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用于血液保存的抗病原体组合物
技术领域
本发明涉及用于血液、血液制品、以及诸如献血袋等的血液容器的抗病原体组合物。本发明还一般地涉及处理和消毒人类血液制品的方法。更具体地，本发明涉及消毒全血、血细胞、血浆蛋白和血浆的方法，使其可安全和有效地用于诊断、治疗或研究目的。本发明还涉及血液循环系统对由病原体引起的病理状态的控制，所述的病原体通常为病毒、细菌、原虫(protozoan)、真菌或寄生因子(parasitic agent)(寄生因子生命周期的任一阶段)。
背景技术
塑料血液收集袋的发展促进了捐献的全部血液分离为各种组分和类似产品，因此使这些不同的血液制品(例如血小板浓缩液)可用作输血制品。随着时间的流逝和研究以及临床数据的积累，输血手段有了很大变化。目前所用方法的一个方面是很少使用全血，而是对需要红细胞的病人输入压积红细胞(packed red cells)，对需要血小板的病人输入血小板浓缩液，对需要血浆的病人输入血浆。
但是输血制品的增加伴随着向接受输血者疾病传播的增加。对于确保没有疾病的供血存在着很大的需要。
来自人类和动物捐献者的血液制品广泛地用于治疗、诊断和实验目的。与使用来自人类和动物捐献者的血液制品相关的一直存在的问题是这些制品会被血源性病毒和其他微生物如细菌污染。引起各种形式的肝炎的病毒尤其危险，包括乙型肝炎病毒，非甲非乙型肝炎病毒或多种病毒。其他相关的病毒是巨细胞病毒和爱-巴二氏病毒。
与无法治愈和经常是致命的疾病如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)相关的病毒是由逆转录病毒或逆转录病毒群(HIV，HIV-1和HIV-2)引起的。HIV-1被认为认为是引起AIDS最通常的原因。
通过输血和施用血液制品传播的肝炎、AIDS和细菌的危险并不局限于血细胞，而且延伸到施用血浆和血浆组分如VIII因子浓缩物，IX因子浓缩物，γ球蛋白和抗凝血酶III。
用足以使病毒、细菌和其他生物显著灭活的消毒剂对包括诸如红细胞、血浆和血浆组分的全血和血液制品进行消毒已经不受欢迎，这是因为足以使病原体灭活的活性通常破坏血细胞组分或使血浆和血浆蛋白组分灭活。另外，在将要用于输液的血液制品中任何剩余消毒剂的存在可能对接受输血者是危险的。
在美国通常使用的组分分离步骤，即柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺嘌呤(CPDA-1)系统，采用一系列步骤将捐献的血液分离为三种组分，每种组分具有显著的治疗和经济价值。该方法通常使用血液收集袋，其通过柔韧的管形材料与至少一个优选两个或更多的随体袋(satellite bag)整体连接。使用离心过滤，全血可用差示沉降分离为很有价值的组分，如血浆、压积红细胞(PRC)、悬浮于澄清血浆中的血小板(富血小板血浆或PRP)、血小板浓缩液(PC)、以及冷凝蛋白质(可能需要额外的加工)。
通常使用的非CPDA-1系统包括Adsol、Nutricell和SAG-M。在后面的这些系统中，收集袋只包含抗凝血剂，而营养液可以预先放置于随体袋中。在PRP从PRC中分离出以后，可将营养液转移至PRC中，因此得到较高的血浆收率和PRC较长的储存期。目前这些病毒标记筛选的改进和捐献人自动排除的改进不断地提高了供血安全。但是，尽管有这些方法，由于目前的筛选试验无法筛选出很少出现的或还未知的输液传播病原体，因此随着输液血液细胞组分所带来的传播病原体的危险仍然存在。(Dodd，R.Y.New Engl.J.Med.327：419-421(1992)；Soland，E.M.，等，J.Am.Med.Assoc.274：1368-1373(1995)；Schreiber，G.B.，等，New Engl.J.Med.334：1685-1690(1996))。
为战胜与筛选试验相关的缺陷，使用血液、红细胞浓缩液(RBCC)和其他血液衍生组分的消毒步骤可确保消除病原体传播。在这方面，已经使用了各种方法消毒血细胞，目前最有效的是使用光化学方法。(Ben-Hur，E.和B.Horowitz Photochem.Photobiol.62：383-388(1995)；Ben-Hur，E.和B.HorowitzAIDS 10：1183-1190(1996))。最有前途的光化学方法采用酞菁染料(在远红外(660-700nm)由光活化)对RBCC消毒(Horowitz，B.等.Transfusion31：102-108(1991)；Ben-Hur，E.，等.J.Photochem.Photobiol.B：Biol.13：145-152(1992))。
已经使用巴斯德消毒法和其他物理-化学技术除去或使血液组分灭活，但是这些技术的大部分均局限于新鲜血浆或新鲜冷冻的血浆。到现在，这些技术不适合于处理全血的细胞组分。
用于血液制品的一种消毒剂是β-丙内酯(beta-propiolactone)。但是β-丙内酯是已知的致癌物质，因此非常危险。这种物质显著的剩余量可能会留在被实际输血的血液制品中，使用丙内酯具有潜在的危险。
在美国专利号4,833,165(1989年5月23日以Allan Louderback的名义授权)中，使用0.1％甲醛和/或苯酚使血液中地HTLV-III灭活。但是最近的数据和信息表明处理过的含有少至0.02％甲醛和0.01％苯酚的红细胞是不可行的，不适用于输血。
用严格灭菌的方式使病毒灭活是不可接受的，这是因为该方法通常破坏红细胞、血小板和易分解的血浆蛋白，如凝固因子VIII。可行的RBC可用以下的一种或多种来表征：合成ATP的能力；细胞形态；P₅₀值；过滤性或变形性；氧基血红素、高铁血红蛋白和血色素值；MCV、MCH和MCHC值；细胞酶活性；以及体内存活性。因此，如果病毒灭活的细胞被破坏到细胞不能代谢或合成ATP的程度，或危及到细胞循环，那么它们用于运输药物的用途也会受到危害。
由于上述原因，用严格的蒸汽灭菌使病毒灭活是不可接受的。如湿蒸汽一样，干热消毒对血细胞和血蛋白在需要降低病毒传染性的水平上是有害的。诸如碳水化合物等稳定剂的使用无法对脆弱的血细胞和蛋白质提供足够的保护使其免受暴露于高温和高压下的影响。
目前采用纯化血浆蛋白质组分然后冻干蛋白质制剂的方法，其包括用有机溶剂和加热处理，或用清洁剂抽提以使膜包被病毒的脂质外壳破裂。单独的冻干(冷冻-干燥)不足以使病毒灭活，或使血液蛋白对加热消毒的影响足够稳定。采用有机溶剂或清洁剂法不能与血细胞一起使用，因为这些化学品会破坏包被细胞的脂质膜。
在在1958年首先证明了另一种用于血浆蛋白中病毒灭活的方法，该方法中使用了化合物、β-丙内酯和紫外线(UV)照射。由于对β-丙内酯在达到某些可灭活病毒的使用量时所具有的毒性以及化学药剂对蛋白质造成的无法接受的破坏程度，这种方法在美国不被接受。对β-丙内酯的爆炸可能性也有担心。
使用某些非补骨脂素光敏剂开发了使用光敏剂和光来灭活病毒净化剂的方法。所采用的光敏剂通常是染料。实例包括二聚血卟啉醚(dihematoporphyrin ether)(DHE)，部花青540(MC540)和亚甲蓝。
人们非常希望提供用于血液及血液制品和血液容器如献血袋的抗病原体组合物。
非常希望提供加工和消毒人类血液制品的方法。
非常希望提供消毒全血、血细胞、血浆蛋白和血浆以使其可安全有效地用于诊断、治疗或研究目的的方法。
非常希望提供通过血液循环系统控制病理状态的方法，该病理状态是由病原体引起，通常是滤过性病毒，细菌，原虫，真菌或寄生介质。
发明概述
本发明的一个目的是提供用于血液及血液制品和血液容器如献血袋的抗病原体组合物。
本发明的另一个目的是提供加工和消毒人类血液制品的方法。
本发明的另一个目的是提供消毒全血、血细胞、血浆蛋白和血浆以使其可安全有效地用于诊断、治疗或研究目的的方法。
本发明的另一个目的是提供一种控制血液循环系统病理状态的方法，该病理状态是由病原体引起，通常是滤过性病毒，细菌，原虫，真菌或寄生介质。
根据本发明，提供了用于消毒液体和生物组织以及被液体和/或生物组织污染的表面(surface)的抗病原体组合物，其包括与可接受的载体联合的至少一种季铵化合物的抗病原体的量。
本发明优选的抗病原体组合物还包括双胍化合物。
在本发明的优选的抗病原体组合物中，季铵化合物包括两种或多种季铵化合物的混合物。
所述的液体和生物组织可选自水、水基溶液、血液(即全血)和血液制品、用于移植的皮肤和器官。
所述的表面选自容器、过滤器、管形材料、封条(seals)、夹钳、转换肢封闭物(transfer leg closure)、医疗器材、操作台和体检台。
容器可以是生物液体的容器或水的容器。
容器为血液容器或血液制品容器，如献血袋或献血瓶。
血液制品可选自血浆、压积红细胞、富血小板血浆、血小板浓缩液和冷凝蛋白质。
组合物可以是霜、油膏、乳液、凝胶、粉末、清洁剂、肥皂、液体或固体形式。
根据本发明，提供了使容器中的血液或血液制品中的病原体灭活的方法，包括使至少一种血液、血液制品和容器与本发明的组合物接触。
根据本发明，提供了医疗器材，其包括至少一个用本发明的抗病原体组合物处理过的表面或含有至少一种本发明的抗病原体组合物。
医疗器材可以是诸如献血袋或献血瓶等生物液体的容器、在输送入个体前血液和血液制品通过的内嵌式过滤器、以及在从个体采血时血液或血液制品通过的内嵌式过滤器。
本发明的优选医疗器材还包括用于分散所述抗病原体组合物的多孔介质。
根据本发明，提供了处理体外(in vitro)或体外-体内(ex-vivo)的生物液体的方法，其包括在容器内收集生物液体，以及使生物液体暴露于本发明的抗病原体组合物中。
根据本发明，提供了在体外或体外-体内抑制生物液体中的人类免疫缺陷病毒的感染或复制的方法，其包括用有效抑制量的双胍化合物或其衍生物以及至少一种与诸如DMSO等药学载体相联合的季铵化合物来处理生物液体。
根据本发明，提供了在体外或体外-体内消毒红细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)使所述红细胞与消毒组合物接触足够长的时间以使存在于红细胞中的病原体灭活，其中所述消毒组合物基本由消毒浓度的双胍化合物组成，该化合物与溶质的等压有效浓度的溶液联合，从而使所述消毒组合物基本与血液等压；和
b)使所述红细胞与所述消毒组合物分离。
在本发明的优选方法中，双胍化合物选自季铵化合物及其组合。
本发明的优选方法还进一步包括灭活病原体后除去组合物，或处理生物液体后除去组合物。
本发明涉及处理捐献的血液的系统，该捐献的血液用于血液组分的治疗输血的目的，特别涉及用于制备不含病原体或病原体灭活的血液或血液组分的改进的方法和设备。本发明也涉及用于加工处理过的生物液体使其成为各种组分的生物液体处理系统。
本发明提供了减少诸如病毒和/或细菌等病原体含量的组合物和方法，其中所述病原体存在于红细胞组合物中。特别地，本发明人已经发现，将红细胞组合物暴露于诸如季铵化合物的双胍化合物，足以使病原体灭活以使血液或血液制品可以用于输血，而不破坏红细胞或其他血液组分，其中的双胍化合物存在于具有一种或多种张力活性的表面活性剂组合物中，或与该组合物一起。
本文引用的所有文献均全文引入作为参考。
发明详述
本发明涉及有效安全地消毒全血和血液制品。本发明对于所有的血液制品如用于输血的全血、血细胞、血浆和血浆蛋白都有着广泛的用途。由于很少使用全血，本发明更具体地涉及含有红细胞和/或血浆的组合物的消毒方法。
本发明是组合物，其含有一种或多种诸如季铵化合物的张力活性表面活性剂作为活性剂，该组合物适用于消毒血液或血液制品。
本发明也是处理血液或血液制品的方法，包括使血液或血液制品与含有一种或多种本发明的化合物或活性组分的组合物接触，所述化合物以足够使血液中的一种或多种病原体灭活的量存在，从而使化合物灭活病原体。该方法可进一步包括从血液或血液制品中除去所述化合物。
本发明还可用于移植器官和组织中病毒的灭活，还可以局部药膏、油膏、乳液、凝胶、粉末、液体、固体、清洁剂或肥皂的形式用于治疗皮肤或上皮的疾病，或用于局部净化。
本发明也可用于生产人用或兽用的病毒疫苗，特别是生产活的，无生存能力的(non-viable)或减毒的病毒疫苗。
本发明包括减少生物溶液中的病毒、细菌、原虫、真菌和其他寄生污染物的方法。生物溶液包括但不局限于含有血液、血液组分、细胞培养物或细胞培养物组分的溶液。该方法包括将液态组合物与本发明的组合物混合，其中本发明的组合物能够使病毒、细菌原虫、真菌或寄生污染物固定。
本发明也是减少医疗器材中的病毒、细菌、原虫、真菌和其他寄生污染物的方法，所述医疗器材如医生、护士、以及诸如采集血液或血液制品的医疗技术人员、或牙科医生所用的医疗器材。该方法包括使医疗器材与含有一种或多种本发明的化合物或活性剂的组合物相接触，所述化合物以足以使医疗器材中或上的一种或多种病原体灭活的量存在。该方法还可进一步包括除去医疗器材中的化合物。
术语“医疗器材”指在对动物或人体进行检查、清洁、从中收集液体或治疗(medical intervention)时所使用的任何工具。此类工具包括但不局限于外科设备，其中外科设备包括但不局限于探测器，解剖刀，钳，镊子，针；用于除去唾液或血液的抽吸装置，其包括其中所有的管口，封条，管形材料，过滤器，容器和储物池(reservoirs)；内诊镜；光纤；传感器；导线；外科活套(surgical loop)；以及内嵌和外嵌管形材料和过滤器，其使血液在输入个体前和/或在从个体进行收集时使血液或血液制品通过。
本发明也提供了减少水中或水容器中的病毒、细菌、原虫、真菌和其他寄生污染物的方法，如在游泳池、热浴盆(hot-tubs)、极可意水流按摩浴缸(Jacuzzi)、浴室、涡流浴室、空调和加湿器中所发现的上述物质，该方法包括使水或水容器与含有一种或多种本发明的化合物或活性剂的组合物接触，所述化合物以足以使水中或水容器上的一种或多种病原体灭活的量存在，从而利用化合物使病原体灭活。该方法还可进一步包括除去水或水容器中的化合物。此类水或水容器可以是在家里、酒店、温泉或度假村、办公室、或储藏间。
本发明也包括对于具体的血型具有特异性的一种或多种组合物。
本发明也是血液容器等，例如含有一种或多种本发明化合物的血液或血液制品输血袋。
在本发明最优选的实施方案中，含有季铵化合物作为活性剂的组合物单独或以混合物的形式与血液或血液制品混合，用于消毒血液。该组合物对处理血液、血液制品、生物组织、以及其它生物液体有效。活性剂对多种病原体都有效，病原体包括但不局限于病毒、细菌、原虫、寄生虫、真菌和其他病原体。最优选的组合物包括一种或多种季铵化合物和任选的一种双胍化合物。
根据消毒血液制品的优选方法，提供了全血或血液制品中包括HIV病毒在内的病毒和细菌的灭活方法。消毒过的血液或血液制品可以安全而有效地用于治疗和诊断。本发明是基于令人意外的发现，即所述化合物并不溶解红细胞也不对血液制品造成危害，因此可用作消毒剂除去血液或血液制品中的病原体。而且，与血液非等压的以及到现在也没有被考虑用于血液制品的含有这些化合物的消毒剂组合物可以用作血浆和血浆蛋白的消毒，而不会使蛋白质变性，而这种变性导致生理学活性的大量损失。
根据本发明，消毒全血或全血制品的方法包括提供消毒浓度的活性剂或化合物以及稀释剂的消毒组合物，然后将全血或全血制品与消毒组合物混合足够长的时间以使全血或全血制品中的任何病原体灭活。混合步骤可以通过以下方式进行：分别将血液与组合物中的组分混合，与全部组分直接混合，或定时(by timing)加入一种或多种组合物的组分。血液或血液制品消毒后，活性剂或化合物可以任选地从消毒组合物分离，提供安全而且有效的用于治疗或诊断用途的血液或血液制品。
术语“药学可接受的载体”是指可用来在有效的抗病原体浓度溶解和/或稀释所述季铵化合物的任何载体，包括但不限于盐水，缓冲液，DMSO和葡萄糖。
术语“双胍化合物”和“季铵化合物”是指所有的季铵化合物和其衍生物，包括但不限于二癸基二甲基氯化铵、所有的二氨基丙基月桂基胺化合物、壬苯醇醚-9化合物(nonoxynol-9)、双胍化合物和其衍生物。术语“化合物”应包括上述任何化学品，单独存在或与其他化学品或化学物质相联合，例如在混合溶液中，包括但不限于DMSO。优选的活性剂是烷基三甲基季铵chlorhexidrine(alkyl trimethyl quaternary ammonium chlorhexidrine)(和其卤代物)，二烷基二甲基卞基季铵chlorhexidrine(dialkyl dimethyl benzyl quaternaryammonium chlorhexidrine)。季铵化合物的实例见Marchisio等，J.Biomater.Sci.Polymer Edn.6：533-539(1994)，和Gadwallader等，J.Pharm.Sci.，7：1010-1012(1965)，均全文引入作为参考。
如果需要，含有活性剂的组合物也可包含一种或多种附加的化合物。这些化合物可包括DMSO，或其它改变细胞表面极性的试剂；一种或多种氨基酸；一种稀释剂；一种或多种氯化物，如氯化银；和/或EDTA。
如下所述，上述指出的化合物将有效地消毒血液和血液制品而没有生理学活性的大量损失。预期在本发明所教导的范围内，用具有足够氧化性的氧化化合物消毒血液和血液制品使病原体灭活，如病毒，细菌，原虫，真菌和寄生因子。
术语“液体”指水、水基溶液和生物液体。
术语“生物组织”指用于移植的皮肤和器官。
在本文使用的生物学液体指可被直接输入病人或病人的循环系统的任何液体。通常的生物液体包括但不局限于：全血；抗凝集全血(AWB)；从AWB得到的压积红细胞；从AWB得到的富血小板血浆(PRP)；从AWB或PRP得到的血小板浓缩液(PC)；从AWB或PRP得到的血浆；与血浆分离并重悬于生理学液体中的红细胞；与血浆分离并重悬于生理学液体中的血小板。血液制品或生理学液体还包括任意处理过的或未处理过的液体，其与活微生物相关，特别是血液包括全血、温血或冷血，以及储存的或新鲜的血液；处理的血液，如用生理溶液稀释的血液，所述生理溶液包括但不局限于盐水、营养物质、和/或抗凝集溶液；一种或多种血液组分，如血小板浓缩液(PC)、富血小板血浆(PRP)、无血小板血浆、贫血小板血浆、血浆、或压积红细胞(PRC)；以及从血液或血液组分或骨髓得到的类似血液。生物学液体可包括白血球，或可以经过处理除去白血球。如本文所述，血液制品或生物学液体指上述组分，以及从其他方法得到并具有相似性质的类似的血液制品或生物学液体。根据本发明，这些血液制品或生物学液体的每种均可按照本文所述的方式加工。
如本文所述，病原体指一种或多种引起感染的微生物或类似物。病原体的实例包括但不限于病毒，细菌，寄生虫，原虫或真菌。病毒的实例包括但不远限于单纯疱疹病毒，HIV，肝炎，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，呼吸道合体病毒，蓝舌病毒，和牛腹泻病毒。病毒还包括巨细胞病毒，爱巴病毒(Epstein-Barr virus)，I型和II型单纯疱疹病毒，以及其它自由地循环在血液中的病毒，和细胞相关的病毒。细菌的实例包括但不局限于Heliobacterpylori，大肠杆菌(E.coli)，假单胞菌(Pseudomonas)菌株，其包括铜绿菌素(aeruginosa)，葡萄状球菌(staphylococcus)，普通变形杆菌(Proteus vulgaris)和白色念珠菌(Candida albicans)。真菌的实例包括但不限于曲霉菌(Aspergillus)。典型的寄生虫包括但不限于阿米巴(Ameoba)、疟原虫(Plasmodium)、利什曼虫(Leishmania)、Mycosus profundus、锥体虫(Trypanosoma)、螺旋菌(Spirochete)和虫媒病毒(Arbovirus)。
在本发明的优选实施例中，要处理的病原体是适合于在血液或血液制品中被灭活。减少感染性病原体的含量或其他类似的用语是指破坏和/或灭活所有的或几乎所有的传染性病原体。在本发明的优选实施例中，减少传染性病原体的含量指充分地破坏或灭活病原体，以使血液或血液制品可以用于输液或其他目的。
根据本发明，合适的稀释剂包括用于制备等压溶液的任何化合物。溶质的实例包括但不限于糖如右旋糖和葡萄糖、多糖如右旋糖苷、白蛋白、以及碱土金属盐包括氯化钠、氯化钾和溴化钾。已知用于储存生理细胞和组织的溶质的组合物也是适合的，包括组合物如柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖，柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤和盐水-甘露醇-右旋糖-腺嘌呤。在下面的更详细的描述中，在稀释剂中以糖的形式存在的至少一种溶质是优选的，这是因为糖有助于减少在消毒过程中形成的任何高铁血红蛋白和氧化血红蛋白(oxidizedhemoglobulin)。
在本发明的实践中，以等压特性而采用的稀释剂可以组合。当消毒红细胞时，组合的稀释剂是特别适合的，这是因为红细胞的可商购的集合单元通常储存于含有抗凝剂的等压溶液中，如ACID(酸-柠檬酸盐-右旋糖)、CPD(柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖)、CPD-A(CPD-腺嘌呤)。因此当消毒储存于含有抗凝剂的等压溶液中的红细胞集合单元时，消毒组合物可以在不同的等压稀释剂中制备，例如生理盐水，以及和抗凝剂溶液组合。
进一步根据本发明，消毒血浆或血浆制品如血浆蛋白组分的过程任选地利用没有溶质的消毒组合物，其中该消毒组合物的稀释剂是无菌水、水、蒸馏水或无菌蒸馏水。由于血浆和血浆制品不包括组织或其他形式的细胞物质，因此没有要保持细胞渗透压的等压介质的迫切需要。
可以通过仅将血液或血液制品和消毒组合物在合适的容器中混合并轻微搅拌以确保血液也和消毒组合物充分反应来进行消毒组合物与血液或血液制品的混合。合适的容器包括但不限于血液收集袋和储血设备。但是优选使用本领域已知的自动细胞清洗设备，其可从包括Cobe的多种来源得到。
根据本发明，季铵化合物优选与双胍联合的季铵的消毒有效浓度、以及消毒血液和血液制品的足够长的时间主要取决于所选择的化合物。可以理解组合物中的每种组分的有用浓度和消毒时间是互相影响的。因此当与血液或血液制品混合较长时间，化合物的浓度可以不同，一种或多种活性剂的相对较小的浓度可以是消毒有效浓度。相反，当在消毒组合物中使用较高浓度时，充分消毒血液或血液制品的时间较短。
消毒血液或血液制品的方法的实例可包括首先将血液与DMSO混合，搅拌，加入一定量的表面活性剂如季铵或双胍，其加入量使表面活性剂不沉淀，以及搅拌。该方法还可任选地进一步包括从血液组合物中除去活性剂的步骤。
本发明还包括收集和处理血液的方法，包括在容器中收集血液和血液制品；任选地除去或分离血液制品，例如血浆，并将血液或血液制品与含有活性剂的组合物接触，其中需和物中含有的活性剂足以使血液或血液制品中的病原体灭活。
用于生物液体处理的容器可以由任何与生物液体如全血或血液组分相容且能经受离心过滤和灭菌环境的材料制成，此类容器的很多种在本领域是已知的。例如血液收集及随体袋通常由塑化聚氯乙烯制成，例如用邻苯二甲酸二辛酯(dioctylphthalate)、邻苯二甲酸二乙基己酯(diethylhexylphthalate)或苯三甲酸三辛酯(trioctyltrimellitate)塑化的PVC。收集袋可以由聚烯烃、聚亚安酯、聚酯和聚碳酸酯制成。
如本文所述，管形材料可以是提供容器间的液体连接的任何导管或设备，通常由用于容器的同样弹性的材料制成，优选塑化的PVC。管形可延伸入容器的内部，可用作例如虹吸管。可能有很多管形材料提供任何单个容器间的液体连接，管道可以很多方式定位。例如至少两个管道定位于收集袋的顶部，或位于袋的底部，或管形材料位于袋的每个末端。
封条、阀、夹钳、转换肢封闭物等通常位于管形材料内或其上。本发明并不限于制作容器或连接容器的导管的材料的类型。
很多附加的容器可以是与生物液体加工系统有联系的，可用来限制不同的流动路径。例如含有生物溶液的附加随体袋可以放置在与生物液体加工体系相联系的位置。
根据本发明，生物液体的收集和加工装置应能够经受严格的灭菌和离心分离环境，这些环境通常包括辐射消毒(在约2.5兆拉德)，和/或高压灭菌(在约110-120℃进行约15-60分钟)，和/或离心分离(通常约2500-3500G，进行约5-15分钟；但其取决于需要使哪种生物液体达到最大回收，离心分离可以在约5000G下进行约10-20分钟)。
本发明参照以下实施例更容易理解，以下实施例只是用于说明的目的而非限制本发明的范围。
实施例1-测试HIV-1病毒活性抑制的方法
能够用各种实验技术筛选用于抑制HIV的双胍。一种实验技术包括抑制病毒在人外周血单核细胞(PBM)中复制。测定存在于培养基中的病毒编码的逆转录酶(在逆转录病毒中发现的酶)确定产生病毒的量。另一种技术涉及在不含细胞的体系中对纯化的逆转录酶的活性抑制进行测量。本领域已知的筛选方法的实例在以下详细介绍。
检测抑制人外周血单核细胞(PBM)中HIV-1复制的抗病毒药物的方法
采用下述方法分离来自HIV-1和B病毒血清反应阴性的捐献者的细胞：用Ficoll-Hypaque非连续梯度在1,000次/g离心30分钟，用PBS洗涤两次，然后在在300次/g沉淀10分钟。接种前，在RPMI 1640培养基中，用浓度为16.7μg/ml的植物血球凝集素(PHA)刺激细胞三天，其中所述的RPMI1640培养基中还添加了15％加热灭活的胎牛血清、1.5mM的L-谷胺酰胺、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、以及4mM碳酸氢钠缓冲液。
从亚特兰大的疾病控制中心得到HIV-1(LAV-1菌株)，用以上的RPMI1640培养基在PHA刺激的人PBM细胞中传播，其中该RPMI 1640培养基中不含有PHA，但添加了7％的白细胞介素-2(Advanced Biotechnologies，Silver Spring，Md.)、7μg/ml DEAE-右旋糖苷(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、和370U/ml抗人类白细胞(α)干扰素(ICN，Lisle，III)。从不含细胞的培养物上清液中获得病毒，并在-70℃储存直至使用。
用于细胞培养的培养基
在T线(line T)上研究细胞毒性，所用培养基相当于添加了10％胎牛血清(BIO-LAB)、1％的谷胺酰胺(GIBCO)、1％抗生素(PSN，GIBCO)的RPMI 1640。
为研究病毒制剂处理后的剩余感染强度，所用常规人类淋巴T细胞的培养基(完全培养基)相当于添加了10％白细胞介素-II、多聚季胺(polybrene，2mg/ml)和人-抗干扰素血清(1.2500(M.A.Rey等)，Biochem.Biophys.Res.Com.，1984，121 126-133)的上述培养基。
细胞
采用一种CEM细胞克隆株--未成熟T的淋巴细胞系进行细胞毒性研究。
采用T淋巴细胞进行感染性研究，该T淋巴细胞从健康捐献者的外周血液得到，并在Ficoll梯度上分离。
以稀释至1/500并在完全培养基中培育的植物血球凝集素P(PHA P)刺激淋巴细胞三天。用病毒感染原始T细胞(blastic cells T)，处理或不处理，显示剩余传染强度。
HIV-病毒
从HIV-1感染的CEM细胞系的上清液培养液中获得病毒。采用该HIV-1感染的类T淋巴母细胞系来进行病毒制备。
进行病毒的逆转录酶活性(ATI)的定量分析后，评价所用上清物质的滴度。
在下列测试中，使用上清物质，其ATI值是1.8×10⁶cpm/ml。
方法
对T细胞的化合物细胞毒性的研究
细胞：具有1×10⁶细胞/ml的CEM克隆株的细胞悬浮液。
产品：采用QACs，Bardac22化合物制备的RPMI 1640培养基进行各种稀释。
在24孔细胞培养板上每孔加入0.5ml的稀释液和0.5ml CEM克隆株的细胞悬浮液(5×10⁵细胞)，在37℃的培养箱中进行培养。
用Tryptan Blue计数细胞悬浮液并与未处理细胞的对照样品进行比较后，来评价细胞生长。
Bardac，单独或相联合，对HIV-1病毒感染正常人T淋巴细胞的能力的作用
病毒溶液的制备：取含有1ml ATI为1.8×10⁶cmp/ml的病毒上清液的一些试管用超速离心进行浓缩。采用无菌双蒸的水制备的QACs不同的稀释液或水(未处理的对照病毒)悬起所得到的病毒残余物。
病毒制剂的处理：根据下列步骤处理浓缩的病毒制剂：
处理病毒样品：将采用超速离心得到的病毒残余物用各种浓度的所研究产品(QACs)100μ进行重悬，并温育10分钟。
病毒样品对照：未处理的对照病毒：以100μl无菌双蒸水代替产品。
10分钟的温育时间后，漂洗每种样品中的病毒，然后加入12ml的RPMI1640培养基再次浓缩，超速离心。然后用1ml完全培养基悬起病毒残余物，将其用于感染正常人的T淋巴细胞。
样品感染性的测定：采用上述的每种处理的病毒制剂或对照品感染4×10⁶正常的人淋巴T细胞。T细胞的感染根据前人所述方法进行(F.BarreSnoussi等.Science，1983，220：868-871)，计算总数，在37℃，用1ml每种处理的病毒制剂或对照品对悬浮于1ml完全培养基中的4×10⁶细胞温育1小时。
用几毫升的培养基洗涤两次后，调节细胞悬浮液至1×10⁶细胞/ml的浓度。感染的那一天定义为第0天。
对照细胞：培养4×10⁶的T淋巴细胞，在与其他样品相同的条件下每3-4天进行传代。
该对照品相当于在操作过程中的病毒产品的阴性对照。
通过下列步骤，测量存在于培养物上清液中的逆转录酶活性从而确定该段时间中的病毒生成。
对照病毒制剂和用所述产品处理的病毒样品的逆转录酶活性的测定
采用定量分析使得可能对起始样品中未灭活的残余病毒进行评估。该分析是在每2天或3天取出1ml的培养上清液并超速离心的基础上进行。
在50μl的反应混合物中测定酶活性，该混合物含有50mM Tris pH7.8，20mM MgCl2，20mM KCl，2mM dithotreitol，0.25OD/ml的oligo dT，0.25OD/ml的polyrA，0.1％Triton×100和2.5μCi 3H DTTP。
在37℃培育1小时后，加入10μl 0.2M的EDTA使反应停止，样品在DE81膜上沉积。
用5％Na₂HPO₄然后用蒸馏水洗涤几次后，干燥该膜，用β闪烁计数器(PACKARD)测定放射活性。
结果
表1是不同产品处理病毒样品对HIV-1病毒感染性的的影响。
表1在感染的培养物上上清液物质中的ATI数量分析(cpm/ml)

  J3  J6    J10    J13    J17    J20    J23    J27   J30   Bardac(％)   0.01   0.006   0.004   0.002   0.0004  334  320  346  464  702  222  326  298  2472  18136    1768    204    160    16066    117326    1592    248    170    24902    74214    190    364    350    77754    50674    390    180    218    75554    22478    1328    328    444    101394    13806    780    588    244    80560    7800   1000   196   264   64692   4426   Chlorhexidine(％)   0.01   0.005   0.002  262  360  252  274  374  352    200    580    1304    250    742    1752    230    1902    4288    272    1126    6138    456    1226    4614    420    528    1616   276   720   4528   Bardac^+   Chlorhexidine(％)   0.006+0.01   0.006+0.005   0.006+0.002   0.004+0.01   0.004+0.005   0.004+0.002   0.002+0.01   0.002+0.005   0.002+0.002   0.0004+0.01   0.0004+0.005   0.0004+0.002  336  326  280  302  298  228  66  6  364  998  2163  438  576  202  196  240  326  288  268  262  246  222  234  246  3362    116    210    196    210    206    208    222    314    666    186    824    21734    226    384    282    222    344    232    200    308    908    226    1142    36246    280    274    192    240    170    1200    244    4386    748    204    2340    39364    236    166    274    350    346    274    394    308    1206    250    2190    40126    342    280    376    366    288    254    650    268    1110    344    2120    18480    510    406    478    278    456    422    322    446    370    352    1094    6530   240   304   330   248   282   250   280   254   336   226   1466   10476   T1   T2   T3   T4  1516  342  1594  232  3120  4688  45068  220    24822    61384    75046    218    52912    64284    56928    202    49884    69172    12872    190    30540    15366    8932    268    21800    12364    5468    394    4500    3500    1050    244   3464   3790   1746   308
T1：用100μl双蒸水处理的对照病毒
T2：用100μl双蒸水处理的对照病毒
T3：对照病毒，确认
T4：对照细胞，未感染
表1清楚地表明了在低浓度(0.002+0.002浓度)的Bardac/二葡萄糖酸氯己定(chlorohexidine digluconate)联合的协同反应，其显示了在第30天没有病毒，实际上，在同样的浓度，所用的两种产品本身不是杀病毒的(virocidal)。
实施例2-本发明的组合物对HBV病毒的杀病毒反应
对乙型肝炎病毒的乙型肝炎病毒抗原(AgHBs)体外降解的作用：virocide+从乙型肝炎病人提取的人血清(1/1000th)
               表II所测试的混合物
Bardac(％)    +    CHG^*(％)    单独Bardac    单独CHG
0.2             -    0.25          0.2             0.25
0.1             -    0.1           0.1             0.1
0.04            -    0.05          0.04            0.05
0.2             -    0.05
0.04            -    0.25
^*CHG相当于二葡萄糖酸氯己定的缩写
                 表III结果
所测试的杀病毒剂           剩余AgHBs(比例)
Bardac0.2％              1.35
Bardac0.1％-CHG0.1％     2.18
Bardac0.2％-CHG0.05％    3.07
Bardac0.2％-CHG0.25％    3.23
与0.2％ Bardac本身相比，即使剂量减少50％，包含0.1％ Bardac和0.1％CHG的混合物也显示出有趣的活性。
所测试的各种混合物的一般性结论
只有残留的乙型肝炎病毒的抗原可能在测试的Bardac-CHG混合物中进行辨别。
与0.025％CHG联合的0.02％的Bardac与0.1％Bardac同样有效。5倍的减少是显著而且重要的，尤其是在本发明的组合物与弹性体材料共同使用时，Bardac对弹性体有毒。
实施例3-本发明组合物对单纯疱疹病毒(HSV)的杀病毒菌反应体外测试
所进行的测试
病毒株：这是I型人疱疹病毒(herpes virus Hominis type I)株，Bey株(HSV1)，其在人纤维原细胞或KB细胞上保持存活，在一种或其他类型的细胞上进行很多重要的改变。
当获得了至少80％的细胞病变后，不进行事先的离心处理，使用同一批的冷冻于-80℃的病毒，其中所述离心处理去除接种物中大部分的细胞碎片；实际上，当在细胞外时，病毒的传染性很快消失，因此当使用同一批病毒时，其结果便更接近于实际的体内感染，其中在同一批病毒中，能够在细胞碎片中发现病毒粒子。
将该批分配为整份的0.5ml后，保持在-80℃，在人纤维原细胞上滴定：
--将1份稀释为10份(By dilution of 1 in 10)，稀释接种8个培养管：10⁶ml；和
在陪替氏培养皿(35mm)中接种培养物，向上清液中加入抗HSV1血清以中和可能释放进入液体培养基中的病毒粒子，因此能够计数区域(zones)：每个培养皿具有100-150个单元性成区域，其中所述培养皿是以0.5ml稀释至10^-4的病毒溶液进行接种。
细胞毒性检查在测试中所用的细胞培养物的产品上进行，也就是所说的人纤维原细胞。
在富含10％胎牛血清的Dulbecco培养基上培育细胞；使用时，采用不含小牛血清的同样的培养基来洗涤细胞。
对于每个测试的产品或每种组合物，使用10试管的细胞培养物，接种产品后，对试管继续观察3天。
观察到的各种产品的作用
按顺序，每种产品使用纯的并稀释至10^-1，10^-2，10^-3加入培养管中，该1ml的管中含有体积为0.1ml的营养培养基。
结果
Bardac0.04％溶液：在稀释至10^-3没有毒性
二葡萄糖酸氯己定，0.05％溶液：没有毒性。
观察到的即时杀病毒作用
活性测定：将0.2ml病毒悬浮液与0.2ml测试化合物的稀释溶液中的一种混合。然后立即取出0.2ml混合物稀释至比率为10^-4的从而中止产品的活性。然后取体积为1ml的混合物稀释液沉积于在直径为6cm的陪替氏培养皿上培育的非洲绿猴肾细胞层上。
吸附1小时后，倾倒出上清液体，加入5ml的培养基，该培养基中不含有动物血清，但加入了1％的I型抗疱疹型多克隆兔血清。
在感染的细胞破坏过程中其不影响细胞间病毒的增殖但中和了进入液相的粒子；4-5天后，裸眼可观察到细胞裂解的区域，其延伸类似油点，每个点理论上相当于存在于病毒稀释液的“区域形成单元”(UFP)的增殖，该稀释液沉积于培养物上。区域形成单元可粗略估计，相当于感染粒子或病毒粒子。
表IV第4天每毫升稀释至10^-4的病毒区域形成单元数目(在三个培养物皿上进行的滴定)
  Bardac0.02％Bardac0.02％+二葡萄糖酸盐0.025％10^-4，10^-5，10^-6的对照病毒  30/125/4517/26/161/223/51  BardacBardac+二葡萄糖酸盐0.05％  10^-6的对照病毒  26/17/209/6/8  14/32/30
活性出现的时间
0.2ml未稀释的病毒悬浮液与0.2ml下列两种混合物的每种混合：
0.04％Bardac+0.05％CHG(二葡萄糖酸盐)
0.02％Bardac+0.025CHG
培育1、5和15分钟后，将一滴混合物接种入5个培养管，观察5天。
作为对照，稀释的病毒以同样的方式接种入培养基而非混合物中。
表V所述两种混合物5个试管在第2天观察到的结果
病毒+混合物    细胞病变结果(在第2天)    对照病毒
2/5            1分钟                    5/5
0/5            5分钟                    5/5
0/5            15分钟                   5/5
体内测试
对裸鼠进行测试，该裸鼠以病毒悬浮液浸渍过的针进行肌肉注射，或用感染的针(也就是在病毒悬液中浸渍过的针)穿过微囊体后注射，如下所述，该微囊体包覆有乳胶(实施例8，样品1)，针穿过微囊体能够有足够多的、迅速的感染动物的量。
操作过程类似于实施例8，但培养基必须对疱疹病毒适合。
实施例4-组合物的杀菌作用
测试I
材料
·测试的微生物
参考菌株
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CIP A22
大肠埃希菌(Escherichia coli)CIP 54127
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CIP5314Oxford菌株
医院菌株(hospital strains)
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
大肠埃希菌(Escherichia coli)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
普通变形菌(Proteus vulgaris)
白色念珠菌(Candida albicans)
·Millipore薄膜：HAE P047SO(0.45μm)
·Mueller Hinton 2琼酯糖：43301(Biomerieux)
·无菌和非高热(apyrogenic)蒸馏水(biosedra)
步骤
菌株的维护
使用前，对每个细菌菌株在Meuller Hinton琼酯糖上以24小时的间隔进行三次传代培养。
细菌接种体的制备
·初始细菌悬浮液：A
以细菌分离物为基础进行制备，其必须符合浑浊度(opacity)，相当于McFarland天平上的点1。其被用于最后的测试。
·用于对照和预测试的悬液：B
由悬液A连续稀释至10^-6制备得到。
对照组
用Mueller Hinton琼酯糖将1ml悬浮液B“一同”种入。
对照过滤计数
用Millipore薄膜过滤1ml悬液B，然后用50ml蒸馏水洗涤。
在37℃、24小时后，计数菌落。
预测试
对四个杀菌混合物的每种以及每个细菌菌株进行下列测试：
·过滤1ml杀菌混合物
·洗涤(用50ml蒸馏水洗2次)
·过滤1ml悬浮液B
·用50ml蒸馏水浸涤
·在37℃、24小时后，计数菌落。
最后的测试
每种杀菌混合物以双浓度(double concentration)放置1、5和10分钟，与1ml悬浮液A接触，然后过滤。
进行预测试所定义的洗涤步骤后，将膜于37℃放置25小时。
结果解释
在该过程中，如果接触特定时间后，该混合物至少减少了5个对数的细菌接种体，则可认为该混合物能用作杀菌剂。
在最后的测试薄膜上，通过与同样菌株、同样混合物在预测试种的计数结果进行比较可观察到这种效果。
结果
                表VI组合物在t＝1分钟时的功效
菌株                    混合物No.1            混合物No.2
                        Bardac4％           Bardac0.04g/100ml
                                              二葡萄糖酸盐0.05g/100ml
S.aureus CIP 53154      E                     E
E.coli CIP 54127        E                     E
P.aeruginosa CPI A22    E                     E
S.aureus                E                     E
E.coli                  E                     E
P.aeruginosa            NE                    E
P.vulgaris              NE                    NE
C.albicans              E                     E
E或NE(有效或无效)
                   表VII组合物在t＝5分钟的功效
菌株                    混合物No.1            混合物No.2
                        Bardac4％           Bardac0.04g/100ml
                                              二葡萄糖酸盐0.05g/100ml
S.aureus CIP 53154      E                     E
E.coli CIP 54127        E                     E
P.aeruginosa CPI A22    E                     E
S.aureus                E                     E
E.coli                  E                     E
P.aeruginosa            NE                    E
P.vulgaris              NE                    NE
C.albicans              E                     E
E或NE(有效或无效)
                    表VIII组合物在t＝10分钟的功效
菌株                    混合物No.1             混合物No.2
                        Bardac4％            Bardac0.04g/100ml
                                               二葡萄糖酸盐0.05g/100ml
S.aureus CIP 53154      E                      E
E.coli CIP 54127        E                      E
P.aeruginosa CPI A22    E                      E
S.aureus                E                      E
E.coli                  E                      E
P.aeruginosa            E                      E
P.vulgaris              E                      E
C.albicans              E                      E
E或NE(有效或无效)
结论
接触1分钟后，没有混合物在所有的菌株上有效。但混合物No.2时最有效的，这是因为只有一个乎不敏感。
接触5分钟后，如果不是同一菌株--普通变形菌(Proteus vulgari)即使在5分钟后对产品仍有抗性，则可认为混合物No.2在所有的菌株上都有效。
接触10分钟后，混合物No.1和No.2在所有的菌株上得到满意的结果。
测试2
在下列溶液的基础上进行另一个测试
--0.1％的二葡萄糖酸氯己定溶液100ml(pH6)；
--0.1％的Bardac22溶液100ml。
特别测定了上述溶液单独或结合对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538、大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC 11229和白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 10231的活性。
根据Tichtlinien fur die Prufung und Bewertung chemischerDesinfektionsverfahren der DGHM/Guidelines for Testing and EvaluatingChemical Disinfection Processes of DGHM as at 1.1.，1981的第I章/2.1和2.2描述的步骤测试。
表IX，X和XI分别说明了二葡萄糖酸氯己定0.1％水溶液、Bardac220.1％水溶液以及两种化合物的等量混合物的抗细菌活性和抗真菌活性。这些表格所显示结果包括在37℃培育72小时，并采用下列灭活的物质作为对比：
A：3％Tween80+0.3％卵磷脂+0.1％半胱氨酸，
B：3％Tween80+3％皂角苷+0.1％半胱氨酸+0.1％组氨酸；
C：3％Tween80+0.3％卵磷脂+0.1％组氨酸+0.5％硫代硫酸钠。
在这些表格中，符号“+”表示生长增加，“-”表示没有生长。
下表IX显示了二葡萄糖酸氯己定0.1％水溶液(1％测试溶液对应于0.001％二葡萄糖酸盐)的抗细菌活性和抗真菌活性，其显示：0.5％的二葡萄糖酸氯己定稀释液对S.aureus和E.coli具有生长抑制，该浓度相当于0.0005％活性物质的浓度；所述溶液(0.001％二葡萄糖酸氯己定)的1％稀释液抑制了C.albicans。在表X，二癸基二甲基氯化铵的0.1％稀释液(＝0.0001％二癸基二甲基氯化铵)更显著的抑制了革兰氏阳性菌S.aureus和C.albicans，E.coli，其0.5％的稀释液(＝0.0005％二癸基二甲基氯化铵)抑制了E.coli(革兰氏阴性菌)。
表X.
表XI显示这两种杀菌剂的组合能够在更高稀释度的情况下显著抑制前述微生物(根据0.00025％二葡萄糖酸氯己定和0.00025％二癸基二甲基氯化铵对E.coli和C.albicans的反应；根据上述两种杀菌剂在0.00005％浓度时对S.aureus的反应)。
表IX单独的二葡萄糖酸氯己定(1％溶液→0.001％二葡萄糖酸盐)
测试菌株      S.aureus              E.colli               Candida albicans
              ATCC 6538             ATCC 11229            ATCC 1031
浓度％        not    A    B    C    not    A    B    C    not    A    B    C
(体积/体积)
1.0           -      +    +    +    -      +    +    +    -      +    +    +
0.5           -      +    +    +    -      +    +    +    +      +    +    +
0.1           +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.05          +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.025         +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.0125        +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.00625       +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
表X单独的Bardac22(1％溶液→0.001％Bardac22)
测试菌株     S.aureus              E.colli               Candida albicans
             ATCC 6538             ATCC 11229            ATCC 1031
浓度％       not    A    B    C    not    A    B    C    not    A    B    C
(体积/体积)
1.0          -      +    +    +    -      +    +    +    -      +    +    +
0.5          -      +    +    +    -      +    +    +    -      +    +    +
0.1          -      +    +    +    +      +    +    +    -      +    +    +
0.05         +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.025        +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.0125       +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.00625      +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
                          表XI本发明组合物
            (2％溶液→0.001％Bardac22和0.001％CHG)
测试菌株     S.aureus              E.colli               Candida albicans
             ATCC 6538             ATCC 11229            ATCC 1031
浓度％       not    A    B    C    not    A    B    C    not    A    B    C
(体积/体积)
2.0          -      +    +    +    -      +    +    +    -      +    +    +
1.0          -      +    +    +    -      +    +    +    -      +    +    +
0.5          -      +    +    +    -      +    +    +    -      +    +    +
0.1          -      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.05         +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.025        +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.0125       +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
0.00625      +      +    +    +    +      +    +    +    +      +    +    +
表XII，XIII和XV所列结果的实验是采取下述方法进行的：利用在37℃下传代培养72小时的温育物进行测试，在反应温度22℃下采用下述成分作为灭活物质：3％Tween80+3％皂角苷+0.1％半胱氨酸+0.1％组氨酸；这些表格分别阐述了0.1％二葡萄糖酸氯己定水溶液、0.1％Bardac水溶液、以及这两种化合物的等份混合物的抗细菌和抗真菌活性，并且说明了前述杀菌剂的反应是作为接触时间的函数，并且出现了与上述联合应用相同的协同效应。两种化合物的联合应用就能够显著地降低达到相同效果的浓度。
                           表XII(CHG本身)
菌株    S.aureus ATCC 6538    E.coli ATCC 11229    C.albicans ATCC 1031
        微生物/ml             微生物/ml            微生物/ml
        8×10⁸               2×10⁹              8×10⁷
                              感染时间(分钟)
浓度％
(体积/  1  3  5  15  30  60  1  3  5  15  30  60  1  3  5  15  30  60
体积)
25      +  +  +  +   -   -   +  +  +  -   -   -   +  +  +   -  -   -
10      +  +  +  +   +   -   +  +  +  -   -   -   +  +  +   +  -   -
5       +  +  +  +   +   +   +  +  +  +   -   -   +  +  +   +  -   -
1       +  +  +  +   +   +   +  +  +  +   +   +   +  +  +   +  +   -
0.5     +  +  +  +   +   +   +  +  +  +   +   +   +  +  +   +  +   +
0.1     +  +  +  +   +   +   +  +  +  +   +   +   +  +  +   +  +   +
0.05    +  +  +  +   +   +   +  +  +  +   +   +   +  +  +   +  +   +
                             表XIII(Bardac本身)
菌株    S.aureus ATCC 6538    E.coli ATCC 11229    C.albicans ATCC 1031
        微生物/ml             微生物/ml            微生物/ml
        8×10⁸               2×10⁹              8×10⁷
                             感染时间(分钟)
浓度％
(体积/  1  3  5  15  30  60  1  3  5   15   30   60   1  3  5  15  30  60
体积)
25      +  -  -  -   -   -   -  -  -   -    -    -    -  -  -  -   -   -
10      +  -  -  -   -   -   +  +  -   -    -    -    -  -  -  -   -   -
5       +  +  +  -   -   -   +  +  +   -    -    -    +  +  -  -   -   -
1       +  +  +  +   -   -   +  +  +   +    +    +    +  +  +  +   -   -
0.5     +  +  +  +   +   +   +  +  +   +    +    +    +  +  +  +   +   +
0.1     +  +  +  +   +   +   +  +  +   +    +    +    +  +  +  +   +   +
0.05    +  +  +  +   +   +   +  +  +   +    +    +    +  +  +  +   +   +
                             表XIV(本发明组合物)
菌株    S.aureus ATCC 6538    E.coli ATCC 11229    C.albicans ATCC 1031
        微生物/ml             微生物/ml            微生物/ml
        8×10⁸               2×10⁹              8×10⁷
                             感染时间(分钟)
浓度
(体积/  1  3  5  15  30  60  1    3    5    15   30   60   1    3    5    15  30  60
体积)
25      +  -  -  -   -   -   -    -    -    -    -    -    +    -    -    -   -   -
10      +  +  +  -   -   -   -    -    -    -    -    -    +    -    -    -   -   -
5       +  +  +  +   -   -   +    -    -    -    -    -    +    +    +    -   -   -
1       +  +  +  +   +   +   +    +    +    +    -    -    +    +    +    +   +   +
0.5     +  +  +  +   +   +   +    +    +    +    +    +    +    +    +    +   +   +
0.1     +  +  +  +   +   +   +    +    +    +    +    +    +    +    +    +   +   +
0.05    +  +  +  +   +   +   +    +    +    +    +    +    +    +    +    +   +   +
实施例5-杀精子反应
步骤
从健康的志愿者获得各种精液样品(每个样品一滴精液)。
活力测定
用曙红-尼格罗黑(eosine-nigrosine)处理一滴精液。然后制备涂片，用显微镜检查100个游动精子。死精子全部或部分是红色的，活精子是无色的。
研究的物质
研究的物质是Bardac和二葡萄糖酸氯己定，单独测试以及根据本发明联合测试。各种步骤的阶段见表XV-XVII。
各种物质与精液的最大接触时间限制为3分钟，以保证在使用条件下的方法的有效性。精液中活性溶液的浓度限制为10％以减少产品对粘膜层的毒性。
                            表XV
                         物质与精液的接触时间
                         1分钟                     3分钟
             Bardac      精液中的溶液浓度
在TO的对照   活性物质的
             溶液浓度    5％          10％         5％         10％
82.8±7.1    0.4％       10.7±7.6    5±6.4       0.8±1.2    0.8±1
81.4±5.9    0.6％       10.5±9.7    9.2±12.9    2.2±4.5    0.4±0.9
81.4±5.9    0.8％       9.7±10.2    1.8±2.5     0           0
79.7±5.3    1％         0            0            0           0
                            表XVI
                             物质与精液的接触时间
                             1分钟                    3分钟
Chlorohexidine Digluconate   精液中的溶液浓度
在TO的对照     活性物质的
               溶液浓度      5％         10％         5％        10％
98±6.2％      0.5％         77±10.8    77.2±5.6    78±5.7    75.5±4.8
                            表XVII
                                     物质与精液的接触时间
                                        1分钟                     3分钟
Bardac+Chlorohexidine digluconate       精液中的溶液浓度
在TO的对照        活性物质的溶液浓度    5％          10％         5％          10％
88.4±5.4％       B0.4％+DC0.5％        15.6±13.2   5.1±8       8.6±10.8    2.4±4.1
                  B0.4％+DC0.8％        21.3±14     6.7±3       18.3±13.3   6.3±7.8
                  B0.4％+DC1％          19±11.1     10±8.7      16±9.8      9.3±11.9
                  B0.6％+DC0.5％        6.3±11      4±6.9       1.3±2.3     1±1.7
                  B0.8％+DC0.5％        3.7±6.3     0            2±3.5       0
实施例6-对Bardac22和二葡萄糖酸氯己定混合物水溶液的研究
在室温(20℃±1C)下，在远离光线的塑料瓶中制备所有的混合物，以重量/重量百分比表示。
每天观察这些塑料瓶能够监测是否出现了白色沉淀。白色沉淀大部分会在瓶子的残余物上发现(当其形成时)，在液体湿润的瓶壁上也会有。
不同浓度的Bardac-氯己定50/50溶液的研究
在第一阶段，在活性组分不同浓度的水溶液对两种活性组分(Bardac和二葡萄糖酸氯己定)的等份混合物(50/50)进行研究：
活性组分30％溶液-24小时出现沉淀
活性组分20％溶液-24小时出现沉淀
活性组分10％溶液-24小时出现沉淀
活性组分5％溶液-24小时出现沉淀
活性组分1％溶液-24小时出现沉淀
不等份的Bardac和氯己定10％和20％溶液的研究
在第二步，活性组分的浓度定于10％和20％，但两种活性组分不等份。
             表XVIII活性组分10％溶液的概括表
二葡萄糖酸氯己定                          Bardac
                  二葡萄糖酸氯己定(％)               备注
/Bardac的比例                           (％)
0.5/99.5          0.05                    9.95       无沉淀
1/99              0.1                     9.9        无沉淀
2/98              0.2                     9.8        无沉淀
4/96              0.4                     9.6        无沉淀
8/92              0.8                     9.2        无沉淀
16/84             1.6                     8.4        无沉淀
25/75             2.5                     7.5        2个月出现沉淀
35/65             3.5                     6.5        9天出现沉淀
40/60             4.0                     6.4        6天出现沉淀
50/50             5.0                     5.0        24小时出现沉淀
            表XIX活性组分20％溶液的概括表
二葡萄糖酸氯己定                         Bardac
                  二葡萄糖酸氯己定(％)               备注
/Bardac的比例                          (％)
0.5/99.5          0.1                    19.9        无沉淀
1/99              0.2                    19.8        无沉淀
2/98              0.4                    19.6        无沉淀
4/96              0.8                    19.2        无沉淀
8/92              1.6                    18.4        无沉淀
3.2               16.8                   8.4         无沉淀
25/75             5.0                    15.0        2个月出现沉淀
35/65             7.0                    13.0        9天出现沉淀
40/60             8.0                    12.0        6天出现沉淀
50/50             10.0                   10.0        24小时出现沉淀
实施例7-对Bardac22二葡萄糖酸氯己定混合物的醇溶液的研究
当两种产品是甘油溶液时，以水表示的溶解比例是相同的。
实施例8-含有本发明的组合物并包覆聚乙烯外壳的微囊体在所述组织被针刺穿后对细菌和真菌的杀菌能力的研究。
材料和方法
包覆聚乙烯或乳胶外壳的两个微囊体样品中含有：
样品1：含有本发明组合物并包覆PVDC的微囊体。包覆微囊体的外壳的厚度约为500μm，外壳的总厚度约1300μm，外壳被针(0.5×16mm)刺穿后，杀菌剂的可用量是约1.5μg；
样品2：含有本发明一致的I型组合物的微囊体并包覆于EVA中。包覆微囊体外壳的厚度约为500μm，外壳被针(0.5×16mm)刺穿后，杀菌剂的可用量是约0.4μg。
用下列微生物制备测试的微生物样品：大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC 11229，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538和白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 10231。
在37C下，在CSL培养基(Merck)中培育菌株24小时，然后在0.9％氯化钠溶液中制备10^-3-10^-6的稀释液。
将获得的各种培养物1ml(稀释或未稀释)加入至盛有9ml灭活人血清的池(pool)中。每毫升测试溶液的微生物数目见表XX。
使用三种类型的针：0.7×30mm(22G×1/4”，Terumo)，0.5×16mm(25G×5/8”，Terumo)，0.3×13mm(30G×1/2”，Microlance，Becton Dickinson)。
针固定于1ml的注射器上，在上述微生物溶液中浸渍(至少1cm的针浸渍在溶液中)，吸入0.1ml溶液。然后用针刺入上述外壳，该外壳放置于以casoagar(Merck，添加了3％的Tween80和0.3％卵磷脂的培养基)覆盖的陪替氏培养皿上。
标记用针接种琼脂的位置，然后在读取结果前，在37℃下培育培养物介质72小时。
结果
表XX是用0.3×13mm的针(30G×1/2”，Microlance，Becton Dickinson)穿孔的阳性培养物的数目(每个实验5次穿孔)，在如上所述进行添加的casoagar培养基(Merk)上穿孔外壳的培养物的数目。
              表XX穿孔后获得阳性培养物的数目
              样品1               样品2
微生物溶液    微囊体    对照品    微囊体    对照品
E.coli
3×10⁸/ml     +----     ++++-     +++--     +++++
2×10²/ml     -----     -----     -----     -----
10²/ml        -----     -----     -----     -----
S.aureus
2×10⁸/ml     +++--     +++++     +++++     +++++
2×10⁵/ml     -----     -----     -----     -----
10²/ml        -----     -----     -----     -----
C.albicans
3×10⁷/ml     -----     +----     ++---     ++---
3×10⁵/ml     -----     -----     -----     -----
10²/ml        -----     -----     -----     -----
+微生物生长-没有生长
这些结果具体表明，低浓度的细菌或真菌(10²/ml)可被吸收或被聚乙烯外壳机械地除去；当使用最小的针时(0.3×13mm，表XX)，每毫升10⁵微生物浓度可以认为是不产生生长的限制浓度；另一方面，分别用0.7×30mm和0.5×16mm的针，获得相同顺序的结果。如果只是对照品外壳穿孔(样品1)，则只有高浓度的细菌(10⁸/ml)或真菌(10⁷/ml)获得生长。
这些结果表明样品1的微囊体(PVDC)比样品2的微囊体(EVA)更有效。
结论
样品1的测试表明加入微囊体的本发明组合物的瞬时杀菌剂达到了在类似于医院条件下所起到的效果。
实施例9-化合物对红细胞溶血的作用
以分光光度计法监测化合物对肝素化的全血中的体外红细胞溶血的作用。
向肝素化的牛血中加入各种浓度和制剂的化合物，在1.5ml的微型离心试管中轻柔混合。在37℃下培育样品1小时。培育结束后，从恒温箱中移出样品，在2000rpm离心5分钟。从样品中将200μl的整份上清液移入96孔的微量滴定板，在413nm读数。测试样品的吸光率与含有磷酸缓冲盐水的对照品比较，pH7.2。测试样品的吸光率读数高于对照样品被认为是溶血的。
表XXI归纳了在测试条件下非溶血的测试化合物组分和浓度。
表XXI非溶血测试化合物
测试化合物组分未观察到溶血的浓度Bardac22葡萄糖酸氯己定(chlorohexidine gluconate)0.0125％0.0125％Bardac22葡萄糖酸氯己定十烃碘铵(decamethonium iodide)0.0125％0.0125％0.0125％Bardac22葡萄糖酸氯己定Tergitol NP-90.001％0.001％0.001％Bardac22葡萄糖酸氯己定六甲溴胺(hexamethonium bromide)0.0125％0.0125％0.0125％Bardac22葡萄糖酸氯己定磷酸三正丁基酯0.0005％0.0005％0.0005％
尽管本发明以具体优选的实施例描述，但不限于这些实施例。本领域的技术人员可以实施包含在本发明内的替换实施方案、实施例和改进，尤其是根据前述的那些描述。