水性持续释放蛋白质制剂.pdf

本发明涉及含有羧甲基醚纤维素聚合物的持续释放治疗性蛋白质药物制剂，其制备方法及应用。

1.  一种药物制剂，包含：
a)一种药物活性量的促红细胞生成素；
b)一种药物可接受的pH缓冲剂，使pH保持在大约6～大约9之间；
c)一种等渗剂，浓度为大约0～大约200毫摩尔；和
d)羧甲基醚纤维素钠，浓度为总配方重量的大约0.5％～大约7％，所述羧甲基醚纤维素钠的分子量为大约50,000道尔顿～大约1,000,000道尔顿。

2.  根据权利要求1的制剂，其中促红细胞生成素选自重组人类促红细胞生成素、EPOα、EPOω、darbepoetinα和PEG偶联促红细胞生成素。

3.  根据权利要求1的制剂，其中pH缓冲剂的浓度为大约10mM～大约30mM，并且其中pH缓冲剂为磷酸氢钠/磷酸二氢钠缓冲体系。

4.  根据权利要求1的制剂，其中等渗剂选自氯化钠、氯化钾和甘氨酸。

5.  根据权利要求1的制剂，其中等渗剂为氯化钠，并且氯化钠浓度为大约75mM～大约125mM。

6.  根据权利要求1的制剂，其中制剂的pH值为大约6.5～大约7.4。

7.  一种治疗需要接受此种治疗的目标物的方法，包括给目标物施以根据权利要求1的药物制剂。

8.  根据权利要求7的方法，其中药物制剂依据施药方法以每两个星期三次、每星期一次、每两个星期一次、每三个星期一次、每月一次、每五个星期一次或每六个星期一次施用。

9.  根据权利要求8的方法，其中促红细胞生成素的有效日服剂量为大约4000～大约9000I.U。

10.  根据权利要求9的方法，其中促红细胞生成素的有效日服剂量大于10,000I.U。

11.  一种配制方法，包括以任何顺序的下列步骤：
a)提供一种pH缓冲的促红细胞生成素样品；
b)将一定量的羧甲基醚纤维素钠与pH缓冲的促红细胞生成素样品混合，羧甲基醚纤维素钠的量足以提供最终浓度为总配方重量的大约0.5％～大约7％；
c)将一定量的氯化钠与pH缓冲的促红细胞生成素样品混合，氯化钠的量足以提供最终浓度为大约0mM～大约170mM；和
d)用水调节pH缓冲的促红细胞生成素样品，足以提供预定的最终制剂体积和促红细胞生成素效能。

12.  一种药物制剂，包含：
a)一种药物活性量的蛋白质；
b)一种药物可接受的pH缓冲剂，使pH保持在大约4.5～大约9之间；
c)一种等渗剂，浓度为大约0～大约200毫摩尔；和
d)羧甲基醚纤维素钠，浓度为总配方重量的大约0.5％～大约7％，所述羧甲基醚纤维素钠的分子量为大约50,000道尔顿～大约1,000,000道尔顿。

13.  根据权利要求12的制剂，其中蛋白质选自：胰岛素、促胃动素、胃泌素、促乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素(GH)、角质细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素、骨原生成素(OPG)、肥胖蛋白(OB蛋白)、leptin、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白细胞介素2、成纤维细胞生长因子(FGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、集落刺激生长因子(CSFs)、肿瘤坏死因子(TNF)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜生长激素(HCG)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT 3)、神经营养因子4(NT 4)、脑神经营养因子(BDNT)、胶质细胞系神经营养因子(GDNF)、血小板生长因子(PGDF)、内皮血管生长因子(VEGF)、骨形成蛋白(BMP)、巨核细胞生长分化因子(MGDF)、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、超氧化物歧化酶(SOD)、组织血浆酶原活化剂(TPA)、尿激酶、溶栓酶、激肽释放酶、α-牛乳糖、胰腺核糖核酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、白细胞介素-2受体拮抗剂(IL-Ira)、Infliximab、抗体和etanercept。

14.  根据权利要求12的制剂，其中pH缓冲剂的浓度为大约10mM～大约30mM，并且其中pH缓冲剂为磷酸氢钠/磷酸二氢钠缓冲体系。

15.  根据权利要求12的制剂，其中等渗剂选自氯化钠、氯化钾和甘氨酸。

16.  根据权利要求12的制剂，其中等渗剂为氯化钠，并且氯化钠浓度为大约75mM～大约125mM。

17.  根据权利要求12的制剂，其中制剂的pH值为大约6.5～大约7.4。

18.  一种治疗目标物的方法，包括给目标物施以根据权利要求12的药物制剂。

19.  根据权利要求18的方法，其中药物制剂依据施药方法以每两个星期三次、每星期一次、每两个星期一次、每三个星期一次、每月一次、每五个星期一次或每六个星期一次施用。

水性持续释放蛋白质制剂
发明领域
本发明提供了含有羧甲基醚纤维素聚合物的水性持续释放治疗性蛋白质药物制剂及其制备方法。本发明也提供了使用此种药物制剂的方法，体现出了许多新的优势，包括更好的疗效、安全性、患者的便利性以及患者的适用性。
发明背景
由于近来在遗传和细胞工程技术方面的进步，现在能够大量地生产那些在体内表现出各种药理作用的蛋白质以用于药物领域。蛋白质治疗发展的一个主要限制因素是稳定的蛋白质药物制剂的制备。因为，具有活性的蛋白质在体内的半衰期一般都很短，而口服的生物可利用性能则微乎其微，所以，典型地，用常见注射的方法完成治疗性蛋白质的施药，这样就会给患者带来很大的身体负担，同时也增加了治疗费用。因此，当前科研工作者在开发和评价持续释放制剂方面投入了大的兴趣。高效的持续释放制剂能够提供一种控制血液中活性组分的含量的方法，同时也提供了更好的疗效、安全性、患者的便利性以及患者的适用性。
至今，主要有两种方法制备可持续释放的治疗性蛋白质：1)通过修饰蛋白质来延长其半衰期，典型地，通过降低清除率；和2)制备封入聚合物微球体中的持续释放的蛋白质制剂。制备持续释放制剂的优点在于，此种制剂在理论上能够被用于多种蛋白质治疗药物。
PCT公开专利WO 99/15154(Tracy等人)、美国专利5,674,534和5,716,644(均为Zale等人)、PCT公开专利WO 96/40073(Zale等人)和PCT公开专利WO 00/38651(Shah等人)中描述了聚合物微球体持续释放制剂的例子。
美国专利5,674,534、5,716,644和PCT公开专利WO 96/40073中描述了一种含有促红细胞生成素颗粒的聚合物基体，其对盐呈抗聚集稳定。
不幸的是，大多数蛋白质的不稳定性(例如，遇热、有机溶剂等发生变性，并失去生物活性)极大地限制了对持续释放制剂的开发和评价。此外，由于蛋白质的生化变异性，极大地影响了任何蛋白质对生产微球体所需条件的耐受性，所以，这些技术的应用远没有预想的那样广泛。
PCT公开专利WO 00/38651描述了一种在聚合物基体中包含有蛋白质的药物组合物，其具有热和pH敏感的凝胶/反凝胶特性。在制备这些制剂时，可以无需将其暴露在热或有机溶剂中，但是其特征是使用改性水凝胶。热稳定水凝胶的使用受限于其制备的困难性，所以，现在没有市售的此类产品。这种改性水凝胶的另一个令人不可接受的特性是其生物相容性和免疫原性能差。
A.L.Finkenaur公开的美国专利4,717,717描述了通过加入纤维素聚合物，使表皮生长因子组合物具有抗失去生物活性的稳定特性。其中没有此种制剂具有体内持续释放特性的描述。
Cini等人公开的美国专利5,457,093描述了含有在眼科和局部使用的生长因子的凝胶制剂。但是其中没有将这些制剂用于肠胃外给药的描述，也没有任何关于这些制剂具有体内持续释放特性的建议。
因此，仍然需要一种既能够容易生产、且提高了其所含活性蛋白质组分稳定性的肠胃外持续释放促红细胞生成素制剂。
发明概述
本发明提供了一种制备用于肠胃外给药的水性持续释放治疗性蛋白质药物制剂的方法。同时，本发明也提供了含蛋白质的通用的肠胃外给药的药物制剂，包含：
a)一种药物活性量的蛋白质；
b)一种药物可接受的pH缓冲剂，使pH保持在大约4.5～大约9之间。
c)一种等渗剂(tonicity agent)，浓度为大约0～大约125毫摩尔；和
d)羧甲基醚纤维素钠，浓度为总配方重量的大约0.5％～大约7％，
其中水性制剂的pH为大约4.5～大约9。
本发明的优选制剂提供了一种促红细胞生成素的药物制剂，含有：
a)一种药物活性量的促红细胞生成素；
b)一种药物可接受的pH缓冲剂，使pH保持在大约6～大约9之间。
c)一种等渗剂，浓度为大约0～大约200毫摩尔；和
d)羧甲基醚纤维素钠(CMC)，浓度为总配方重量的大约0.5％～大约7％，所述的羧甲基醚纤维素钠的分子量为大约50,000道尔顿～大约1,000,000道尔顿。
其中，制剂的pH值为大约6.3～大约8.3。
本发明同时还提供了一种制备水性持续释放促红细胞生成素药物制剂的方法，包括将羧甲基醚纤维素钠聚合物地水溶液与一种药物活性量的促红细胞生成素混合。本发明的制剂所使用的羧甲基醚纤维素钠聚合物主要是以溶液的状态而非微颗粒的状态存在。
本发明同时还提供了使用这些持续释放制剂的方法，包括用药法，其中，此制剂的给药间隔范围很宽，包括但并未限于下列间隔，每两个星期三次、每星期一次、每两个星期一次、每三个星期一次、每月一次、每五个星期一次、每六个星期一次或任何其他适合于特定患者的时间间隔或这些时间间隔的组合。
附图1：平均血浆EPOα浓度与时间的关系所说明的持续释放制剂CMC-1、CMC-2、CMC-3和CMC-4的药代动力学。
附图2：网织红血球的变化％与时间的关系所说明的持续释放制剂CMC-1、CMC-2、CMC-3和CMC-4的药效学。
附图3：血红蛋白量的变化与时间的关系所说明的持续释放制剂CMC-1、CMC-2、CMC-3和CMC-4的药效学。
附图4：红血球数量的变化与时间的关系所说明的持续释放制剂CMC-1、CMC-2、CMC-3和CMC-4的药效学。
附图5：平均血浆EPOα浓度与时间的关系所说明的临床批量CMC-EPO的药代动力学。
附图6：网织红血球的变化％与时间的关系所说明的临床批量CMC-EPO的药效学。
附图7：血红蛋白量的变化与时间的关系所说明的临床批量CMC-EPO的药效学。
附图8：红血球数量的变化与时间的关系所说明的临床批量CMC-EPO的药效学。
在本文中“促红细胞生成素”或“EPO”应该包括那些具有生物活性的重组人类促红细胞生成素(rhEPO)、促红细胞生成素类似物、促红细胞生成素同型物、促红细胞生成素模拟物、促红细胞生成素片断、杂合促红细胞生成素蛋白质、融合蛋白质寡聚物和上述物质的多聚体、上述物质的同系物、上述物质的糖基化修饰变异物、上述物质的突变体的多肽和蛋白质，不管它们的生物活性以及它们的合成和制备方法，包括，但并未局限于重组(无论是由互补DNA还是基因组DNA)、合成、转基因以及基因活化法。促红细胞生成素的具体例子包括EPO α(EPREX、ERYPO、PROCRIT)、新型红细胞生成促进蛋白质(NESP^TM、ARANESP^TM、darbepoteinα)，如欧洲专利申请EP640619中所描述的重组人类促红细胞生成素(EPO)的超糖基化类似物、人类促红细胞生成素类似物(如国际专利申请WO 9966054中描述的人类血清白蛋白融合蛋白质)、国际专利申请WO 9938890中描述的促红细胞生成素突变体、促红细胞生成素ω(可以由美国专利5,688,679中描述的Apa I人类促红细胞生成素基因的限制片段制得)、国际专利申请WO 9911781和EP1064951中描述的糖基化修饰人类促红细胞生成素、国际专利申请WO 9805363和美国专利5,643,575中描述的PEG偶联促红细胞生成素类似物。国际专利申请WO 9905268和WO 9412650中描述了修饰表达内生人类促红细胞生成素的细胞系的具体例子。通常，优选的EPO形式为纯化的重组人类EPO(rhEPO)，现在制造和经销的商标牌号有EPREX、ERYPO、PROCRIT或ARANESP^TM。
在本文中，术语“蛋白质”包括肽、多肽、consensus分子、或它们的类似物、衍生物或组合。术语“蛋白质”包括含有修饰氨基酸和糖蛋白的多肽序列，或含有至少一个带碳水化合物部分的丝氨酸、苏氨酸或精氨酸侧链的蛋白质。同时也包括那些带有依据酸度、电荷、疏水性、极性、大小或其他为本领域的技术人员所熟知的特性而“保守性”的氨基酸取代的多肽。通常见于Creighton编著的蛋白质，W.H.Freeman and Company，纽约(1984)pp.498。一般情况下，可以对选定的氨基酸做一些改变，只要这些改变能够保持蛋白质的总体生物活性。也可以存在一个小氨基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸或丝氨酸残基，一个最多20～25个残基的小连接物肽，或一个利于纯化的小延伸，如多组氨酸束，一个抗原决定基或一个结合功能域。通常见于Ford等人编著蛋白质表达和纯化(1991)2：95-107。多肽或它们的类似物也可以含有一个或多个氨基酸类似物，如拟肽物。一个对本领域熟知的技术人员将会很容易地将一种期望的蛋白质活性组分修饰应用于本发明的组合物。
在本文中，术语“实验目标物”指被处理、观察或实验的目标物，优选地，为哺乳动物，最优选地为人体。
在本发明的制剂中所使用的蛋白质的量依据蛋白质的生物效能以及期望的制剂效能将会各不相同，但是通常情况下，每一制剂所含蛋白质的量为大约1μg/ml～大约2000μg/ml。特别地，本发明中含促红细胞生成素的制剂可以含有“药物活性量的促红细胞生成素”，通常为大约1000IU/ml～大约180,000IU/ml的促红细胞生成素，其中120,000IU大约相当于1000μg。促红细胞生成素可以以一种将本发明制剂稀释的水溶液的形式提供，或者以一种在使用适当量的水性制剂后能够重构的干燥试剂的形式提供。干燥试剂包括，例如，冷冻干燥或喷雾干燥促红细胞生成素。当高效能制剂(例如，高于100,000IU/ml)中的促红细胞生成素以一种本体试剂的形式提供时，优选地，促红细胞生成素本体试剂溶解在一种磷酸盐缓冲溶液中。这是因为，典型地，在制备重组人类促红细胞生成素时所使用的高浓度柠檬酸缓冲试剂会增加患者不适感。利用本领域人员熟知的方法便可以获得缓冲液的交换，如利用渗滤或渗析来提供一种含有低于1毫摩尔柠檬酸盐的EPO散剂。
在本发明的药物组合物中所使用的缓冲试剂的量主要取决于所用的特定缓冲试剂以及所期望的制剂pH值。通常，缓冲离子的浓度在大约10mM～大约30mM之间。适合于将pH值维持在大约4～大约9的缓冲体系包括，但并未局限于，柠檬酸钠/柠檬酸、醋酸钠/醋酸、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾/磷酸氢盐，以及任何其他在本领域中药物可以接受的pH缓冲试剂。优选的缓冲体系为磷酸二氢钠和磷酸氢钠。也可以在制剂中加入一种pH调节试剂来将制剂的pH值调节到期望的pH范围之内，如，但并未局限于，盐酸、柠檬酸、氢氧化钠或它们的盐，尤其是柠檬酸钠。这些制剂的一个目标就是使伴随用柠檬酸盐缓冲制剂进行皮下施药所带来的患者不适降低至最低。因此，在本发明的所有制剂中，无论在水性蛋白质本体试剂还是在制剂缓冲组分中，磷酸盐缓冲体系为特别优选的缓冲体系。
优选地，本发明含蛋白质制剂的pH值范围在大约4.5～大约9之间，更优选地，在大约6～大约7.5之间。优选地，本发明含促红细胞生成素制剂的pH值范围在大约6.5～大约8之间，更优选地，在大约6.9～大约7.4之间。
在本发明的制剂中可以使用一种或多种离子等渗剂。离子等渗剂为能够保持本发明制剂与人体血液具有等渗压或接近人体血液的等渗压并且在水溶液中带有正电荷或负电荷的任何试剂。典型的合适等渗剂为那些为本领域的技术人员所熟知的等渗剂，包括但并未局限于氯化钠、氯化钾、硫酸铵、甘氨酸或其他氨基酸。本发明中优选的等渗剂包括但并未局限于氯化钠、氯化钾和甘氨酸，所述试剂的浓度范围为大约0～大约170毫摩尔。在本发明的制剂中，优选地，使用浓度范围为大约75mM～大约100mM的氯化钠作为等渗剂。等渗剂的类型及其浓度可能会影响制剂的持续释放性能。在包含有不只一种等渗剂的制剂中，通常情况下，等渗剂的总浓度低于200mM。
在本发明的制剂中所使用的羧甲基醚纤维素钠(CMC-CAS#9004-32-4)的分子量为大约50,000～1,000,000，其浓度范围为总配方重量的大约0.5％～大约7％，优选地，为大约0.5％～大约2％，最优选地为大约2％。所使用的CMC浓度依据制剂中所使用的蛋白质量和特性而各不相同。通过比较一种含CMC制剂与一种除不含CMC外完全相同的制剂的药代动力学性能来测试制剂的持续释放活性。通常情况下，优选地，制剂中含有0.5％～大约2％的CMC，因为此时其不仅容易制备而且容易通过注射来进行施药。通常，在制剂中，蛋白质的含量和CMC的含量与制剂的药代动力学性能之间存在一定的关系。含有较多蛋白质的制剂需要较大量的CMC来提供持续释放特性。可以将蛋白质/CMC表示为蛋白质(μg)与％CMC(g/100ml)的比率。优选的EPO制剂所含的比率不大于660μg EPO/％CMC。
在本文中，短语“持续释放”指制剂有益的药代动力学特性。可以使用为本领域技术人员所熟知的方法或如本文中所描述的方法来计算药代动力学参数。例如，但绝非限于，通过模型独立方法，利用1.1版本的WinNonlin软件(科学咨询有限公司，Apex，NC)可以计算一个或多个药代动力学参数。当评价本发明制剂的持续释放性能时，可以考虑各种动力学性能。例如，但绝非限于，可以通过评价下列药代动力学参数来确定本发明制剂的持续释放性能。
血清峰浓度(C_max)：所观察到的蛋白质的最大血清浓度。由于相对吸收进入循环系统的速度较慢，所以持续释放制剂的C_max可能比相似的非持续释放制剂的C_max低。
C_max时间(T_max)：C_max出现时的时间。由于相对扩散进入循环系统的速度较慢，所以持续释放制剂的T_max可能比相似的非持续释放制剂的T_max长。
终端半衰期(t_1/2)：持续释放制剂的t_1/2可能比相似的非持续释放制剂的t_1/2长。
未局限于理论，发明者考虑认为，这些制剂的持续释放特性的发生是源于蛋白质与CMC的疏水相互作用和蛋白质与CMC之间存在的离子相互作用的组合。在所描述的pH值下，蛋白质与CMC均带有负电荷，因此，其他组分，可能是带电的等渗剂，形成一个类似于生化相互作用中为人们所熟知的盐桥的“离子桥”。蛋白质、CMC和/或离子等渗剂之间的相互作用足以强至能够延缓蛋白质从注射位点处的扩散，但蛋白质没有被永久滞留在此位点上。对于本领域的普通技术人员来说，很明显的一点是，本发明的制剂通常可用于除了促红细胞生成素外的治疗性蛋白质的肠胃外施药，包括但并未限于，干扰素、粒细胞集落刺激因子、胰岛素、抗体和抗体片断、生长激素、组织纤维蛋白溶解原活化剂、白细胞介素和用于免疫响应的抗原。本发明的制剂利用主要为溶液状态而非微颗粒状态的CMC聚合物，但是，各种不同比例的微颗粒CMC聚合物与非微颗粒CMC聚合物也可以适合于在本发明的制剂中使用。
在本发明中可以使用的合适的蛋白质和多肽包括，但并未限于，胰岛素、促胃动素、胃泌素、促乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促红细胞生成素、生长激素(GH)、角质细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素、骨原生成素(OPG)、肥胖蛋白(OB蛋白：此蛋白质在本文中也可以称为leptin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、α-干扰素(尤其是α-2b)、β-干扰素(尤其是β-1a和β-1b)、γ-干扰素、白细胞介素2、成纤维细胞生长因子(FGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、集落刺激生长因子(CSFs)、肿瘤坏死因子(TNF)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜生长激素(HCG)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT3)、神经营养因子4(NT 4)、脑神经营养因子(BDNT)、胶质细胞系神经营养因子(GDNF)、血小板生长因子(PGDF：也称为白细胞介素11)、内皮血管生长因子(VEGF)、骨形成蛋白(BMP)、巨核细胞生长分化因子(MGDF)、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、超氧化物歧化酶(SOD)、组织血浆酶原活化剂(TPA)、尿激酶、溶栓酶、激肽释放酶、α-牛乳糖、胰腺核糖核酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、白细胞介素-2受体拮抗剂(IL-Ira)、REMICADE(Infliximab：一种阻断循环TNFα生物活性的单克隆抗体)、ENBREL(etanercept：由人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分连接至人IgG1 Fc部分组成的二聚融合蛋白)。
本发明制剂的制备是通过将此制剂试剂混合在一水性溶液中，以使组分基本上达到均一的混合，从而使所有组分不存在局部集中现象。有利地，在加入蛋白质组分之前，将除蛋白质组分外的所有制剂组分制备并调节至适合于蛋白质的条件。此外，可以将蛋白质本体试剂渗滤进入适当的缓冲体系中，优选地，磷酸盐缓冲液中，同时，将其他试剂加入到蛋白质中，并将本体蛋白质的浓度调节至合适的期望效能。
通常，优选的配制本发明的含促红细胞生成素制剂以及其他含蛋白质制剂的方法包含如下步骤：
a)对10～30毫摩尔磷酸盐缓冲液渗滤一种重组人类EPO本体溶液，以提供一种磷酸盐缓冲的含有低于1mM柠檬酸的EPO本体溶液；
b)将一定量的羧甲基醚纤维素钠与磷酸盐缓冲的EPO本体混合，足以使羧甲基醚纤维素钠的最终浓度为大约0.5％～大约7％；
c)将一定量的氯化钠与磷酸盐缓冲的EPO本体混合，足以使氯化钠的最终浓度为大约0mM～大约170mM；和
d)用水调节EPO本体，足以提供预定的最终制剂体积和EPO效能。
根据需要，可以将本发明的制剂通过除静脉施药外的肠胃外方法施药至目标物。特定的肠胃外施药途径包括，但并未限于，肌内、皮下、腹膜内、大脑内、心室内、脑室内、膜内、脑池内、脊柱内和/或借助带有或不带有抽吸装置的颅内或脊椎内针和/或导管输送至脊柱周围的施药途径。施药途径的选择可以基于药物活性蛋白质的治疗指示。
激素、细胞因子、凝血因子以及其他生物活性蛋白质包括胰岛素、促胃动素、胃泌素、促乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促红细胞生成素、生长激素(GH)、角质细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素、骨原生成素(OPG)、肥胖蛋白(OB蛋白：此蛋白质在本文中也可以称为leptin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、α-干扰素(尤其是α-2b)、β-干扰素(尤其是β-1a和β-1b)、γ-干扰素、白细胞介素2、成纤维细胞生长因子(FGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、集落刺激生长因子(CSFs)、肿瘤坏死因子(TNF)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜生长激素(HCG)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT3)、神经营养因子4(NT4)、脑神经营养因子(BDNT)、胶质细胞系神经营养因子(GDNF)、血小板生长因子(PGDF：也称为白细胞介素11)、内皮血管生长因子(VEGF)、骨形成蛋白(BMP)、巨核细胞生长分化因子(MGDF)、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、超氧化物歧化酶(SOD)、组织血浆酶原活化剂(TPA)、尿激酶、溶栓酶、激肽释放酶、α-牛乳糖、胰腺核糖核酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、白细胞介素-2受体拮抗剂(IL-Ira)、REMICADE和ENBREL，可以借助肌内、皮下或腹膜内等途径进行施药，以便达到系统释放蛋白质的目的。
某些生长因子，如角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血小板生长因子(PGDF：也称为白细胞介素-11)可以施药在作用点上或附近，以达到局部效用。局部注射本发明制剂可能会导致活性药物试剂在局部区域的浓度较高，这种施药方法可能要比局部施用含有这些蛋白质的药用凝胶的效果好。
神经活性蛋白质，包括促红细胞生成素(EPO)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT3)、神经营养因子4(NT4)、脑神经因子(BDNT)、胶质细胞系神经营养因子(GDNF)、骨形成蛋白质(BMP)可以通过大脑内、心室内、脑室内、膜内、脑池内、脊柱内和/或借助带有或不带有抽吸装置的颅内或脊椎内针和/或导管输送至脊柱周围的施药途径直接施药进入神经元组织。
在进行促红细胞生成素施药时，短语“治疗有效的”一般在大约1～10000I.U./kg，优选地，在大约50-2000I.U./kg，更优选地，在大约50～600I.U./kg，最优选地，在大约50～300I.U./kg(体重)，尤其在皮下施用促红细胞生成素时。有利地，在不降低疗效的情况下，可以以任何期望的频率或时间间隔将本发明的制剂施药至目标物。在一优选的施药方法中，可以以每两个星期三次、每星期一次、每两个星期一次、每三个星期一次、每月一次、每五个星期一次、每六个星期一次，或以更高的频率或更小的间隔，或以任何期望的频率或时间间隔的组合将本发明持续释放制剂施用至实验目标物。优选地，促红细胞生成素(EPO)的有效日服剂量为大约4000～大约9000I.U.(相当于每两个星期大约60,000I.U.～大约120,000I.U.)。最优选地，促红细胞生成素(EPO)的有效日服剂量为5715I.U.(相当于每两个星期大约80,000I.U.)。优选的施药方法为每三个星期一次，尤其是对进行化学疗法治疗癌症的目标物，因为许多化学疗法的施药日程安排为每三个星期一次。但是，任何治疗性蛋白质的施药剂量日程安排，如根据本发明配制的EPO，可以根据患者的需要很容易地与治疗医师的定期出诊或与如抗肿瘤药物等其他药物的施药剂量日程安排相互协调一致。这就能够使EPO疗法与化学疗法同时或平行进行，为治疗目标物提供即经济又合适的好处。如果男性或女性患者的血红蛋白的含量分别超过大约18g/dL或大约16g/dL时，延缓或停止施用EPO。
下列实施例是为了说明本发明，但并未将本发明局限于所述实施例。
实施例1
在免疫抑制狗中评价EPO持续释放制剂
此项研究是设计在各种不同的施药法情况下，用实验小猎狗来评价CMC-EPO。同时也对EPO(促红细胞生成素)制剂的药效学和药代动力学概况进行了测试。
制剂
EPREX：(对比制剂)
CMC1：15,000IU EPO，0.5％CMC，10mM磷酸钠缓冲液，pH 7，
      15mg/ml甘氨酸；总渗透压(tonicity)＝199
      mg Pro./％CMC＝250
CMC2：15,000IU EPO，1.0％CMC，10mM磷酸钠缓冲液，pH 7，
      15mg/ml甘氨酸；总渗透压＝199
      mg Pro./％CMC＝125
CMC3：15,000IU EPO，2.0％CMC，10mM磷酸钠缓冲液，pH 7，
      15mg/ml甘氨酸；总渗透压＝199
      mg Pro./％CMC＝63
CMC4：15,000IU EPO，2.0％CMC，10mM磷酸钠缓冲液，pH 7，
      50mg/ml甘露醇；总渗透压＝274
      mg Pro./％CMC＝63
储存
在不做科研使用情况下，将EPO制剂冷藏(～4℃)避光保存。
研究动物
种：                  狗
特种：                小猎狗
性别：                雄性
来源：                Harlan Sprague Dawley公司，
                      印第安纳波利斯，印地安那州46299
给药年龄：            9～18月
首次给药目标物体重：  6～18kg
鉴定方法：            动物供应者纹身标记
研究数量：            21(N＝3只狗/组)
畜舍
将实验小猎狗分组饲养在狗舍中，并使其适应处理环境以及定量施药前的样本收集。在定量施药至少5天前进行检疫隔离。在检疫隔离期结束后，研究人员对所有动物进行健康确认。在研究/样本收集期间，除非健康条件需要，将实验小猎狗分组饲养。用动物和原始记录数对畜舍进行标记。
实验条件
将动物畜舍温度保持在23±3℃，相对湿度保持在50±15％，维持12小时白日/夜晚循环。每小时至少将畜舍空气换气10次。
食物和水
在研究期间，给实验狗随意进食Purina Certified Canine Diet#5007(Purina检定的犬科动物食物#5007)和水。
研究设计(总结)
将实验小猎犬任意分配到处理小组(N＝3只狗/组，共7组)。在第二天，给实验小猎犬施用单剂量口服环孢霉素(25mg/kg)。之后，给实验小猎犬施用每日维持剂量的环孢霉素(10mg/kg)。所有制剂和赋形剂均为皮下(sc)施药。
制剂和试验制剂给药(第一天)
在第一天给实验小猎犬施用试验和对比制剂(所有制剂以下表规定的体积进行施药)。药剂注入带有适当针头的注射器中。在实验小猎犬的背颈区域进行皮下施药。在施药前，剪除施药部位的绒毛，并用不可擦掉的墨水进行标记。