蒸水中过滤除菌。工作液为：9份a与1份b混合，现配现用。(5)单精子中和液：900mM Tris-Cl(pH9.0)，300mM KCl，200mM HCl：80ml水中溶解10.9g Tris，HCl调pH9.0后，再加入0.447g KCl，405.1μl市售浓盐酸，定容至100ml，高压灭菌后，小份分装，4℃保存备用。(6)不含K+的Buffer(单精子PEP用)：1％Triton X100，100mM Tris-Cl pH 8.3，灭菌后装成1.5ml/管备用，-20℃贮存。(7)20％SDS蛋白酶K(20mg/ml)，-PCR及凝胶电泳、检测试剂参见第二部分。4、主要仪器设备为Olympus倒置相差显微镜，PCR仪5、单个精子的分离方法
取洗涤后的精液2μl悬浮于1ml PBS中，再从中取2μl加入到20ml 0.7％低溶点琼脂糖溶液中，混匀后铺于玻片上，37℃烘烤1h后，在倒置显微镜下，将只含有单个精子的琼脂糖碎片挑起，放入0.2ml Ep管中备用。6、内嵌引物的设计对每个位点设计一个半嵌套引物，参见图6所示。
图中说明如下：(GT)n为微卫星DNA序列，P1，P2为第一轮PCR所用引物，P3为自行设计的内嵌引物。本发明所设计出的内嵌引物序列见表1。每个位点中标号为3的引物即为本发明的半嵌套引物。7、单精子裂解、PCR扩增与等位基因检测的方法：
(1)单精子的裂解：向每个含有单个精子的反应管中加入5μl单精子裂解液，覆盖矿物油后，65℃保温30min；再加入5μl单精子中和液，离心，混匀后，-20℃保存备用。
(2)单精子PCR扩增：1)PEP(引物延伸预扩增)(primer extension preamplification，)的反应体系为：500μl 10×不含K+的Buffer，含15碱基的500μl 400mM随机引物(415种)，250μl 2mM 4种dNTP混合液，100μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，补H2O至4.0m，上述混合液可够100个反应之用。
向每个已裂解的单精子Ep管中加入40μl PEP反应液，混匀，覆盖矿物油后放入PCR仪中扩增，扩增条件为：95℃，5min→50×(37℃，2min→55℃，4min→92℃，1min)→72℃，5min。其中从37℃→55℃的升温速度为10S/℃。扩增完毕后，4℃保存备用。
(3)两轮PCR扩增：
第→轮PCR的反应体系为：500μl 10×PCRBuffer，250μl 2mM dNTP，10μl 100μM正向引物。10μl 100μM反向引物，20μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，加H2O至4.5ml。
将上述混合液以每管45μl分装至100个0.2ml Ep管中，然后加5μl单精子PEP产物，覆盖矿物油，放入PCR仪中扩增。扩增条件为：96℃，5min→10×(94℃，1min→60℃，4min)→15×(94℃，1min→60℃，3min)→72℃，5min→扩增产物4℃保存备用。
第二轮PCR的反应体系为：500μl 10×PCR Buffer，250μl 2mM 4种dNTP的混合液，45μl 100μM正向或反向引物，45μl 100μM内嵌引物，20μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加水至4.8ml，将上述混合液以每管48μl分装至100个反应管中，每管加入2μl第一轮反应产物，覆盖矿物油后扩增，反应条件为：95℃，5min→23×(94℃，1min→60℃，1min)→72℃，5min。上述所有操作均在超净工作台上进行，每步PCR均设阴性对照，检测是否有外源DNA污染。
(4)等位基因检测方法：
第二轮扩增完毕后，取10μl产物在聚丙烯酰胺顺序凝胶上电泳，电泳结束后，用银染检测各精子的基因型，即4个位点上的等位基因。
本发明与已有技术相比具有以下效果：
(1)首次建立猪单精子PCR分型技术，建立了一整套单精子分离、裂解、扩增以及等位基因检测方法，本发明不需复杂的仪器设备，一般实验室均可应用；
(2)为降低实验成本，在单精子PCR引物设计方面，根据微卫星DNA侧翼序列具保守性的原则，根据微卫星的全序列进行了内嵌引物的设计，通过随机抽取两个微卫星位点等位基因片段的扩增产物进行测序，证明设计是成功的，应用其进行扩增的准确性比两轮PCR中应用相同引物进行扩增有了很大提高，等位基因得以清晰鉴定，从而可以准确地确定了每个精子的单倍型。
(3)将PEP技术引入单精子微卫星等位基因的检测中，使得同时检测一个精子在多个位点上所携带的等位基因成为可能。
(4)本发明的单精子微卫星标记的检测方法，包括内嵌引物设计及银染法检测等位基因，尚未见其他研究者使用。
(5)本发明具有方法简便、快速、安全，不污染环境，其效率如表2所示：
经 表2 各种参数的估计结果
参数 估计值 标准误 95％置信区间
αA 0.9152 0.0314 0.8536-0.9767
αa 0.7223 0.0352 0.6533-0.7912
αB 0.8858 0.0251 0.8366-0.9349
αb 0.8977 0.0267 0.8453-0.9500
αC 0.8819 0.0254 0.8323-0.9316
αc 0.8497 0.0325 0.8220-0.9439
αD 0.9054 0.0417 0.8236-0.9871
αd 0.8921 0.0332 0.8270-0.9571
βA 0.0957 0.0167 0.0629-0.1284
βa 0.0796 0.0267 0.0272-0.1319
βB 0.0929 0.0168 0.0599-0.1258
βb 0.0684 0.0150 0.0390-0.0978
βC 0.0878 0.0016 0.0562-0.1193
βc 0.0738 0.0137 0.0469-0.1006
βD 0.1027 0.0164 0.0705-0.1348
βd 0.0733 0.0174 0.0391-0.1074
γ1 0.7056 0.0238 0.659-0.7522
γ0 0.2323 0.0232 0.1868-0.2778
γ2 0.0621 0.0121 0.0376-0.0856
注：αA、、αa、αB、αb、αC、αc、αD、αd为各等位基因扩增效率。βA、βa、βB、βb、βC、βc、βD、βd为扩增时被携带各等位基因片段的外源DNA污染的概率。
γ1、γ0、γ2为1个精子、0个精子、2个精子进入一个反应管的概率。