经疏水性改性的蛋白组合物及方法 【发明背景】
众所周知，某些蛋白在连接于其他部分上时，或通过形成其中蛋白有机会联合发挥作用的多聚复合物，或通过蛋白之物理-化学性质如蛋白的吸收、生物分布和半衰期的其他变化，可具有更高的生物活性。因此，目前生物技术研究中的一个主要领域涉及研制改性蛋白之物理-化学性质的方法，以使它们可以更小的量、更少的副作用、新的途径以及更低的成本进行给药。
例如，任何单个蛋白的结合亲和性(如配体对其关连受体的亲和性)有可能较低。但是，细胞正常表达成百上千的具体表面受体的复制体，而且许多受体-配体相互作用同时发生。当许多表面分子参与结合时，总的有效亲和性高于单独分子之结合亲和性的总和。相反地，如果从细胞表面上除去配体蛋白并通过重组DNA技术纯制或分离以用于例如治疗中，它们仅作为单体发生作用，失去了与许多其他紧密缔合在细胞表面上的相同蛋白的复制体协同作用的优势。如此分离后，蛋白对其受体的低亲和性对其作为治疗剂的有效性而言就有可能变成一个严重的缺陷，阻断了具体的结合通路，这是因为它必须与高亲和力的细胞-细胞相互作用进行竞争。有效地治疗有可能需要恒定的给药和／或高剂量。但是，如果能够发现形成分离蛋白的多聚体形式的方法，此等缺陷就有可能避免。
类似地，改性生物活性蛋白的其他物理-化学性质也是有用的，以便例如诱导蛋白与膜缔合，由此使其局限在给药部位处，并增强其与具体目标结合或不然就相互作用的能力。此等改变也可影响蛋白的药物分布。
已研制出几种产生偶联蛋白的方法。许多这些方法不是高度特异性的，也就是说，它们不针对偶联至蛋白上的任何具体位点。其结果是，常规的偶联剂可攻击功能位点或者立体阻断活性位点，使偶联蛋白失活。另外，偶联产物被定向，使得活性位点不能协同作用，由此使产物比单体蛋白单独的效力还要低。
作为发现蛋白改性的新方法的其他动机，带有N-端胱氨酸残基的蛋白对氧化或其他化学改性敏感，有可能损坏活性或半衰期。另外，蛋白纯制中常用的某些缓冲液含有可改性N-端胱氨酸的成分或杂质。即使避免这些缓冲液时，N-端胱氨酸也会随时间发生变化，这有可能是因为储存容器或者空气中的化学物质。其后果是，制剂缓冲液必须包含保护剂，如二硫苏糖醇，以防止胱氨酸改性和／或氧化。但是，保护剂其本身也具有显著的生物活性，而且它们因此有可能使实验复杂化，并对制剂的治疗应用产生负面影响。
因此，本领域中仍需要研制更有效地得到衍生化产物或其多聚体形式的方法，以改变蛋白的性质，影响其稳定性、效力、药代动力学、以及药物动力学。
发明简述
在本发明的一个方面中，我们已解决了方便地制造生物活性蛋白的改性形式的方法。本发明的方法可用于衍生蛋白的多聚体形式和／或可用于改变它们的物理-化学性质。我们发现，改性蛋白(例如在已有的氨基酸上添加或悬挂疏水性基团或者用疏水性基团取代氨基酸)以在蛋白上引入疏水性基团可增加蛋白的生物活性和／或其稳定性。例如，N-端胱氨酸可用作连接疏水性基团(如脂质)的方便“目标”，并由此改性生物活性蛋白。
或者，可在生物活性蛋白的C-端残基上连接疏水性基团，例如hedgehog蛋白，以改性蛋白的活性。也可在内部氨基酸残基上悬挂疏水性基团，以增强蛋白的活性，但条件是所述改性不影响蛋白的活性，例如蛋白结合受体或共同受体的能力，或者不影响蛋白的立体结构。优选的是，疏水性基团悬挂在当蛋白为天然形式时处于蛋白表面上的内部氨基酸残基上。本发明的疏水性改性对于产生与未经改性的形式相比具有变化的物理-化学性质的蛋白提供了一个通用的方法。
本发明起源于以下发现：我们在昆虫和哺乳动物细胞中表达了全长的Sonic hedgehog蛋白，除在其C-端具有胆固醇外，该蛋白的成熟形式(在成熟序列中的残基1-174)也在其N-端衍生被脂肪酸衍生化。明显的是，该形式的hedgehog与可溶性的、未经改性的hedgehog相比，在体外实验中的效力增加30倍。
因此，本发明的一个方面是分离蛋白，其包括N-端氨基酸和C-端氨基酸，其中该蛋白选自于以下组中：带有N-端胱氨酸而且该胱氨酸上悬挂有至少一个疏水性基团的蛋白；带有N-端氨基酸的蛋白，该氨基酸不是悬挂有疏水性基团的胱氨酸；以及疏水性基团取代N-端氨基酸的蛋白。疏水性基团可以是疏水性肽或脂质或者任何疏水性的其他化学基团。
可在其N-端氨基酸处改性蛋白，而且N-端氨基酸优选是胱氨酸或其官能衍生物。蛋白可在其C-端氨基酸处或者在N-端氨基酸和C-端氨基酸两处、或者在N-端和C-端氨基酸之内(即在它们中间)的至少一个氨基酸处、或者上述变化的组合处进行蛋白的改性。蛋白可以是细胞外信号蛋白，而且在优选实施方案中，蛋白是由脊椎动物、更优选由人得到的hedgehog蛋白，包括Sonic、Indian和Desert hedgehog。
另一个实施方案是A-Cys-[Sp]-B-X形式的分离蛋白，其中A是疏水性基团，Cys是胱氨酸或其官能等价物，[Sp]是任选的间隔肽序列，B是包括多个氨基酸、包括至少一个任选的间隔肽序列的蛋白；以及X是连接在蛋白上的任选的其他疏水性基团。
分离蛋白可以是细胞外信号蛋白，优选是hedgehog蛋白。该蛋白可至少在一个其他氨基酸处用至少一个疏水性基团进行改性。在另一个实施方案中，蛋白与小泡相接触，该小泡选自于细胞膜、微团和脂质体。
本发明的另一个方面是具有C-端氨基酸和N-端硫脯氨酸基团的分离蛋白，该硫脯氨酸基团是通过醛与蛋白的N-端胱氨酸的反应而形成的。本发明的再一个方面是具有C-端氨基酸和N-端酰胺基团的分离蛋白，该酰胺基团是通过脂肪酸硫酯与蛋白的N-端胱氨酸的反应而形成的。本发明的又一个方面是具有C-端氨基酸和N-端马来酰亚胺基团的分离蛋白，该N-端马来酰亚胺基团是通过马来酰亚胺基团与蛋白的N-端胱氨酸的反应而形成的。本发明的再一个方面是具有C-端氨基酸和N-端乙酰胺基团的分离蛋白。本发明的又一个方面是具有C-端氨基酸和N-端硫代吗啉基团的分离蛋白。
在这些实施方案中，蛋白的C-端氨基酸可用疏水性基团进行改性。分离蛋白可以是细胞外信号蛋白，最优选是hedgehog蛋白。
本发明的方法包括产生多价蛋白复合物的方法，其包括以下步骤：在小泡存在下使疏水性基团连接在蛋白的N-端胱氨酸上、或者N-端胱氨酸的官能等价物上。该连接步骤可包括连接脂质部分，该脂质选自于具有2-24个碳原子的饱和及不饱和脂肪酸。蛋白可以是细胞外信号蛋白，优选是选自于Sonic、Indian和Desert hedgehog中的hedgehog蛋白。
本发明的另一个方法是改性蛋白的物理-化学性质的方法，其包括以下步骤：在蛋白的N-端胱氨酸或N-端胱氨酸的官能等价物上引入至少一个疏水性基团。疏水性基团可以是脂质部分，其选自于具有2-24个碳原子的饱和及不饱和脂肪酸。其也可以是疏水性蛋白。使用该方法改性的蛋白可以是细胞外信号蛋白，优选是选自于Sonic、Indian和Desert hedgehog中的hedgehog蛋白。由这些方法制得的蛋白复合物也包括在本发明中。
除hedgehog外的其他细胞外信号蛋白包括凝溶胶蛋白、干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、单细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、血小板衍生的生长因子、生长激素和胰岛素。
另一个方法是改性具有N-端胱氨酸的蛋白(如细胞外信号蛋白)的方法。该方法包括使N-端胱氨酸与脂肪酸硫酯反应以形成酰胺，其中此等改性可增强蛋白的生物活性。
再一个方法是改性具有N-端胱氨酸的蛋白(如细胞外信号蛋白)的方法，其包括使N-端胱氨酸与马来酰亚胺基团反应，其中此等改性可增强蛋白的生物活性。该方法的其他实施方案涉及使N-端胱氨酸与醛、乙酰胺或硫代吗啉基团反应。
又一个方法是改性蛋白(如细胞外信号蛋白)的方法，其包括在蛋白上悬挂疏水性肽。疏水性基团可悬挂在蛋白的氨基酸上，该氨基酸选自于以下组中：N-端氨基酸、C-端氨基酸、在N-端氨基酸和C-端氨基酸之间的中间氨基酸、以及上述氨基酸的组合。在一个实施方案中，本发明提供用亲脂性基团改性的hedgehog多肽。在某些实施方案中，本发明的hedgehog蛋白可用亲脂性基团在成熟的经处理的细胞外区域的一个或多个内部位点处进行改性，而且也可以或者不可以在成熟多肽的N或C-端残基处用亲脂性基团进行衍生化。在其他实施方案中，在C-端残基处用除胆固醇以外的疏水性基团改性多肽。在另一个实施方案中，在N-端残基处用环(优选多环)状亲脂性基团改性多肽。也可进行上述实施方案的各种组合。本发明的治疗方法是治疗患者的神经疾病的方法，其包括向患者给药本发明之经疏水性改性的蛋白。
附图简述
图1是表征棕榈酰化形式的Shh。人Shh的结合形式是由High FiveTM昆虫细胞经免疫亲和纯制的，并用SDS-PAGE分析。蛋白用考马斯蓝(泳道a，Life Techno1ogies，Inc预染色的高分子量标记物；泳道b，可溶的Shh(0．6μg)；泳道c，结合的Shh(0．6μg)；泳道d，可溶的以及结合的Shh(0．6μg)的混合物)。Shh和Ihh(见泳道h)用棕榈酸改性的能力是用实施例2中所述的无细胞系统来分析的。可溶形式的hedgehog蛋白(3μg／样品)与鼠肝微粒体、ATP、辅酶A、和3H-棕榈酸一起温育1小时，然后用SDS-PAGE分析棕榈酰化作用。泳道e-i中所示的样品用荧光显影进行肉眼观察(泳道e，Shh；泳道f，des1-10Shh；泳道g，Cys-1至Ser Shh；泳道h，Ihh；泳道i，His标记的Shh)，而泳道j-k中的样品用考马斯染色观察(泳道j，Shh；泳道k des1-10Shh)。
图2是用ESI-MS分析经纯制的Shh。在Micromass Quattro Ⅱ三联四极质谱仪上通过ESI-MS分析可溶的人Shh(A)和结合的人Shh(B)，该质谱仪上装有电子喷射离子源。获得所有的电子喷射质谱数据，并以文件模式储存，然后用Micromass MassLynx数据系统进行处理。见分子质谱(由数据系统产生质量分布)。
图3是用反相HPLC分析结合的Shh。可溶的人Shh(A)、由HighFiveTM昆虫细胞得到的结合的人Shh(B)、由EBNA-293细胞得到的结合的人Shh(C)、和细胞伴随的鼠Shh(D)在窄孔Vydac C4柱(2．1mm内径×250mm)上进行反相HPLC分析。该柱在30分钟的时间内用在0．1％三氟乙酸中的0-80％乙腈进行梯度洗脱，流速为0．25ml／min，并使用发光二极管阵列检测器在200-300nm(数据为214nm处)处监测洗脱液。收集峰值流份，然后进一步用SDS-PAGE和MS表征(数据总结于表3、4和5中)。
图4是用LC-MS表征Shh。如(27)所述用4-乙烯基吡啶(1μl／100μl样品，在6M盐酸胍、1mM EDTA、100mM Tris HCl pH8．0中)使结合的人Shh(A)和可溶的人Shh(B)烷基化，乙醇沉淀，然后用内切蛋白酶Lys-C在50mM Tris HCl pH7．2、2M脲中以1∶5的酶∶蛋白比进行消化。消化物在线用电子喷射Micromass Quattro Ⅱ三联四极质谱仪进行分析。在整个范围内进行扫描，然后用Micromass MassLynx数据系统处理(示出了整个范围的总离子层析谱)。星号表示用MALDIPSD或N-端Edman测序证实的N-端肽的位置。
图5是用MALDI PSD测量对N-端Shh肽测序。结合的人Shh中的N-端内切蛋白酶Lys-C肽在飞行质谱仪的Voyager-DETM STR时间上进行MALDI PSD测量。在图的上端示出了检测片段离子的预测断裂模式和命名(PA，棕榈酸；4vp，4-吡啶基乙基)。图的其余部分显示了由该实验产生的分子质谱。用示意性的命名表示相关的离子。b1-b8的计算质量(Da)分别是447．3、504．3、601．4、658．4、814．5、871．5、1018．6和1075．6。对于y1-y8，质量(Da)分别是147．1、204．1、351．2、408．2、564．3、621．3、718．4、和775．4。z8的计算质量是758．4Da。b8的观察质量由于所添加的水包含另外18Da。
图6是在C3H10T1／2实验中结合的Shh的活性增加。在C3H10T1／2细胞上通过测量碱性磷酸酯酶诱导作用来评估可溶的和结合的人Shh单独(A)或者在有抗hedgehog中和Mab 5E1存在时(B)的相对效力。所示数字反映两个重复测量的平均值。可溶的(6)和结合的(8)Shh的(A)系列2倍稀释物与细胞温育5天，使用碱性磷酸酯酶产色底物对硝基苯基磷酸酯在405nm处测量碱性磷酸酯酶活性达到的水平。Mab5E1的(B)系列稀释物与可溶的Shh(5μg／ml，黑棒)或结合的Shh(0．25μg／ml，灰色棒)或不添加Shh的载体对照(白色棒)温育30分钟，然后在C3HT101／2实验中进行分析。
图7是在受体结合实验中分析Shh。在Patched转染的EBNA-293细胞上通过FACS分析评估可溶的(6)和结合的(8)Shh对结合patched的相对效力。测试样品的系列稀释物与EBNA-293细胞温育，洗涤，然后通过样品与Shh-Ig竞争结合细胞的能力测量百分结合。用FITC标记的抗Ig抗体探针通过平均荧光作为示出读数对结合的Shh-Ig进行定量。用非线性回归将数据拟合为曲线。
图8是人hedgehog蛋白的N-端片段的序列对比。20kDa人hedgehog蛋白(Sonic“Shh”、Desert“Dhh”和Indian“Ihh”)相对于它们的N-端胱氨酸(在成熟序列中Cys-1)进行序列对比。该胱氨酸在全长度的Shh前体蛋白中由于天然信号序列的存在通常是Cys-24，而该信号序列在分泌期间被除去。胱氨酸的实际位置由于种类差异略有变化。
图9是人hedgehog蛋白的N-端片段的共有序列。
图10是脂质链长对人Sonic hedgehog活性的作用。根据本发明合成一系列经脂肪酸改性的hedgehog蛋白，并使用在此所述的C3H10T1／2碱性磷酸酯酶诱导作用实验测试脂肪酸链长对hedgehog活性的影响。结果用方块图表示。
图11是棕榈酰化、肉豆蔻酰化、月桂酰化、癸酰化和辛酰化的人Sonichedgehog的C3H10T1／2实验。在C3H10T1／2细胞上通过测量碱性磷酸酯酶诱导作用分析配制在5mM Na2HPO4 pH5．5、150mM NaCl、10％辛基糖苷、0．5mM DTT中的棕榈酰化、月桂酰化、癸酰化和辛酰化的人Sonic hedgehog，以及配制在150mM NaCl、0．5mM DTT中的肉豆蔻酰化的人Sonic hedgehog。棕榈酰化(○)、肉豆蔻酰化(●)、月桂酰化(□)、癸酰化(■)、辛酰化(△)以及未改性(▲和×)的人Sonichedgehog与细胞温育5天，使用碱性磷酸酯酶产色底物对硝基苯基磷酸酯在405nm处测量碱性磷酸酯酶活性达到的水平。在一个实验中用以(▲)表示的未经改性的蛋白分析棕榈酰化、肉豆蔻酰化、月桂酰化和癸酰化的蛋白，而辛酰化的蛋白在另一个实验中用以(×)表示的未经改性的蛋白进行分析。y-轴上的箭头表示在没有添加hedgehog蛋白时的碱性磷酸酯酶的背景水平。
图12是各种经疏水性改性的hedgehog的遗传结构。(A)脂肪酸衍生物，其中R=脂肪酸的烃链；(B)噻唑烷衍生物，其中R=烃基；(C)氨基酸取代，其中R=疏水性氨基酸侧链；(D)马来酰亚胺衍生物，其中R=烃基；(E)SH=在野生型hedgehog的N-端胱氨酸上的游离硫醇；(F)碘代乙酰胺衍生物，其中 R1=烃基，而R2=H或烃基；以及(G)硫代吗啉基衍生物，其中R=烃基。对于所有结构，HH=hedgehog。
图13是各种经疏水性改性的hedgehog在C3H10T1／2实验中的相对效力。未经改性的野生型人Sonic hedgehog的EC50(2μg／ml)用1×表示。其他蛋白的效力用野生型蛋白的EC50除以改性蛋白的EC50的比值表示。除非另有说明，改性是在蛋白的N-端。
图14是未改性的、肉豆蔻酰化的、和CⅢ突变的人Sonic hedgehog在丙二酸诱导的鼠纹状体损伤实验中的相对效力。数字表示向鼠纹状体给药未经改性的、肉豆蔻酰化的、和CⅢ突变的人Sonic hedgehog导致的丙二酸诱导的损伤体积的减少。
图15表示马来酰亚胺改性的和未经改性的hedgehog多肽的特异性活性。
发明的详细描述
本发明部分基于以下发现：在昆虫或哺乳动物细胞中以全长结构表达的人Sonic hedgehog具有悬挂在N-端胱氨酸之α-胺上的疏水性棕榈酰基。这是本发明的发明者发现的第一个例子，其也是以此方式改性的细胞外信号蛋白，而且与硫醇连接的棕榈酸改性相反，该改性的连接非常容易逆转，而该新型的N-连接的棕榈酰基与肉豆蔻酸改性类似非常稳定。
该首次发现的直接结果是，本发明的发明者发现增加信号蛋白的疏水性可增加蛋白的生物活性。具体而言，本发明者发现在信号蛋白如hedgehog蛋白上悬挂疏水性基团可增强蛋白的活性。本发明者还发现，生物活性蛋白的N-端胱氨酸不仅提供用于悬挂疏水性基团的方便位点，由此改变蛋白的物理-化学性质，而且N-端胱氨酸的改性还可增加蛋白的稳定性。另外，在蛋白结构的表面上的内部氨基酸上添加疏水性基团可增强蛋白的活性。我们使用疏水性改性(如脂质和疏水性氨基酸)的hedgehog蛋白作为一个实施例。
本发明的一个方面涉及如下发现：除那些通过在蛋白的细胞外片段的C-端添加胆固醇可见到的作用外，hedgehog基因产物的至少某些生物活性通过用亲脂性基团在蛋白的其他位点处和／或用胆固醇以外的基团改性蛋白而得到增强。本发明的某些方面涉及制备hedgehog多肽，其在除天然处理的蛋白的N-端或C-端残基以外的位点处被改性，和／或在此等端残基处用除C-端的胆固醇或N-端的脂肪酸外的亲脂性基团改性。
如PCT公开WO95／18856和WO96／17924(这些文献在此并入作为参考)所述，hedgehog多肽通常用于体外和体内修补和／或调节许多细胞、组织和器官的功能性能，而且具有以下治疗作用：神经保护、神经再生、神经功能的增强、骨调节以及软骨形成和修补、调节精子产生、由原始内脏产生的肺、肝和其他器官的调节、造血功能的调节等。因此，本发明的方法和组合物包括衍生化的hedgehog多肽在hedgehog蛋白所具有的应用方面的用途。另外，所述方法可在培养基中(体外)的细胞上或者在整个动物的细胞上(体内)进行。
在一个方面中，本发明提供包括用一种或多种在此所述的亲脂性基团衍生的hedgehog多肽作为活性成分的药物制剂。
宿主的hedgehog治疗对人和动物都是有效的。可使用在本发明中的动物宿主包括作为宠物或用于商业目的饲养的家养动物和牲畜。其例子包括狗、猫、牛、马、绵羊、猪和山羊。
hedgehog蛋白是一类细胞外信号蛋白，其在脊椎动物和无脊椎动物(见1、2)中都可调节胚胎发育的各种方面。最有特征的hedgehog蛋白是Sonic hedgehog(Shh)，其参与前后成形、顶外胚层嵴的形成、后肠中胚层、脊柱、远侧肢、肋骨发育以及肺的发育，并在脊髓、后脑和前脑中诱导前侧细胞类型(3-8)。虽然hedgehog蛋白的作用机理尚未完全了解，但最新的生化和遗传学数据表明，Shh的受体是肿瘤抑制剂基因、patched(9、10)和其他蛋白的产物；在hedgehog信号通路中涉及smoothened(10、11)、Cubitus interruptus(12、13)和fused(14)。
人Shh是经合成的45kDa前体蛋白，其自身催化断裂产生：(Ⅰ)20kDa的N-端片段，其对应于所有已知的hedgehog信号活性(SEQ IDNOS．1-4)；以及(Ⅱ)25kDa的C-端片段，其包含自身处理活性(15-17)。N-端片段由全长前体序列的氨基酸残基24-197组成。
N-端片段在其C-端添加胆固醇时仍保持与膜缔合(18、19)。该胆固醇对于限制hedgehog信号的组织局部化是关键性的。添加胆固醇是在处理步骤期间由C-端区域催化的。
除非另有说明，在此引用的文献都并入作为参考。Ⅰ、定义
现参考包括以下定义的详细描述来进一步说明本发明。
“氨基酸”-肽、多肽或蛋白的单体单元。在天然肽、多肽和蛋白中发现有20种氨基酸，所有这些氨基酸都是L-异构体的。该术语也包括氨基酸的类似物和蛋白氨基酸及其类似物的D-异构体。
“蛋白”-基本上由20种氨基酸的任意种类组成的聚合物。虽然“多肽”通常用于指相对较大的多肽，而“肽”通常用于指小的多肽，但在本领域中这些术语的使用相互交叉，而且是可变化的。在此所用术语“蛋白”是指肽、蛋白和多肽，除非另有说明。
“N-端”-是指成熟蛋白的第一个氨基酸(氨基酸1)。
“N-端胱氨酸”-是指在SEQ ID NOS：1-4中所示的氨基酸残基(1)。其还指任何其他蛋白的1位的任何胱氨酸或该胱氨酸的官能等价物(见部分Ⅳ)。
“间隔”序列是指可以与单个氨基酸一样大小的短序列，其可插入在待疏水性改性的氨基酸(例如N-端胱氨酸或其官能等价物)和蛋白的其余部分之间。间隔基是用于分开疏水性改性(如改性的N-端胱氨酸)和蛋白的其余部分，以防止所述改性干扰蛋白的功能和／或使其更易于改性(例如N-端胱氨酸)连接上脂质、小泡或其他疏水性基团。因此，如果蛋白在其N-端胱氨酸和其他位点的氨基酸处改性，则可能有两个或更多个间隔序列。
“结合的”蛋白-是指根据本发明经疏水性改性的蛋白。
“多价蛋白复合物”-是指多个蛋白(如一个或多个)。脂质或其他疏水性基团连接在上述多个蛋白中的至少一个上。脂质或其他疏水性基团可任选地与小泡相接触。如果蛋白缺乏脂质或其他疏水性基团，则该蛋白有可能交联或结合在具有脂质或其他疏水性基团的蛋白上。各蛋白可相同或不同，而且各脂质或其他疏水性基团也可相同或不同。
“小泡”-是指任何亲脂性分子的聚集体。小泡可由生物性物质(如脂质双层如细胞膜或者胆酸衍生的洗涤剂制剂)或非生物性物质(部分Ⅳ中所述的非生物洗涤剂小泡)得到。小泡的形状、类型以及构型都不是用于限制本发明的范围。
氨基酸残基(如N-端胱氨酸)的“官能等价物”-是指(i)具有与被官能等价物置换的氨基酸残基类似的反应性质的氨基酸；(ⅱ)本发明多肽的配体的氨基酸，该氨基酸具有与被官能等价物置换的氨基酸残基类似的疏水性(如脂质)基团结合性质；(ⅲ)具有与被官能等价物置换的氨基酸残基类似的疏水性(如脂质)基团结合性质的非氨基酸分子。
“基因融合”-是指两个或更多个蛋白或其片段经由它们单独的肽骨架通过编码这些蛋白的多核苷酸分子的基因表达而形成的共线性共价键。
“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是指编码hedgehog多肽的第一个氨基酸序列与限定外源或基本上与hh蛋白的任何域不同源的域的第二个氨基酸融合。嵌合蛋白可代表存在于也表达第一个蛋白的生物中(但可在不同的蛋白中)的外源域，或者是不同种类的生物表达的蛋白结构的“种间”、“基因间”等融合。通常情况下，融合蛋白可以用通式(X)n-(hh)m-(Y)n(其中hh代表所有或部分的hedgehog蛋白，X和Y分别独立地代表不是天然存在的氨基酸序列如与hedghog序列邻接的多肽链，m是大于或等于1的整数，而各n独立地是0或者大于或等于1的整数，n和m优选不大于5或10)。
“突变体”-在生物遗传物质中的任何变化，特别是在野生型多核苷酸序列中的任何变化(如缺失、取代、添加或改变)或者在野生型蛋白中的任何变化。
“野生型”-蛋白或其一部分、或者蛋白序列或其一部分的外显子的天然多核苷酸序列，如其在体内正常存在的一样。
“标准的杂交条件”-在杂交和洗涤时基本上等于0．5X SSC-约5XSSC和65℃的盐和温度条件。在此所用术语“标准杂交条件”是指操作时的限制，并包括一个杂交条件范围。也可参见“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley & Sons，Inc．New York，Sections 6．3．1-6．3．6(1989)。
“表达控制序列”-当操作性地与基因连接时可控制和调节这些基因的表达的多核苷酸序列。
“操作性连接”-当表达控制序列控制和调节多核苷酸序列的转录和翻译时多核苷酸序列(DNA、RNA)操作性地连接在表达控制序列上。在此所用术语“操作性连接”包括在待表达的多核苷酸序列之前具有一个合适的起始信号(如ATG)，并在控制表达控制序列的情况下保持正确的阅读框以表达多核苷酸序列，以及产生由多核苷酸序列编码的所希望的多肽。
“表达载体”-在将表达载体引入宿主细胞中时可允许至少一个基因之表达的多核苷酸，如DNA质粒或噬菌体(还包括其他例子)。载体能或不能在细胞中复制。
“分离的”(与“基本上纯的”可交换使用)-当用于核酸时，如编码多肽的多核苷酸序列，代表RNA或DNA多核苷酸、部分基因组多核苷酸、cDNA或合成的多核苷酸，它们由于起源或操作条件(ⅰ)不与所有天然与其结合的多核苷酸缔合(如作为表达载体或其一部分存在于宿主细胞中)；或者(ⅱ)连接在核酸或其他除其天然连接的化学基团上；或者(ⅲ)不是天然存在的。“分离的”进一步代表以下多核苷酸序列：(ⅰ)体外由例如聚合酶链反应(PCR)扩增的；(ⅱ)化学合成的；(ⅲ)通过克隆重组产生的；或者(ⅳ)通过裂解和凝胶分离纯制的。
因此，“基本上纯的核酸”是不立即与编码序列之一或其两者邻接的核酸，而在正常情况下核酸在其衍生的生物的天然基因组中是与这些编码序列邻接的。基本上纯的DNA也包括重组的DNA，其是编码其他hedgehog序列的杂种基因的一部分。
“分离的”(与“基本上纯的”可交换使用)-当用于多核苷酸时，代表多核苷酸或其一部分，它们由于起源或操作条件：(ⅰ)存在于宿主细胞中作为表达载体的一部分的表达产物；或者(ⅱ)连接在蛋白或其他除其天然连接的化学基团上；或者(ⅲ)不是天然存在的，例如通过在蛋白上悬挂或添加至少一个疏水性基团来化学改性的蛋白，使该蛋白不是天然形式的。“分离的”进一步代表以下多核苷酸序列：(ⅰ)化学合成的；或者(ⅱ)在宿主细胞中表达、并由缔合且污染的蛋白中纯制的。该术语通常代表由其他蛋白以及其天然带有的核酸中分离出的多核苷酸。优选的是，多核苷酸还可从如抗体或用于纯制核苷酸的凝胶基质(聚丙烯酰胺)中分离出来。
“异源启动子“-在此是指天然不与基因或纯制核酸缔合的启动子。
“同源的”-在此与“相同的”是同意词，并指两个多肽、分子、或者两个核酸之间的序列类似性。当两个对比的序列中的一个位置被相同的碱或氨基酸单体亚单位(例如两个DNA分子的一个位置被腺嘌呤占据，或者两个多核苷酸的一个位置被赖氨酸占据)，则相应的分子在该位置处是同源的。两个序列之间的部分同源性是两个序列相匹配或同源的位置除以相比较的位置数×100的函数。例如，在两个序列中10个位置有6个是相匹配的或者是同源的，则两个序列是60％同源的。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT具有50％的同源性(总共6个位置中有3个是相匹配的)。通常情况下，将两个序列并列放置进行比较，以给出最大同源性。此等序列对比可例如使用Needleman等人的方法(J．Mol Bio1．48：443-453(1970))来进行，通常是用计算机程序如Align程序(DNAstar，Inc．)来实施。同源序列具有相同或类似的氨基酸残基，其中类似的残基是对比参考序列中相应氨基酸残基的保守性替换或者“允许的点突变”。在此方面，参考序列中残基的“保守性取代”是物理上或者功能上类似于相应参考残基的那些替换，例如具有类似的大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力，等等。特别优选的保守性替换是满足Dayhoff等人(5：蛋白序列和结构的图谱(Atlas of Protein Sequence and Structure)，5：Suppl．3，第22章：354-352，Nat．Biomed．Res．Foundation，Washington，D．C．(1978))对“可接受的点突变”所限定的标准。
本发明中的“hedgehog蛋白”或“hedgehog多肽”是可相互交换使用的术语，其具有至少由共有氨基酸序列SEQ ID NO：4所组成的一部分。该术语还代表具有生物活性的hedgehog多肽、或者hedgehog多肽的功能变体、或者hedgehog多肽的同源物、或者功能变体。具体而言，该术语包括hedgehog蛋白及其肽片段的制剂，为激动剂和拮抗剂的形式，因为具体的上下文将使其更为清楚。在此所用术语“hedgehog蛋白的生物活性片段”是指全长hedgehog多肽的片段，其中该片段特异性激动或拮抗由野生型hedgehog蛋白介导的可诱导事件。hedgehog生物活性片段优选是hedgehog蛋白的可溶性细胞外部分，而溶解度是参考生理相容性溶液。示例性的生物活性片段描述在PCT公开WO95／18856和WO96／17924中。在优选实施方案中，本发明的hedgehog多肽结合patched蛋白。
术语“相应于”，在指具体的多肽或核酸序列时，代表所关注的序列与所述相应的参考序列是相同或同源的。
术语“肽”、“蛋白”和“多肽”在此是可相互交换使用的。术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在此也是可相互交换使用的。术语“hedgehog片段”和“hedgehog N-端片段”在此可与“hedgehog”相互相互使用。
如果具有至少以下一种性质，hedgehog分子就具有“生物活性”：(ⅰ)分子满足在此限定的(SEQ ID NO：4)的hedgehog共有标准，并具有结合其受体、patched的能力，或者其在表达时编码具有该特征的多肽；(ⅱ)分子满足在此限定的hedgehog共有标准，或者其在表达时编码具有该特征的多肽；以及(ⅲ)其可在C3H10T1／2细胞中诱导碱性磷酸酯酶活性。通常情况下，如果蛋白具有本领域普通技术人员认为是蛋白的体内作用的代表性、与其相一致或者是合理预期的体外作用、性质、或特征，则任何蛋白都具有“生物活性”。
术语“疏水性的”是指具有非极性原子化学基团相互作用而不是与水或其他极性原子相互作用的趋势。疏水性的物质大部分是不溶于水的。具有疏水性的天然物质包括脂质、脂肪酸、磷脂、鞘脂、酰基甘油、蜡、固醇、类固醇、萜、前列腺素、血栓烷、白三烯、类异戊二烯、retenoids、生物素以及疏水性氨基酸，如色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸。如果其物理性质是由于存在非极性原子来确定的，则化学基团也可以是疏水性的或者具有疏水性。该术语包括亲脂性基团。
与多肽有关的“亲脂性基团”是指具有高烃含量并由此使基团对脂质相具有高亲和性的基团。亲脂性基团可例如包括具有约7-30个碳原子的相对较长链的烷基或环烷基(优选正烷基)。烷基的端部可以带有羟基或伯胺“尾”。为进一步说明，亲脂性分子包括天然及合成的芳香和非芳香基团，如脂肪酸、酯和醇，其他的脂质分子，笼状结构如金刚烷和富勒烯(buckminsterfullerenes)，以及芳香烃如苯、北、菲、蒽、萘、芘、屈和并四苯。
“内部氨基酸”，代表在肽序列中既不是N-端氨基酸也不是C-端氨基酸的任何氨基酸。
“表面氨基酸，，代表当代表折叠成天然形式的时候暴露在溶剂中的任何氨基酸。
“细胞外信号蛋白”是指由细胞中分泌或者结合在细胞外侧、而且在结合于目标细胞之蛋白的受体上时引发目标细胞中的反应的任何蛋白。
相对于具体的治疗方法，“有效量”的hedgehog多肽是指根据临床上对待治疗疾病的标准或者化妆目的，制剂中的多肽的量在以部分所希望的剂量施用时对照细胞增殖速率和／或细胞分化状态和／或细胞存活率的变化。
用本发明的方法治疗的“患者”或者“宿主”可以是人或非人动物。细胞的“生长状态”是指细胞的增殖速率和细胞的分化状态。
除非另有说明，本发明的实施使用本领域技术人员已知的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋白化学、以及免疫学中的常规技术。此等技术在文献中都有描述。Ⅱ、分离的hedgehog蛋白的总性质
本发明方法的hedgehog组合物的多肽部分是根据多种技术产生的，包括天然蛋白的纯制、重组产生的蛋白以及合成化学。多肽形式的hedgehog治疗剂优选得自于脊椎动物hedgehog蛋白，例如具有相应于脊椎生物之天然hedgehog蛋白或其片段的序列。但是，应认识到，hedgehog蛋白可相应于在任何后生生物中的hedgehog蛋白(或者其片段)。
本发明中所用的分离的hedgehog蛋白是天然产生或者重组的hedgehog蛋白，并可从无脊椎或脊椎动物中获得(见以下参考文献)。脊椎动物hedgehog蛋白的成员具有同源性，其中蛋白是由Drosophilahedgehog(hh)基因编码的(33)。目前，鼠基因组和cDNA文献的组合筛选已鉴别出三种哺乳动物hh，称为Sonic hedgehog(Shh)、Indianhedgehog(Ihh)和Desert hedgehog(Dhh)，它们也存在于其他哺乳动物中，包括人，而且还存在于鱼和鸟中。其他成员包括Moonrat hedgehog(Mhh)、以及鸡Sonic hh和zebrafish Sonic hh。
鼠和鸡Shh以及鼠Ihh基因编码断裂的多核苷酸，产生约20kDa的氨基端片段(见图8)和约25kDa的羧基端片段。最优选的20kDa片段具有共有序列SEQ ID NO：4，并包括SEQ ID NOS：1-3的氨基酸序列。包括20kDa部分的其他各种片段也被认为是在本发明的范围中。披露这些序列以及它们的化学和物理性质的文献包括(34-38)、PCT专利申请WO95／23223(Jessell，Dodd，Roelink和Edlund)、WO95／18856(Ingham，McMahon和Tabin)和WO96／17924(Beachy等人)。
可用于本发明方法中的成员包括任何天然hedgehog蛋白，包括等位、种系对应物或其他的变体，而无论天然或化学形成的，包括突变蛋白，以及重组形式和新的活性成员。特别有用的hedgehog多肽包括SEQID NOS：1-4。
用于本发明中的分离的hedgehog多肽具有生物活性。多肽包括至少60％、80％、90％、95％、98％或99％同源于氨基酸序列SEQ ID NOS：1-4的氨基酸序列。多肽还可包括基本上与氨基酸序列SEQ ID NOS：1-4相同的氨基酸序列。多肽的长度至少具有5、10、20、50、100、或150个氨基酸，而且包括至少5、优选至少10、更优选至少20、最优选至少50、100或150个与SEQ ID NOS：1-4邻接的氨基酸。
本发明的优选多肽包括hedgehog多肽序列以及其他N-端和／或C-端氨基酸序列，或者其可包括所有hedgehog氨基酸序列或其片段。分离的hedgehog多肽还可是具有第一hedgehog部分和第二多肽部分的重组融合蛋白，例如第二部分多肽具有与hedgehog不相关的氨基酸序列。第二多肽部分可例如是组氨酸标记物、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、DNA结合域或聚合酶活化域。
本发明的多肽包括那些由于多基因的存在、替代性转录事件、替代性RNA剪接、以及替代性翻译和后翻译事件而产生的多肽。多肽可完全通过合成方法来制得，或者在系统如培养细胞中表达，当蛋白在天然细胞中表达时该系统产生基本上相同的后翻译改性，或者当在天然细胞中表达时该系统不产生后翻译改性。
在优选实施方案中，分离的hedgehog是具有一种或多种以下特征的hedgehog多肽：
(ⅰ)其与氨基酸SEQ ID NOS：1-4具有至少30、40、42、50、60、70、80、90或95％相同的序列；
(ⅱ)其具有胱氨酸或官能等价物作为N-端；
(ⅲ)其可在C3H10T1／2细胞中诱导碱性磷酸酯酶活性；
(ⅳ)其与SEQ ID NOS：1-4的多肽序列具有至少50％、优选至少60％、更优选至少70、80、90或95％的总序列相同性；
(ⅴ)其可由天然源如哺乳动物细胞中分离；
(ⅵ)其可结合或与patched相互作用；以及
(ⅶ)其是经疏水性改性的(即、其具有至少一个连接在多肽上的疏水性基团)。Ⅲ、其他蛋白
因为目前已有将胱氨酸残基(或其官能等价物)改造进多肽的原序列中的技术，实际上可用在此描述的方法将任何蛋白转化为疏水性改性的形式。
病毒受体、细胞受体、以及细胞配体都是有用的，这是因为它们通常结合具有许多受体复制体的细胞或组织。可使用本发明的方法复合化的有用病毒-细胞蛋白受体包括ICAM1(一种鼻病毒受体)、CD2(Epstein-Ban病毒受体)、以及CD4(人免疫缺损病毒(HIV)的受体)。其他蛋白包括细胞粘连分子，例如ELAM-1和VCAM-1和VAM-1b以及它们的淋巴细胞对应物(配体)；淋巴细胞伴随抗原LFA1、LFA2(CD2)和LFA3(CD58)，CD59(CD2的第二配体)，CD11／CD18中的成员以及非常晚抗原如VLA4和它们的配体。
由各种病原体(如细菌、真菌、病毒和其他真核寄生虫)产生的免疫原也可用作本发明方法中的多肽。细菌免疫原包括但不限于针对细菌性肺炎和肺囊虫性肺炎的细菌源。寄生虫源包括Plasmodium疟疾寄生虫。病毒源包括痘病毒(如牛痘、单纯疱疹、巨细胞病毒)；腺病毒；乳多空病毒(如乳头瘤病毒)；细小病毒(如腺伴随病毒)；逆转录病毒(如HTLV Ⅰ、HTLV Ⅱ、HIV Ⅰ和HIV Ⅱ)以及其他病毒。免疫球蛋白或其片段也可用作根据本发明改性的多肽。人们可以使用常规方法(49)产生识别特异性抗原的单克隆Fab片段，并使用单独的Fab域作为根据本发明的多聚结构中的功能部分。其他有用的蛋白包括凝溶胶蛋白(50)；细胞因子，包括各种干扰素(干扰素-α、干扰素-β、和干扰素-γ)；各种白介素(如IL-1、-2、-3、-4等)；肿瘤坏死因子-α和-β；单细胞刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、以及人和动物激素，包括生长激素和胰岛素。
通常情况下，本发明之经改性的蛋白的结构具有以下通式：A-Cys-[Sp]-B-[Sp]-X，其中A是疏水性基团；Cys是胱氨酸或其官能衍生物；[Sp]是任选的间隔肽序列；B蛋白(其任选地具有在此所示的其他间隔肽序列)；以及X是连接(任选通过间隔肽)在蛋白的C-端上或者蛋白的其他表面位点上的疏水性基团，而衍生化的蛋白包括A或X中的至少一个。如果X是胆固醇，则B可能是或可能不是hedgehog蛋白。如上所述，间隔基的目的是在疏水性基团和蛋白的其他部分之间形成间隔，以使疏水性基团(如经改性的N-端胱氨酸)更易于连接在有可能为脂质或小泡的其他部分上。间隔基的另一个目的是使改性步骤更难于干扰蛋白的功能。间隔基在长度上可与单个氨基酸一样小。通常情况下，脯氨酸和甘氨酸是优选的。特别优选的间隔序列得自于Sonic hedgehog，并由氨基酸序列：G-P-G-R组成。Ⅳ、制备重组多肽
在此描述的分离多肽可用任何本领域中已知的合适方法来制备。此等方法包括直接蛋白合成法直至构建编码分离多肽序列并在合适的转化宿主中表达这些序列的DNA序列。
在重组方法的一个实施方案中，DNA序列通过分离或合成编码野生型目的蛋白的DNA序列来构建。任选地，该序列可通过位点特异性诱变来进行诱变处理，以形成其功能类似物。见例如(40)和第4，588，585号美国专利。其他构建编码目的多肽的DNA序列的方法是使用寡核苷酸合成剂的化学合成法。此等寡核苷酸可优选根据所希望的多肽的氨基酸序列来设计，并优选地选择那些有利于其中产生目标重组多肽的宿主细胞的编码子。
标准方法可适用于合成编码目的分离多肽的分离多核苷酸序列。例如，可使用完整氨基酸序列构建反向翻译的基因。见Maniatis等人，同上。另外，可合成包含编码特定分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可合成编码部分所希望的多肽的几个小的寡核苷酸，然后进行连接。单独的寡核苷酸通常包含用于补偿性装配的5＇或3＇突出端。
一旦装配(通过合成、位点针对性的诱变或者通过其他方法)，编码特定的目的分离多肽的突变DNA序列插入在表达载体中，并操作性地连接在适合于在所希望的宿主中表达蛋白的表达控制序列上。合适的装配可通过核苷酸测序、限制性作图、以及生物活性多肽在合适宿主中的表达来证实。如本领域技术人员所熟知的，为使转染基因在宿主中产生高水平的表达，该基因必须操作性地连接在转录和翻译表达控制序列上，该序列在所选择的表达宿主中是功能性的。
表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主的选择。可以使用各种表达宿主／载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如由SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒得到的包含表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知的细菌质粒，如Esherichia coli的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9以及它们的衍生物，更宽宿主范围的质粒，如M13和丝状单链DNA噬菌体。优选的E．Coli载体包括含有λ噬菌体pL启动子的pL载体(第4，874，702号美国专利)、包含T7聚合酶启动子的pET载体(Studier等人，Methods in Enzymology 185：60-89，19901)以及pSP72载体(Kaelin等人，同上)。对于酵母细胞有用的表达载体例如包括2T和着丝质粒。
另外，各种表达控制序列都可用于这些载体中。此等有用的表达控制序列包括与上述表达载体的结构基因有关的表达控制序列。有用的表达控制序列的例子包括例如SV40或腺病毒的早和晚启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区域如pL、fd包衣蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酯酶的启动子如Pho5、酵母α-接合系统的启动子、以及已知控制原核或真核细胞和它们的病毒的基因表达的其他序列、以及它们的各种组合。
可使用任何合适的宿主以定量地产生在此所述的分离hedgehog多肽，包括细菌、真菌(酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其他合适的动物细胞或细胞系、以及转基因动物或植物。更具体而言，这些宿主包括已知的真核和原核宿主，如E．Coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces株，真菌，酵母(如Hansenula)，昆虫细胞如Spodoptera frugiperda(SF9)，以及High FiveTM(见实施例1)，动物细胞如中华仓鼠卵巢(CHO)、鼠细胞如NS／O细胞、非洲绿猴细胞COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10，以及人细胞和植物细胞。
应理解的是，并不是所有的载体和表达控制序列对于表达特定的分离多肽都具有相同的作用。所有的宿主也不是对相同的表达系统都起到相同的作用。但是，本领域技术人员可不用进行实验就在这些载体、表达控制系统和宿主中进行选择。例如，为在大规模的动物培养中产生目标分离多肽，表达载体的复制数量必须被控制。可扩增的载体在本领域中是已知的。例如参见(41)以及第4，470，461和5，122，464号美国专利。
DNA序列操作性地连接在表达控制序列上包括在DNA序列的上游在正确的阅读框中提供翻译起始信号。如果所表达的具体DNA序列不是以蛋氨酸开始的，则起始信号将产生另外一个氨基酸(蛋氨酸)，其位于产物的N-端。如果疏水性基团连接在包含N-端蛋氨酸的蛋白上，则该蛋白可直接使用在本发明的组合物中。然而，因为蛋白的优选N-端是由胱氨酸(或其功能类似物)组成的，蛋氨酸必须在使用前被除去。在本领域中有许多将此等N-端蛋氨酸从用它们表达的多肽中除去的方法。例如，某些宿主和发酵条件允许在体内基本上除去所有的N-端蛋氨酸。其他宿主需要体外除去N-端蛋氨酸。此等体外和体内方法在本领域中是众所周知的。
由转化宿主产生的蛋白可根据任何合适的方法进行纯制。此等标准方法包括色谱法(如离子交换、亲和、以及尺寸柱色谱)、离心、差示溶解度、或通过蛋白纯制中任何其他标准技术。对于免疫亲和色谱法(见实施例1)，如Sonic hedgehog的蛋白可通过将其结合在亲和柱上来分离，该亲和柱包含抗Sonic hedgehog的抗体或者相关蛋白，然后固定在固定载体上。或者，在蛋白上连接亲和标记物如六组氨酸、麦芽糖结合域、流感包衣序列、以及谷胱甘肽S-转移酶，以更容易由合适的亲和柱中纯制。分离蛋白也可物理性地用诸如蛋白酶解、核磁共振以及X射线晶体学的技术来表征。A、片段和类似物的制备
分离蛋白的片段(如SEQ ID NOS：1-4的片段)也可通过重组法、蛋白酶解消化、或使用本领域技术人员已知的方法通过化学合成来有效地制备。在重组法中，多肽的内部或端片段可通过由编码分离hedgehog多肽的DNA序列的一个端部(对于端片段)或两个端部(对于内部片段)除去一个或多个核苷酸来产生。诱变DNA的表达产生多肽片段。用“端切”的内切核酸酶进行消化也可产生编码一系列片段的DNA。编码蛋白片段的DNA也可通过随机剪切、限制消化或其组合来产生。蛋白片段可直接由完整的蛋白产生。肽可特异性地用蛋白酶解酶断裂，包括但不限于纤溶酶、凝血酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或胃蛋白酶。这些酶对其攻击的肽键类型都是特异性的。胰蛋白酶催化水解的肽键中，羰基是碱性氨基酸的，通常为精氨酸或赖氨酸。胃蛋白酶和糜蛋白酶催化水解的羰基是芳香氨基酸的，如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。防止易受蛋白水解酶攻击的位点断裂，由此可产生另外经断裂的蛋白片段。例如，赖氨酸的ε-氨基酸基团在中等碱性溶液中与乙基三氟硫代乙酸酯反应，形成被阻断的氨基酸残基，其相邻肽键就不再对胰蛋白酶的水解作用敏感。可改性蛋白以增加对蛋白水解酶敏感的肽键。例如，用β-卤代乙胺对胱氨酸残基进行烷基化产生被胰蛋白酶水解的肽键(51)。另外，可使用在特异性残基处断裂肽链的化学试剂。例如，溴化氰在蛋氨酸残基处断裂肽(52)。因此，用各种改性剂、蛋白水解酶和／或化学试剂的组合进行处理，由此可将蛋白分裂成所希望长度的片段，其中没有片段的重叠，或者将其分裂成所希望重叠的重叠片段。
片段也可通过使用本领域中已知的技术例如Merrifield固相Fmoc或t-Boc化学(Merrifield，Recent Progress in Hormone Research 23∶451(1967))经化学方法合成。
以下将讨论用于产生和测试片段及类似物的现有技术的方法的例子。这些或类似的方法可用于制备和筛选具有生物活性的分离多肽(如hedgehog)的片段及类似物。测试hedgehog片段和类似物是否具有生物活性的示例性方法见实施例3。B、制备经改变的DNA和肽序列：随机法
蛋白的氨基酸序列变体(如SEQ ID NOS：1-4的变体)可通过随机诱变编码蛋白或其特定部分的DNA来制备。有用的方法包括PCR诱变以及饱和诱变法。也可通过合成一套简并的寡核苷酸序列来形成一系列随机的氨基酸序列变体。使用经改变的DNA和肽来产生给定蛋白的氨基酸序列变体的方法在本领域中是已知的。以下的此类方法的例子并不是用于限制本发明的范围，而仅是用于说明代表性的技术。本领域普通技术人员可认识到在此方面还可使用其他方法。PCR诱变：简言之，使用Taq聚合酶(或其他聚合酶)在DNA的克隆片段中引入随机的突变(42)。PCR条件的选择应通过使用例如5的dGTP／dATP比例并在PCR反应中添加Mn2+而用Taq DNA聚合物降低DNA合成的保真度。扩增的DNA片段集合体插入合适的克隆载体中，以形成随机的突变基因库。饱和诱变：(43)中描述了通用的方法。简言之，该技术包括通过体外化学处理或辐射单链DNA、然后合成cDNA链来产生突变。突变频率用处理的程度来调节，而基本上所有可能的碱替代都可得到。简并的寡核苷酸诱变：可由一系列简并的寡核苷酸序列产生同源性肽库。简并序列的化学合成可在自动DNA合成仪中进行，然后将合成的基因连接在合适的表达载体中。例如参见(44、45)以及Itakura等人(Recombinant DNA，Proc．3rd Cleveland Symposium on Macromolecules，pp．273-289(A．G．Waltong编辑)，Elsevier，Amsterdam，1981)。C、经改变的DNA和肽序列的制备：直接法
非随机或直接的诱变可在编码分离肽的多核苷酸序列的特异性部分中产生特异性的序列或突变，以形成包括缺失、插入、或替换分离肽之已知氨基酸序列的残基的变体。突变位点可单独或系列地如下进行改变：(1)首先根据要达到的结果用保守的氨基酸、然后用更多的游离基选择进行替换；(2)删除目标残基；或(3)在邻近位点插入相同或不同类别的残基，或者组合上述选择1-3。
为清楚起见，此等位点直接法是其中可将N-端胱氨酸(或其功能类似物)引入给定的多肽序列中的方法，以形成用于疏水性基团的连接位点。丙氨酸扫描诱变：该方法局限于那些对于诱变而言为优选位点的所希望的蛋白的残基或区域(46)。在丙氨酸筛选中，可选择该残基或目标残基组并用丙氨酸替换。该替换可影响氨基酸与相邻氨基酸和／或与周围含水或膜环境的相互作用。那些对替换具有官能敏感性者可通过在其他位点处引入其他变体来精制。寡核苷酸介导的诱变：该方法的一个版本可用于制备DNA的替换、缺失、以及插入变体(47)。简言之，通过杂交编码DNA突变的寡核苷酸引物成为通常为单链质粒或噬菌体的DNA模板来改变所希望的DNA，所述质粒或噬菌体包含所希望之蛋白(例如hedgehog蛋白)的未经改变或野生型的DNA序列模板。杂交后，用DNA聚合酶制备第二和补偿性的模板DNA链，其将插入寡核苷酸引物，然后在所希望的DNA序列中编码所选择的改变。通常情况下使用链长至少为25个核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸具有12-15个核苷酸，这些核苷酸完全补偿在突变一侧上的模板。这确保寡核苷酸将适当地杂交成单链DNA模板分子。盒式诱变：该方法(48)需要包含待突变的蛋白亚单元DNA的质粒或其他载体。鉴别在蛋白亚单元DNA中的编码子，然后在经鉴别的突变位点的各侧上插入独特的限制性内切核酸酶，其中使用上述涉及寡核苷酸的诱变法。接着在这些位点处剪切质粒，使其线性化。编码在限制位点之间但包含所希望之突变的DNA序列的双链寡核苷酸使用标准方法合成。两个链单独合成，然后使用标准法杂交在一起。该双链寡核苷酸是“盒”，而且其具有与线性质粒两端相配适的3＇和5＇端，使得它能够直接连接于其中。质粒现在包含突变的所希望的蛋白亚单元DNA序列。组合透变：在该方法的一个版本中(Ladner等人，WO88／06630)，同源物或其他相关蛋白组的氨基酸序列进行比较，优选促进尽可能最高的同源性。出现在对比序列的给定位置处的所有氨基酸可进行选择，以产生简并的组合序列。在核酸水平上进行组合诱变，由此产生不同的基因库。例如，合成寡核苷酸的混合物可用酶连接在基因序列中，以使简并的潜在序列如单独的肽一样可被表达，或者如包含整个简并序列的蛋白一样。D、分离多肽的其他变体
本发明中包括的分离分子是：等位变体、天然突变体、诱导突变体、以及用DNA编码的蛋白，所述DNA在高或低严格条件下杂交成核酸，该核酸编码诸如Sonic hedgehog(SEQ ID NO：1)的N-端片段的多肽以及特异性通过针对hedgehog肽的抗血清、特别是通过针对hedgehog的活性位点或结合位点的抗血清而结合的多肽。在此所述的所有变体期望：(1)保留原始蛋白的生物功能；以及(2)保留连接至疏水性基团(如脂质)上的能力。
本发明方法的特征还在于分离肽如hedgehog的片段、优选生物活性片段或类似物的用途。具体而言，生物活性片段或类似物是具有体内或体外活性者，该活性是SEQ ID NOS：1-4所示肽或者其他天然分离hedgehog的特征。更优选的是，疏水性改性的片段或类似物在体内或体外实验中具有至少10％、优选40％或更多、或最优选至少90％的Sonichedgehog活性(见实施例3)。
类似物与天然的分离蛋白的不同之处在于氨基酸序列或者不涉及序列或者这两个方面。本发明最优选的多肽具有优选的非序列改性，其包括体内或体外化学衍生化(如其N-端的衍生化)，以及有可能的乙酰化、甲基化、磷酰化、酰胺化、羧基化或糖苷化的变化。
其他类似物包括诸如Sonic hedgehog的蛋白或其生物活性片段，其序列与野生型共有序列(如SEQ ID NO：4)的不同在于一个或多个保守性氨基酸替换或者一个或多个非保守性的氨基酸替换、或者不消除分离蛋白之生物活性的缺失或插入。保守性替换通常包括用具有类似特征的其他氨基酸替换其中的一个氨基酸，如以下组中的替换：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性的疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。其他保守性的替换对于本领域技术人员是已知的。例如，对于丙氨酸，保守性的替换可选自于D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-胱氨酸和D-胱氨酸。对于赖氨酸，替换可以是D-赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、高精氨酸、蛋氨酸、D-蛋氨酸、鸟氨酸、或D-鸟氨酸中的任何一种。
通常情况下，可用于在分离多肽的功能性质中诱导产生变化的替换如下：(ⅰ)极性残基，如丝氨酸或苏氨酸，用于替换或者被疏水性残基如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸替换；(ⅱ)胱氨酸残基用于替换或者被任何其他的残基(见实施例10)替换；(ⅲ)具有正电性侧链的残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸，用于替换或者被具有负电性侧链的残基如谷氨酸或天冬氨酸替换；或者(ⅳ)具有大的侧链的残基如苯丙氨酸用于替换或者被不具有此等侧链的残基如赖氨酸替换。
可用于本发明方法中的其他类似物是具有可增加肽的稳定性的改性者。此等类似物可在肽序列中包括例如一个或多个非肽键(其替换肽键)。其还包括：包含除天然L-氨基酸以外的残基的类似物，例如D-氨基酸或非天然或合成的氨基酸，如β或γ氨基酸和环状类似物。在分离的hedgehog多肽中插入D-氨基酸代替L-氨基酸可以增加其对蛋白酶的耐受性。参见第5，219，990号美国专利(同上)。
适用于分离的hedgehog类似物的术语“片段”可与单个氨基酸一样大小，其条件是保留生物活性。其在长度是可以是至少约20个残基、更通常至少约40个残基、优选至少约60个残基。片段可用本领域技术人员已知的方法来产生。候选片段具有分离hedgehog的生物活性的能力也可用在此所述的本领域已知的方法来评估。ⅴ、制备疏水性衍生物
本发明的发明者发现，增加信号蛋白如hedgehog蛋白的整体疏水性可增加该蛋白的生物活性。信号蛋白如hedgehog的效力可如下增加：(a)化学改性，例如在N-端胱氨酸的巯基和／或α-胺上添加疏水性基团(实施例8和9)；(b)用疏水性氨基酸替换N-端胱氨酸(实施例10)；或者(c)用不同的氨基酸替换N-端胱氨酸，然后化学改性经替换的残基，以在替换位点处增加疏水性基团。
另外，通过(a)用疏水性氨基酸替换内部残基；或者(b)用不同的氨基酸替换内部残基、然后化学改性经替换的残基，以在替换部位处添加疏水性基团(见实施例10)，由此在蛋白表面上的内部残基处用疏水性基团改性蛋白如hedgehog蛋白，这将维持或者增强蛋白的生物活性。
再者，通过(a)用疏水性氨基酸替换C-端残基；或者(b)用不同的氨基酸替换C-端残基、然后化学改性经替换的残基，以在替换部位处添加疏水性基团，由此在C-端处用疏水性基团改性蛋白如hedgehog蛋白，这将维持或增强蛋白的生物活性。
有很多可用于衍生hedgehog多肽的亲脂性基团。亲脂性基团例如是具有约7-30个碳原子的相对较长的烷基或环烷基(优选正烷基)。烷基可以用羟基或伯胺“尾”作为端部。为进一步说明，亲脂性分子包括天然及合成的芳香和非芳香基团如脂肪酸、酯和醇，其他脂质分子，笼结构如金刚烷和富勒烯，以及芳香烃如苯、北、菲、蒽、萘、芘、屈和并四苯。
特别有用的亲脂性分子是脂族环烃、饱和及不饱和脂肪酸以及其他脂质和磷脂基团、蜡、胆固醇、类异戊二烯、萜和多脂族环烃如金刚烷和富勒烯、维生素、聚乙二醇或寡聚乙二醇、(C1-C18)-烷基磷酸二酯、-O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-烷基、以及特别是与芘衍生物的结合物。亲脂性基团可以是适合用于本发明中的亲脂性染料，其包括但不限于二苯基己三烯、Nile红、N-苯基-1-萘胺、Prodan、Laurodan、芘、北、罗丹明、罗丹明B、四甲基罗丹明、Texas红、硫罗丹明、1，1′-双十二烷基-3，3，3＇，3＇-四甲基indo羰花青高氯酸盐、十八烷基罗丹明B以及可以从Molecular Probes Inc．得到的BODIPY染料。
其他示例性的亲脂性基团包括脂族羰基，其包括1-或2-金刚烷基乙酰基、3-甲基金刚烷-1-基乙酰基、3-甲基-3-溴-1-金刚烷基乙酰基、1-萘烷乙酰基、樟脑乙酰基、莰烷乙酰基、降金刚烷基乙酰基、降冰片烷乙酰基、二环[2．2．2．]-辛-5-烯乙酰基、1-甲氧基二环[2．2．2]-辛-5-烯-2-羰基、cis-5-降冰片烯-内-2，3-二羰基、5-降冰片烯-2-基乙酰基、(1R)-(-)-桃金娘烯烷乙酰基、2-降冰片烷乙酰基、抗-3-氧-三环[2．2．1．0<2，6>]-庚烷-7-羰基、癸酰基、十二烷酰基、十二烷烯酰基、十四烷二烯酰基、癸炔酰基或十二炔酰基。
示例性疏水性改性的结构见图12所示。如果在具体的位置处没有合适的氨基酸，则使用位点针对性的诱变，以在该位点处设置反应性氨基酸。反应性氨基酸包括胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、精氨酸、蛋氨酸、以及色氨酸。可使用诱变以在N-或C-端或者在内部位置处设置反应性氨基酸。
例如，我们发现，可化学改性生物活性蛋白如hedgehog蛋白的N-端胱氨酸，或者全部消除N-端胱氨酸并仍保留蛋白的生物活性，其条件是改性或替换的活性基团是疏水性的。发明者已发现，hedgehog的生物活性的增强大致与改性基团的疏水性有相关关系。除增强蛋白的活性外，改性或替换N-端胱氨酸可消除在蛋白的制备、纯制、配制和储存期间发生胱氨酸之非所希望的交叉反应和／或改性。N-端胱氨酸的硫醇具有非常强的反应性，这是因为其靠近α-胺，降低了胱氨酸的pKa，并增加了在中性或酸性pH时反应性硫醇离子的质子解离和形成。
我们已经证实，用疏水性氨基酸替换hedgehog的N-端胱氨酸可在以细胞为基础的信号实验中得到效力增加的蛋白。通过替换胱氨酸，该方法消除了抑制在蛋白的制备、纯制、配制和储存期间发生胱氨酸之非所希望的其他改性的问题。该方法的通性用我们以下的发现来支持：三种不同的疏水性氨基酸，苯丙氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸，分别产生更具活性的hedgehog。因此，用任何其他疏水性的氨基酸替换胱氨酸应可产生活性的蛋白。另外，因为我们已在C3H10T1／2实验中发现氨基酸或活性改性基团的疏水性与相应经改性的蛋白效力之间的相关关系(如Phe＞Met，长链脂肪酸＞短链脂肪酸)，所以可认为在hedgehog序列上添加更多的疏水性氨基酸可增加蛋白的效力，超过添加单个氨基酸所达到的水平。的确，在C3H10T1／2实验中，与仅添加单个异亮氨酸(见实施例10)的突变体相比，在人Sonic hedgehog的N-端上添加两个连续的异亮氨酸残基可使效力增加。因此，在表面环状结构中于hedgehog蛋白的N-端或C-端或者这些位置的一些组合处添加疏水性氨基酸，可预期产生活性更高的蛋白。经替换的氨基酸不必是20种常见氨基酸中的一种。对于在蛋白的特定位点处替换非天然的氨基酸的方法已有报道(78、79)，而且如果氨基酸的疏水性更强、更耐受酶解攻击、或者可用于进一步在体内针对hedgehog蛋白的特殊位点，这将是非常有利的，而后一种情况可使活性更强或更具特异性。非天然的氨基酸可在体外翻译过程中插入在蛋白的特殊位点处，而且在体内产生更大规模地形成此等经改性蛋白的系统的方法已有报道。
出乎意料的是，如hedgehog蛋白的蛋白根据本发明改性后仍可保留其生物活性。首先，N-端胱氨酸在所有已知的hedgehog蛋白序列中都被保留，包括鱼、蛙、昆虫、鸟和哺乳动物。因此，有理由相信N-端胱氨酸的巯基对于蛋白的结构或活性是非常重要的。第二，由于酶解断裂或突变成亲水性氨基酸(如天冬氨酸或组氨酸)，缺乏N-端胱氨酸的hedgehog蛋白在以细胞为基础的C3H10T1／2实验中是无活性的，该实验描述于实施例3中。
有许多改性N-端胱氨酸的方法可保护硫醇并添加疏水性基团。这些改性法将在以下详细讨论。本领域技术人员能够确定何种改性对于具体的治疗应用是最合适的。影响此等选择的因素包括生产、纯制和配制的成本和难易程度、溶解度、稳定性、效力、药物动力学和药代动力学、安全性、免疫原性以及组织靶向。A、原始氨基酸序列的化学改性
可用本领域技术人员已知的许多种方式进行N-端胱氨酸的化学改性，以保护硫醇，并用疏水性基团同时活化。巯基基团，其中以硫醇离子作为活性种类，在蛋白中是最具有反应性的官能团，有许多试剂可比任何其他基团更快地与硫醇反应。见：有关蛋白结合与交联的化学(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking)(S．S．Wong，CRCPress，Boca Raton，FL，1991)。N-端胱氨酸的硫醇可在所有hedgehog蛋白中发现，并认为比序列中的内部胱氨酸具有更高的反应性。这是因为接近α-胺将降低硫醇的pKa，使得反应性硫醇离子在中性或酸性pH时产生更大的解离度。另外，结构N-端的胱氨酸比hedgehog序列中的其他两个胱氨酸更易于暴露，所述其他两个胱氨酸发现被埋在蛋白结构中。我们已经证实，N-端胱氨酸仅在与N-乙基马来酰亚胺于pH5．5反应1小时(见实施例9)、以及在与N-异丙基碘代乙酰胺于pH7．0反应18小时(见实施例9)后才被改性。该方法的其他例子是与其他α-卤代乙酰基化合物、有机汞、二硫化物试剂、以及其他N-取代的马来酰亚胺的反应。这些活性种类的多数疏水性衍生物都可市售得到(如碘乙酸乙酯(Aldrich，Milwaukee WI)、二硫二苯(Aldrich)、和N-芘马来酰亚胺(Molecular Probes，Eugene OR))或可容易地合成(如N-烷基碘代乙酰胺(84)、N-烷基马来酰亚胺(85)、和有机汞化合物(86))。我们已经表明，人Sonic hedgehog的N-端胱氨酸可特异性地用N-异丙基碘代乙酰胺改性，而且在C3H10T1／2实验中，经疏水性改性的蛋白的效力比未经改性的蛋白高2倍(见实施例9)。可以认为，用长链烷基碘代乙酰胺衍生物改性Shh可产生具有更高效力的经改性的蛋白。此等N-烷基碘代乙酰胺可容易地通过使用市售起始物由本领域普通技术人员合成得到。
N-端胱氨酸的反应性的其他方面是可参与对于其1，2-氨基硫醇构型而言为独特的反应化学中。一个例子是与硫酯基团反应通过硫酯的快速S-N迁移形成N-端酰胺基团。该反应化学可与合成肽一起偶联，并可用于通过合适的活化肽添加单个或单个、天然或非天然的氨基酸或其他疏水性基团。在此所示的另一个例子是与醛反应形成噻唑烷加成物。硫醇酯(如C2-C24饱和及不饱和脂肪酰基辅酶A酯(SigmaChemical Co．，St．Louis MO))、醛(丁醛、正癸醛以及正十二烷基醛(Aldrich))和酮(如2-、3-和4-癸酮(Aldrich))的许多疏水性衍生物都可市售得到或者可容易地合成(87、88)。按照类似的方式，实施例9中所述的以1-溴-2-丁酮化学为例说明的硫代吗啉衍生物可由各种α-卤代酮起始物制备(88)。因为很容易发现改性N-端胱氨酸或者任何蛋白中的胱氨酸之硫醇的替代方法，我们并不希望囿于在此所述的具体实施例。
蛋白的α-胺相对于蛋白中的其他胺优选改性，这是因为在中性或酸性pH时其较低的pKa产生更大量的反应性未质子化的形式。我们已经表明，用长链脂肪酰胺基团改性N-端胺能够在保持游离胱氨酸硫醇基团的同时活化hedgehog蛋白至两个数量级(见实施例8)。因此，针对优选与N-端胺反应的化学也可用于增加hedgehog蛋白的效力。已知芳基卤、醛和酮、酸酐、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、酰卤、N-羟基琥珀酰亚胺基(如硫-NHS-乙酸酯)、硝基苯基酯、酰基咪唑、和其他活化酯能够与胺官能团反应。
用某些其他氨基酸替换hedgehog的N-端胱氨酸时，也可使用其他化学方法，以在N-端上添加疏水性基团。一个例子是在N-端添加丝氨酸或苏氨酸，氧化该氨基酸形成醛，然后在蛋白上连接包含1，2氨基硫醇结构(如胱氨酸)的化学基团。第二个例子是在N-端添加组氨酸，以偶联至C-端的硫代羧酸。其他氨基酸的化学改性
对于改性许多其他氨基酸有具体的化学方法。因此，用于合成活性更高形式之hedgehog的其他途径是可化学性地将疏水性基团连接在hedgehog中除N-端胱氨酸以外的氨基酸上。如果在所希望的位置处没有合适的氨基酸，可使用位点针对性的诱变，以在hedgehog结构的该位点处添加反应性氨基酸，而无论在N-端或C-端或其他位置处。反应性氨基酸包括胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、精氨酸、蛋氨酸、和色氨酸。因此，增加hedgehog的疏水性的目的可通过许多化学方法来实现，而且我们不希望用具体的化学或者改性位点来限制，这是因为我们的结果支持该方法的通用性。可用多种方法将hedgehog多肽连接在疏水性基团上，包括化学偶联法或基因工程法。
为说明起见，有大量的化学交联剂对于本领域普通技术人员是已知的。对于本发明，优选的交联剂是杂双官能交联剂，其可用于分步连接hedgehog多肽和疏水性基团。杂双官能交联剂对于结合蛋白具有设计更特异性偶联方法的能力，并由此降低发生非所希望的副反应如均蛋白聚合物的可能性。在本领域中已知有许多的杂双官能交联剂。它们包括：琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸]己酸酯(LC-SPDP)。那些具有N-羟基琥珀酰亚胺基团的交联剂可以N-羟基磺基琥珀酰亚胺类似物来得到，该类似物通常具有更大的水溶解度。另外，那些在连接链中具有二硫桥的交联剂可以烷基衍生物的形式来合成，以降低体内连接剂的断裂量。
除杂双官能交联剂外，还有许多其他交联剂，包括同双官能和光反应性交联剂。在本发明中，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、和二甲基庚二酰胺酸酯·2HCl(DMP)是有用的同双官能交联剂的例子，而二-[β-(4-叠氮基水杨酸酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)和N-琥珀酰亚胺基-6-(4＇-叠氮基-2＇-酰基苯基-氨基)己酸酯(SANPAH)是有用的光反应性交联剂的例子。对于最近的蛋白偶联技术的综述，可参见Means等人(1990)BioconjugateChemistry 1：2-12，其在此并入作为参考。
一类特别有用的杂双官能交联剂，包括上述物质，含有伯胺反应基团、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、或其水溶性类似物N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)。在碱性pH时，伯胺(赖氨酸ε基团)是未质子化的，而且可通过亲核攻击NHS或磺基-NHS酯来反应。该反应导致酰胺键的形成，而且以副产物的形式释放NHS或磺基-NHS。
作为杂双官能交联剂一部分的其他反应性基团是硫醇反应性基团。通常的硫醇反应性基团包括马来酰亚胺、卤素、以及吡啶基二硫化物。马来酰亚胺特异性地在略酸性至中性(pH6．5-7．5)的条件下于几分钟内与游离的巯基(胱氨酸残基)反应。卤素(碘乙酰基官能团)在生理pH条件下与-SH基团反应。这些反应性基团导致稳定硫醚键的形成。
杂双官能交联剂的第三个组分是间隔臂或桥。该桥是连接两个反应端的结构。桥的最明显贡献是其对立体障碍的作用。在某些情况下，较长的桥可更容易跨过连接两个复杂双分子所必须的距离。例如，SMPB具有14．5埃的跨度。
使用杂双官能试剂制备蛋白-蛋白结合物是涉及胺反应和巯基反应的两步骤法。对于第一步骤的胺反应，所选择的蛋白应包含伯胺。这可以是存在于大多数蛋白的N-端上的赖氨酸ε胺或伯α胺。该蛋白不应包含游离巯基。如果待结合的两个蛋白都包含游离巯基，则可用例如N-乙基马来酰亚胺改性其中一个蛋白以使所有巯基都被阻断(见Partis等人(1983)J．Pro．Chem．2：263，其在此并入作为参考)。可使用Ellman试剂来计算具体蛋白中的巯基量(例如参见Ellman等人(1958)Arch．Biochem．Biophys．74：443以及Riddles等人(1979)Anal．Biochem．94：75，它们在此并入作为参考)。
反应缓冲液应是无外源胺和巯基的。反应缓冲液的pH应为7．0-7．5。该pH范围防止马来酰亚胺基团与胺反应，保护马来酰亚胺基团与巯基的第二反应。
包含NHS酯的交联剂具有有限的水溶解度。在将交联剂引入至反应化合物之前，它们应溶解在最小量的有机溶剂(DMF或DMSO)中。交联剂／溶剂形成乳剂，其使反应发生。
磺基-NHS类似物更易溶于水，并可直接添加在反应缓冲液中。高离子强度的缓冲液应避免，这是因为它们具有使磺基-NHS酯“盐析”的趋势。为避免由于水解导致的反应性丢失，在溶解蛋白溶液后立即将交联剂添加至反应混合物中。
在浓的蛋白溶液中反应是更有效的。反应混合物的pH越趋于碱性，则反应速率越快。NHS和磺基-NHS酯的水解速率也随pH增加而增加。更高的温度将增加水解和酰基化的反应速率。
一旦反应完成，立即用巯基反应基团活化第一个蛋白。经活化的蛋白可通过简单的凝胶过滤或透析由反应混合物中分离。为实施交联的第二步，即、巯基反应，所选用于与马来酰亚胺、活化卤素或吡啶基二硫化物反应的亲脂性基团必须包含游离巯基。或者，可通过添加巯基来改性伯胺。
在所有情况下，缓冲液应脱气，以防止巯基被氧化。可添加EDTA以螯合任何存在于缓冲液中的氧化性金属。缓冲液应不含任何包含巯基的化合物。
在略酸性-中性pH范围(pH6．5-7．5)马来酰亚胺特异性地与-SH基团反应。中性pH对于涉及卤素和吡啶二硫化物的反应是足够的。在此条件下，马来酰亚胺通常在几分钟内与-SH基团反应。对于卤素和吡啶基二硫化物则需要更长的反应时间。
在胺反应步骤中制得的第一巯基反应性蛋白与包含巯基的亲脂性基团在合适的缓冲条件下混合。结合物用诸如凝胶过滤或透析等的方法从反应混合物中分离。
对于结合反应，示例性的活化亲脂性基团包括：N-(1-芘)马来酰亚胺、2，5-二甲氧基芪-4＇-马来酰亚胺、曙红-5-马来酰亚胺、荧光素-5-马来酰亚胺、N-(4-(6-二甲基氨基-2-苯并呋喃基)苯基)马来酰亚胺、苯酮-4-马来酰亚胺、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4＇-马来酰亚胺(DABMI)、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺、四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺、罗丹明红TM C2马来酰亚胺、N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺三氟乙酸盐、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐、Oregon绿TM488马来酰亚胺、N-(2-((2-(((4-叠氮基-2，3，5，6-四氟)苯甲酰基)氨基)乙基)二硫基)乙基)马来酰亚胺(TFPAM-SSl)、2-(1-(3-二甲基氨基丙基)-吲哚-3-基)-3-(吲哚-3-基)马来酰亚胺(二吲哚基马来酰亚胺；GF 109203X)、BODIPY_FL N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺、N-(7二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)马来酰亚胺(DACM)、AlexaTM 488 C5马来酰亚胺、AlexaTM 594 C5马来酰亚胺钠盐、N-(1-芘)马来酰亚胺、2，5-二甲氧基芪-4′-马来酰亚胺、曙红-5-马来酰亚胺、荧光素-5-马来酰亚胺、N-(4-(6-二甲基氨基-2-苯并呋喃基)苯基)马来酰亚胺、苯酮-4-马来酰亚胺、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4＇-马来酰亚胺、1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)恶唑-2-基)甲磺酸吡啶翁、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺、四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺、罗丹明红TM C2马来酰亚胺、N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺、N-(2-((2-(((4-叠氮基-2，3，5，6-四氟)苯甲酰基)氨基)乙基)二硫基)乙基)马来酰亚胺、2-(1-(3-二甲基氨基丙基)-吲哚-3-基)-3-(吲哚-3-基)马来酰亚胺、N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)马来酰亚胺(DACM)、11H-苯并[a]芴、苯并[a]芘。
在一个实施方案中，hedgehog多肽可使用芘马来酰亚胺来衍生化，后者可从Molecular Probes(Eugene，Oreg．)购得，例如N-(1-芘)马来酰亚胺或1-芘甲基碘乙酸酯(PMIA酯)。如图1所示，芘衍生的hedgehog蛋白的活性曲线表明，其活性比未经改性蛋白的活性高2个数量级。B、制备疏水性肽衍生物
根据本发明，也可使用疏水性肽来改性蛋白。在此所用术语“肽”包括至少一个氨基酸残基的序列。优选的是，肽的长度在1个氨基酸和18-26个氨基酸之间，后者是蛋白的膜跨越片段的典型长度。为增加蛋白的疏水性，氨基酸主要从以下疏水性氨基酸中选择：苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、丙氨酸、脯氨酸、和酪氨酸。疏水性肽也可包含具有疏水性特征或D-氨基酸、类肽键、N-端乙酰化或降低肽易被酶解的其他特征的非天然氨基酸类似物。在蛋白的具体位点处替换非天然氨基酸的方法是已知的(78、79)。
通常情况下，疏水性肽悬挂在蛋白的各种位点上。一个位点可以是N-端残基。或者，疏水性肽在N-端残基处被替换。在另一个实施方案中，疏水性肽悬挂在蛋白的C-端。或者，疏水性肽在C-端残基处被替换。C-端可以是天然的C-端氨基酸，但也可以是经剪切的蛋白的C-端，以将疏水性肽悬挂在经剪切的蛋白的最终C-端氨基酸上，其也被称为“C-端”。经剪切的hedgehog蛋白在天然C-端序列中有最多11个氨基酸缺失时仍可保留活性。疏水性肽也可插在N-端残基和紧邻N-端残基的内部残基之间，或者在C-端残基和紧邻C-端残基的内部残基之间，或者在两个内部残基之间。
在某个实施方案中，亲脂性基团是两亲性多肽，如爪蟾抗菌肽、杀菌肽、attacin、马耳他素、短杆菌肽S、Staph．Aureus的α-毒素、丙甲甘肽或者合成的两亲性多肽。病毒颗粒的融合包衣蛋白也可以是本发明hedgehog蛋白的两亲性序列的常规来源。C、制备脂质衍生物
本发明所包括的另一种形式的蛋白是用各种脂质基团衍生的蛋白。通常情况下，“脂质”是不同来源的疏水性物质的一员，这些物质的特征是在有机溶剂中有各种溶解度，但在水中大部分都是不溶性的。本发明包括的主要脂质类别是脂肪酸和固醇(如胆固醇)。本发明的衍生蛋白包含环状、非环状(如直链的)、饱和或不饱和的、单羧酸的脂肪酸。示例性的饱和脂肪酸具有以下通式：CH3(CH2)nCOOH。下表列出了可使用常规化学方法来衍生化的一些脂肪酸的例子。表2：示例性饱和及不饱和脂肪酸饱和脂肪酸：CH3(CH2)nCOOHN的值普通名称2丁酸4己酸6辛酸8癸酸10月桂酸12肉豆蔻酸*14棕榈酸*16硬脂酸*18花生酸*20二十二烷酸22二十四烷酸不饱和脂肪酸：CH3CH=CHCOOH巴豆酸CH3(CH2)3CH=CH(CH2)7COOH肉豆蔻油酸*CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH棕榈油酸*CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH油酸*CH3(CH2)3(CH2CH=CH)2(CH2)7COOH亚油酸CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7COOH亚麻酸CH3(CH2)3(CH2CH=CH)4(CH2)3COOH花生四烯酸星号(*)表示我们在由可溶性结构分泌的重组hedgehog蛋白中发现的脂肪酸。
可连接在蛋白上的其他脂质包括支链脂肪酸以及磷脂基的脂肪酸，如磷脂酰肌醇(如磷脂酰肌醇4-单磷酸酯和磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、和类异戊二烯如法尼基或香叶基。
我们已经证实，脂质改性的hedgehog蛋白可由天然物质进一步纯制，或者可通过化学改性可溶性且未经改性的蛋白得到。对于从天然物质中纯制得到的蛋白，我们表明如果在昆虫细胞中表达全长的人Sonichedgehog(Shh)并组合使用SP-Sepharose色谱和免疫亲和色谱法从经洗涤剂处理的细胞中纯制膜结合的Shh，则经纯制的蛋白在还原SDS-PAGE凝胶上以一条明显的带移动，其表观质量为20kDa(见实施例1)。用反相HPLC可容易地辨别可溶性的、膜结合的Shh蛋白，而结合形式却随后在乙腈梯度中洗脱出来(见实施例1和图3)。我们还表明，人Sonichedgehog以两种形式结合在细胞膜上，一种形式包含胆固醇，并因而类似于以前对Drosophila hedgehog(18)报道的数据，而第二种新的形式包含胆固醇和棕榈酸改性基团。可溶且结合形式的Shh用电子喷射质谱进行分析，其中使用三联四极质谱仪，并装配有电子喷射离子源(实施例1)，还可用液体色谱-质谱进行分析(见实施例1)。由内切蛋白酶Lys-C消化的结合Shh中鉴别N-端肽可用MALDI PSD质谱测量飞行质谱仪的MALDI时间来证实。棕榈酰化的位点通过肽作图和序列分析的组合法来鉴别，而且是在蛋白的N-端(SEQ ID NOS：1-4中成熟蛋白序列的残基1)。两种结合形式在C3H10T1／2碱性磷酸酯酶实验中的活性是相同的，但令人感兴趣的是，都比缺乏结合基团的可溶性人Shh的效力高约30倍。脂质改性对Shh与其受体patched的表观结合亲和性没有显著的影响(图7)。
我们接下来通过在C3H10T1／2细胞上分析可溶性且结合的Shh单独或者在有抗hedgehog中和Mab 5E1存在时的碱性磷酸酯酶诱导作用检验了衍生形式的实用性。另外，在patched转染的EBNA-293细胞上用FACS分析评估了可溶性且结合的Shh对结合patched的相对效力(实施例3)。
对于通过化学改性可溶的且未经改性的蛋白而得到的脂质改性蛋白，我们已表明，棕榈酸和其他脂质可添加在可溶性Shh上以产生经脂质改性形式，其在C3H10T1／2实验中具有更强的效力(实施例8)。我们已经表明(实施例1、2和8)，N-端胱氨酸上的硫醇和α-胺有助于脂质衍生化反应。不希望囿于任何具体的理论，蛋白上的脂质改性以形成硫酯中间体开始，脂质基团然后通过形成环形中间体转移至N-端的α-胺上。通常情况下，反应性脂质基团因此可为饱和或不饱和羧酸的硫酯形式如辅酶A硫酯。此等物质以及它们的衍生物可包括例如市售的辅酶A衍生物，如棕榈酰油酰辅酶A、二十烷酰辅酶A、二十碳四烯酰辅酶A、月桂酰辅酶A等。这些物质可容易地由Sigma ChemicalCompany(St．Louis，MO．，1998 catalog pp．303-306)得到。
已分析了不同的脂质基团对hedgehog蛋白的功能活性的影响(见实施例8以及图10和11)。类似地，使用本领域技术人员已知的方法可方便地测试不同的脂质基团对如上述部分Ⅲ中所述的其他蛋白的功能活性的影响。例如，使用本领域已知的方法已完成了根据本发明进行脂质改性的凝溶胶蛋白(50)、各种干扰素(干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ)、各种自介素(如IL-1、-2、-3、-4、等等)、肿瘤坏死因子-α和-β、以及其他生长因子的功能测试。
虽然我们已确立了可将脂肪酸连接在hedgehog蛋白的N-端胱氨酸上的化学方法，但仍可预期脂质可使用酶促反应连接在相同或其他位点上。蛋白的体内棕榈酰化是由一类称为棕榈酰辅酶A：蛋白S-棕榈酰转移酶的酶来催化的。使用经纯化的酶时，蛋白底物的体外酰化已被证实(80、81)。棕榈酰转移酶的底物特异性尚未被彻底定义；细胞和病毒蛋白的棕榈酰化位点的分析在包围经改性的胱氨酸残基的共有序列中几乎没有，但是表明在胱氨酸的两个氨基酸内共同存在赖氨酸或精氨酸残基以及接近胱氨酸的大且疏水性氨基酸。Shh的氨基端序列CGPGRGFG可与该共有序列相匹配，并用作棕榈酰化的识别位点。
作为一个替代方案，hedgehog蛋白氨基端的肉豆蔻酰化可使用N-肉豆蔻酰基转移酶(NMT)来进行，该酶的许多种已在哺乳动物(82)和酵母(83)中被表征。N-肉豆蔻酰基转移酶的识别位点可引入hedgehog N-端序列中，以有利于酶的识别。这些策略需要使用脂肪酰基-辅酶A衍生物作为底物，如同在实施例8中所述用于人Sonichedgehog的非酶促脂肪酰化。另外，具有经引入的识别序列的蛋白可在合适的细胞系中表达时进行肉豆蔻酰化。用疏水性基团改性蛋白如hedgehog的其他方法是增加识别位点，以在蛋白的C-端添加类异戊二烯基团。法尼基和香叶基-香叶基添加的识别位点是已知的，而且蛋白可在真核细胞中表达时进行改性(Gelb等人，Cur．Opin．Chem．Biol．2：40-48(1998))。Ⅵ、多聚蛋白复合物
在此所述的疏水性改性的蛋白特别适合于被制成多聚蛋白复合物。本发明的多聚蛋白复合物包括任选通过它们的疏水性基团(如脂质)连接在小泡上的蛋白。小泡可以是天然形成的生物膜、由天然物质纯制得到的，或者小泡是合成的结构。优选的小泡是基本上由两亲性物质如表面活性剂或磷脂制成的球形结构。这些球形小泡的脂质通常组织成具有一个或更多个结构层的脂质形式，如多层小泡(多个洋葱形壳的脂质双层，其中在双层之间包含水性体积)或微团。
具体而言，脂质体是基本上由各种类型的脂质、磷脂、以及辅助性的亲脂性成分组成的小的球形小泡。这些成分通常排列成双层形式，类似于生物膜的脂质排列。
典型情况下，成分脂质或类脂分子的极性端与包围溶液相接触，通常为水溶液，而脂质或类脂分子的非极性疏水性端与其他脂质或类脂分子的非极性疏水性端相接触。所形成的双层膜(如小泡)可选择性地透过具有某些尺寸、疏水性、形状和净电荷的分子。大多数的小泡的性质是脂质或类脂的，但也存在其他脂质体双层结构，包括表面活性剂以及脂质或胆固醇。
脂质体小泡是特别优选的，这是因为它们可用于许多治疗、诊断、工业和商业领域。它们可用于转运不易溶于水的分子或者是需要定时释放时。因为它们可选择性地透过许多化学化合物，脂质体作为药物载体或生物材料是非常有用的。因此，脂质衍生的蛋白如hedgehog可通过掺入在脂质体小泡的脂质双层中而被制成多聚体。到达目标部位时，脂质体可降解(例如通过胃肠道中的酶)或者它们可与细胞的膜融合。
已知有几种制备小泡如脂质体的方法。制造磷脂小泡的方法是众所周知的(53)。对于常规使用方法的综述可参见(54)。更常规使用的方法是(1)超声处理包含脂质的溶液，有时然后进行蒸发／冻干和再水化(见例如Stryer，Biochemistry，第290-291页，Freeman & Co．，New York，(1988)，以及(55))；(2)均化脂质溶液，有时在高压或高剪切力下(见例如1988年5月10日颁发的第4，743，449号美国专利以及1988年6月28日颁发的第4，753，788号美国专利)；(3)水化以及有时超声处理小泡形成脂质的干燥膜，其中脂质膜是通过蒸发溶解在有机溶剂中的脂质溶液而制成的(见例如1984年6月5日颁发的第4，452，747号美国专利、1990年1月23日颁发的第4，895，719号美国专利、以及1990年8月7日颁发的第4，946，787号美国专利)；(4)冻干或蒸发和再水化(见例如1990年1月30日颁发的第4，897，355号美国专利、1988年11月5日公布的EP267，050、1988年10月11日颁发的第4，776，991号美国专利、1986年2月19日公布的EP172，007、以及1986年4月24日公布的第AU-A-48713／85号澳大利亚专利申请)；(5)溶剂注射或灌注脂质溶液于水性介质中或者相反进行(见例如(56)、1990年5月1日颁发的第4，921，757号美国专利、1988年11月1日颁发的第4，781，871号美国专利、1988年3月24日公布的WO87／02396、以及1990年1月23日颁发的第4，895，452号美国专利)；(6)喷雾干燥(见例如1986年4月24日公布的第AU-A-48713／85号澳大利亚专利申请、以及1989年5月16日颁发的第4，830，858号美国专利)；(7)过滤(见例如WO85／01161)；(8)反相蒸发(例如见(57))；以及(9)上述方法的组合(见例如(58)和(59))。
在用于制备小泡时，优选的脂质或类脂成分包括磷脂，磷脂、碱性脂质、中性脂质、脂肪酸以及它们的衍生物的混合物。优选的脂质具有以下特征：当单独分散于水中时，在超过脂质转化温度以上的温度时，它们为脂质乳剂相。在某些实施方案中，脂质是超过约12个碳原子的单脂肪链，并可以是饱和或不饱和的、或者经取代的。合适的脂质包括以下脂肪酸的酯、醇和酸形式：硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、花生四烯酸、以及其他单链脂肪酸。另外的候选者是视黄醇类物质、特别是视黄醇和视黄酸的酯、醇、和酸形式。其他优选的脂质包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)以及它们的衍生物，它们可由各种天然物质合成产生或衍生。
在某些实施方案中，小泡可立体地通常掺入聚乙二醇(PEG)或通过合成磷脂(结合在二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，见例如(61))上的PEG头部基团来稳定。优选的表面活性剂是具有良好混溶性者，如TweenTM、TritonTM。十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂硫酸钠或辛基糖苷钠。
当在表面活性剂的相转化温度以上时添加至水溶液，优选的表面活性剂形成微团。该表面活性剂可由一或多个脂肪链构成。这些脂肪链可以是饱和、不饱和、或者以其他方式取代的如乙氧基化的，典型的脂肪链包含大于约12个碳原子。其他合适的表面活性剂包括以下者：月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-、或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺基丙基-、柯卡酰胺基丙基-、亚油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-、或异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱(如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-、或异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺；甲基可可酰基或甲基油基-牛磺酸钠；以及MONAQUAT系列(Mona Industries，Inc．，Paterson，N．J．)。见实施例4。
适合用于制备多聚蛋白复合物的优选固醇和固醇酯包括胆固醇、胆甾烷醇、胆固醇硫酸酯、以及其他的胆固醇类似物和衍生物。小泡可包括许多不同的脂质和洗涤剂的事实允许在工程化具有所希望的性质的结合蛋白-小泡复合物时有很大的可变性。例如，人们可制造通过改变起始物中脂质的组成而结合不同种类的蛋白的小泡，以产生更大的小泡，或者通过增加小泡中磷脂酰肌醇脂质的百分数。Ⅶ、实用性
通常情况下，在此所述的改性蛋白可用于治疗可用未经改性的蛋白来治疗的一些病症。但是，在此所述经疏水性改性的蛋白与未经改性的形式相比具有几个显著的改进。首先，它们效力的增加使得可用更小量的蛋白在更短的时间来治疗。这对于全身和CNS应用都是非常重要的。第二，用化学反应性更低的氨基酸替换N-端胱氨酸将使临床应用的蛋白更易于制造、配制和储存。第三，蛋白的药代动力学将通过疏水性改性而改变，而这将使蛋白局限于给药部位的附近，由此通过使全身接触最小化增加了安全性，而且通过增加局部浓度增加了其效力。本发明的蛋白还可用于检测其相应受体的诊断组合物和方法中。
作为第一点的一个实施例，已经发现在全身应用后hedgehog的半衰期非常短，而且需要多次注射以达到对蛋白的强烈反应。改性形式的更高效力以及在脂质体中配制成制剂的可能性都使得用更少的治疗即可实现反应。对于CNS应用，更高的效力能够以小的体积提供直接注射于CNS中所必须的足量蛋白。
第二点的重要性是用以下事实说明的：我们已经发现hedgehog的N-端胱氨酸非常易受化学攻击，或者形成其他化学加合物或者与其他hedgehog蛋白发生氧化性二聚反应。为防止这一点，在纯制期间需要特殊的缓冲液和程序，而且在最终制剂中需要使用二硫苏糖醇。这些措施使得必须在底物模型中仔细评估制剂缓冲液的作用。
作为第三点的一个实施例，蛋白从给药部位向外扩散的范围越有限，则局部浓度越高。该更高的局部浓度因此可在治疗神经疾病期间在直接注射于所希望的脑或脊柱区域后产生更特异性的临床反应。
类似地，经改性的蛋白可局部给药于骨折部位以帮助骨折的愈合，给药于生殖腺以治疗生育性疾病，眼内给药以治疗眼疾病，以及在皮下给药以治疗皮肤病症和刺激局部毛发生长。疏水性改性的蛋白局限于给药部位因此降低了非所希望的与其他组织和器官全身接触的可能性。
对于治疗应用，本发明的疏水性改性的蛋白放入在药物学上可接受的无菌等渗制剂中，并可任选地通过本领域技术人员已知的标准方法给药。制剂优选为液体剂型，或者可以是冻干粉末。可以想象的是，多聚蛋白复合物的治疗性给药可包括掺入在此所述之衍生化的蛋白的脂质体。
本领域普通技术人员可以理解到，本发明之经疏水性改性的蛋白的具体给药、剂量、以及临床应用将取决于具体的蛋白及其生物活性而变化。
作为本发明蛋白在治疗方面的一个应用实施例，治疗性的疏水性改性的hedgehog蛋白可给药于患有各种神经病症的患者。hedgehog蛋白调节神经元在神经系统发育期间以及假设在成人时的分化的能力表明，有理由相信疏水性改性的hedgehog有利于控制成人神经元的维持、功能性能、以及正常细胞的老化；损伤细胞的修复和再生；以及预防由于某些病理病症中分化的缺失而导致的变性和早熟死亡。因此，本发明的疏水性改性的hedgehog组合物通过用局部灌注进行治疗可预防和／或减少由以下情况导致的神经疾病：(ⅰ)神经系统的的急性、亚急性或慢性损伤，包括外伤、化学损伤、血管损伤、和缺乏(如中风导致的缺血)、以及感染和肿瘤诱导的损伤；(ⅱ)神经系统的老化，包括阿耳茨海默氏病；(ⅲ)神经系统的慢性神经变性疾病，包括帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化等；以及(ⅳ)神经系统的免疫疾病，包括多发性硬化。疏水性改性的蛋白也可注射于脑髓液中，例如针对脑细胞的缺乏，或者例如针对其他组织或器官系统特异性疾病所需要的注射在淋巴系统或血液中。
本发明的hedgehog组合物可用于解救例如各种神经元免受损伤诱导的死亡以及在此等损伤后引导这些神经元再生。所述损伤可归因于以下情况(但不仅限于此)：CNS创伤性梗塞、感染、代谢性疾病、营养缺乏、以及毒性药物(例如顺铂治疗)。某些hedgehog蛋白可导致新生或增生变形的细胞，成为分裂期后或凋亡。因此，此等组合物可用于治疗例如恶性瘤、成神经管细胞瘤和神经外胚层肿瘤。
蛋白可连接在可检测标记物上，如荧光或放射性不透明物质，以及给药于宿主以发现可表达hedgehog受体的组织。该蛋白还可结合在诸如辣根过氧化物酶的物质上，该物质可用作免疫细胞化学染料，以便肉眼观察组织部分上hedgehog配体-阳性细胞的面积。本发明之疏水性改性的蛋白可单独或者以多价蛋白复合物的形式使用，用于特异性针对表达该蛋白之受体的癌症和肿瘤的医疗治疗。此等物质可通过使用它们作为抗肿瘤药物、毒素、以及细胞毒性的放射性核素如钇90的转运载体而使其作为更有效的癌症治疗剂。
毒素也可结合在疏水性改性的hedgehog(或者包含其多价复合物的小泡)上，以选择性靶向和杀死hedgehog反应性细胞，如表达hedgehog受体的肿瘤。如本领域技术人员所知晓的，其他毒素也同样是有用的。此等毒素包括但不限于：Pseudomonas外毒素、Diphtheria毒素和皂草素。该方法已被证明是成功的，因为在数量非常有限的组织中表达hedgehog受体。用于此等治疗的其他方法是使用放射性同位素标记的经疏水性改性的蛋白(或其多价复合物)。此等经放射性标记的化合物将优选靶向表达蛋白受体、稀疏正常组织的细胞中的放射活性部位。取决于所用的放射性同位素，由结合在肿瘤细胞上的放射性标记的蛋白发出的射线也可杀死附近不表达蛋白受体的恶性肿瘤细胞。可使用各种放射性核素。放射性碘(例如131I)已成功地用于针对B细胞淋巴瘤上存在的CD20的单克隆抗体(63)。
治疗中所用的蛋白组合物可根据医疗实践考虑待治疗的疾病、单独病人的病症、给药分离多肽的部位、给药方法、以及本领域技术人员已知的其他因素配制成各种制剂和剂量。可通过混合所希望纯度的蛋白、含蛋白的小泡或者衍生化的复合物与生理上可接受的载体(如在所用剂量和浓度时对接受者无毒性的载体)来制备治疗剂。
可以想象到，向部位局部给药是治疗性给药本发明蛋白的主要途径。静脉给药或通过插管或其他手术管给药也是可以想象到的。其他的途径包括片剂等、用于液体制剂的市售喷雾剂、以及吸入冻干或气雾化制剂。在由粉末制剂复原后可以使用液体制剂。
给药剂量取决于所用小泡和蛋白的性质，如结合活性和体内半衰期、制剂中小泡和蛋白的浓度、给药途径、给药部位和速率、患者的临床耐受性、患者面临的病理疾病、以及本领域技术人员已知的其他因素。通常情况下，优选每次给药的剂量为每个患者约5×10-7至5×10-9M，但该剂量取决于蛋白的性质。在一系列连续的给药期间可使用不同的剂量。
本发明还涉及一种药物制剂，其包括根据本发明改性的hedgehog蛋白和药物学上可接受的载体。在一个实施方案中，该制剂也可包括小泡。
本发明之经疏水性改性的hedgehog蛋白也可用于基因治疗方法中。
对于神经变性疾病，已知有几个动物模型具有临床预测价值。对于帕金森氏病，模型涉及啮齿动物或灵长类动物中的保护或复原，在该模型中通过全身给药MPTP或局部(颅内)给药6-羟基多巴胺(6-OHDA)(它们是两种选择性的多巴胺能毒素)损坏黑质-纹状体多巴胺能通道。具体的模型是：MPTP处理的鼠模型(64)；MPTP处理的灵长类动物(marmoset或Rhesus)模型(65)；以及单侧6-OHDA损伤鼠模型(66)。对于ALS(肌萎缩性侧索硬化)，模型涉及几个鼠系的治疗，这些鼠系表现出自发的运动神经元变性，包括wobbler(67)和pmn鼠(68)，还涉及表达人突变超氧化物酶歧化酶(hSOD)基因的转基因鼠的治疗，所述基因已连接在家族性ALS上(69)。对于脊髓损伤，最常见的模型涉及鼠的挫伤性损伤，通过标准的体重下降或者流体(水动力)损伤(70)。对于亨廷顿病，模型涉及保护鼠纹状体免受兴奋毒素(NMDA、喹啉酸、红藻氨酸、3-硝基-丙酸、APMA)损伤(71、72)。近来，还有人描述了超表达人三核苷酸的转基因鼠模型，所述三核苷酸重复地在huntingtin基因中展开(73)。对于多发性硬化，小鼠和大鼠中的EAE通过用MBP(髓鞘碱性蛋白)的免疫或者通过用MBP活化的T细胞被动转移来诱导(74)。对于阿耳茨海默氏病，相关的鼠模型是对鼠中伞-穹损伤(中隔损伤)的保护的测定，供应海马胆碱能神经支配的主神经束(75)以及超表达人β-淀粉基因的转基因鼠的使用。对于周围神经疾病，相关的模型是保护小鼠和大鼠中周围神经传导率的丢失，该丢失是化学治疗剂如紫杉醇、长春新碱和顺铂导致的(76)。
现参考以下非限制性的实施例来更具体地描述本发明。实施例1：当在昆虫细胞中表达时对人Sonic hedgehog进行脂质改性A、人Sonic hedgehog的表达
全长人Sonic hedgehog(Shh)的cDNA为亚克隆于pBluescript SK+(20)(Ontogeny，Inc．，Cambridge MA的David Bumcrot赠送)中的1．6kbEcoRI片段。根据制造商的推荐方案使用Pharmacia试剂盒通过独特的位点消除诱变添加5＇和3＇NotI位点，该位点紧邻Shh开放阅读框的侧面。然后将携带全长Shh cDNA的1．4kb NotI片段亚克隆于昆虫表达载体pFastBac(Life Technologies，Inc．)中。使用Life Technologies，Inc．提供的程序产生重组杆状病毒。所得病毒用于产生高效价的病毒原料液。制备和纯制Shh的方法如以下所述。膜伴随Shh的存在是用FACS和Western印迹分析来检查。峰值表达出现在感染后的48小时。对于Western印迹分析，由Shh感染或未感染的细胞中得到的上清液和细胞溶解产物在还原条件下在10-20％梯度凝胶上进行SDS-PAGE，电泳转移至硝基纤维素，然后用对抗N-端Shh15多肽-匙孔血蓝蛋白结合物的鼠多克隆抗血清检测Shh。细胞溶解产物通过在20mM Na2HPO4 pH6．5、1％Nonidet P-40和150mM NaCl或者20mM Tris-HCl pH8．0、50mMNaCl、0．5％Nonidet P-40和0．5％脱氧胆酸钠中于25℃下温育细胞5分钟来制备，然后在Eppendorf中于13000rpm和4℃下离心10分钟沉淀颗粒物。B、纯制膜结合的人Sonic hedgehog
在High FiveTM昆虫细胞(Invitrogen)中使用如上所述编码全长Shh的重组杆状病毒来制造膜结合形式的Shh。High FiveTM细胞在10L控制氧含量的生物反应器中于sf900 II血清培养基(Life Technologies，Inc．)中在28℃下生长。细胞在后对数期以约2×106细胞／ml在MOI为3时用病毒感染，然后在感染后48小时收集(收集时细胞的存活率大于50％)。离心收集细胞，并在10mM Na2HPO4 pH6．5、150mM NaCl pH+0．5mM PMSF中洗涤。所得细胞沉淀物(150g湿重)悬浮在1．2L的以下物质中：10mM Na2HPO4 pH6．5、150mM NaCl、0．5mM PMSF、5μM胃蛋白酶抑制剂A、10μg／ml亮抑蛋白酶肽和2μg／ml E64，然后添加120ml的10％Ttrition X-100溶液。
在冰上孵育30分钟后，离心(1500×g，10分钟)除去颗粒物。所有随后的步骤都在4-6℃下进行。用0．5M MES pH0．5的原料液(50mM最终)将上清液的pH调节为5．0，然后装在150ml SP-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia)上。该柱用300ml的5mM Na2HPO4 pH5．5、150mMNaCl、0．5mM PMSF、0．1％Nonidet P-40洗涤，然后用200ml的5mMNa2HPO4 pH5．5、300mM NaCl、0．1％Nonidet P-40洗涤，再用5mMNa2HPO4 pH5．5、800mM NaCl、0．1％Nonidet P-40洗脱结合的hedgehog。
Shh接下来在5E1-Sepharose树脂上进行免疫亲和色谱，所述树脂是通过每ml CNBr活化的Sepharose 4B树脂结合4mg抗体而制成的。SP-Sepharose洗脱池用2体积的50mM HEPES pH7．5稀释，然后将该物质负载于5E1树脂上(1小时)。将树脂收集在柱中，用10柱体积的PBS洗涤，该PBS包含0．1％氢化Trition X-100(Calbiochem)，然后用25mM NaH2PO4 pH3．0、200mM NaCl、0．1％氢化Triton X-100洗脱。洗脱流分用0．1体积的1M HEPES pH7．5中和，然后由240-340nm处的吸光度测量分析总蛋白含量，以及通过SDS-PAGE分析纯度。组分在-70℃下保存。
汇集三个亲和步骤的峰值组分，用1．3体积的50mM HEPES pH7．5、0．2％氢化Trition X-100稀释，然后再将该物质负载于5E1树脂上。将树脂收集在柱中，用3柱体积的PBS pH7．2、1％辛基糖苷(USBiochemical Corp．)洗涤，然后用25mM NaH2PO4 pH3．0、200mM NaCl、1％辛基糖苷洗脱。如上所述中和并分析洗脱组分，汇集、由0．2微米过滤器中过滤、等分，然后储存在-70℃下。
当全长人sonic hedgehog(Shh)表达在High FiveTM昆虫细胞中时，Western印迹检测到超过95％的N-端片段是细胞结合形式的。通过SDS-PAGE，经纯制的蛋白以单个明显的带移动，其表观质量为20kDa(图1，泳道c)。该蛋白比在E．Coli中产生的可溶性蛋白(图1，泳道b-d)移动快约0．5kDa，这与以前公开的数据一致(19)。如所描述的(19)相类似，可溶性且膜结合的Shh蛋白还可容易地通过反相HPLC来区别，其中结合形式在乙腈梯度中较后被洗脱。洗脱膜结合形式所需的乙腈浓度为60％，而对于可溶形式的仅为45％。这表明蛋白的疏水性显著增加。C、膜结合的人Sonic hedgehog的质谱分析
等份的Shh在C4柱(Vydac，Cat．No．214TP104，柱尺寸4．6mm内径×250mm)上于室温下进行反相HPLC。结合组分用0-80％梯度的在0．1％三氟乙酸中的乙腈洗脱30分钟，流速为1．4ml／min。在280nm处监测柱洗脱物，并收集0．5分钟的流分。在Speed Vac浓缩器中干燥25μL等份包含蛋白的流分，溶解在电泳样品缓冲液中，然后用SDS-PAGE分析。汇集含hedgehog的流分，在Speed Vac浓缩器中浓缩4倍，使用1．33的消光系数用1mg／ml的Shh溶液通过在280nm处的吸光度分析蛋白含量。样品在Micromass Quattro II三联四极质谱仪上进行ESI-MS，该质谱仪装配有电子喷射离子源。直接以10μl／min的流速使用50％水、50％乙腈、0．1％甲酸作为溶剂在注射器泵中将6μl体积的HPLC纯制的hedgehog扩散在离子源中。在整个样品扩散处进行扫描。得到所有电子喷射质谱数据，并以文件模式储存，然后使用MicromassMassLynx数据系统进行处理。
与Micromass Quattro II三联四极质谱仪一起通过反相HPLC在线分析由内切蛋白酶Lys-C消化吡啶基乙基化的Shh产生的肽。在Reliasil C18柱上用MichromTM超快速微量蛋白分析仪系统分离消化物，其中流速为50μl／min，用5-85％在0．05％三氟乙酸中的乙腈梯度洗脱。在整个范围中由m／z400-2000进行扫描，并如上所述进行处理。
由结合Shh得到的N-端肽的测序在Voyager-DETM STR(PerSeptiveBiosystems，Framingham，MA)飞行时间(TOF)质谱分析上通过源后衰变(Post Source Decay)(PSD)测量来进行，其中使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质(22，23)。精确地使0．5μl经HPLC纯制的内切蛋白酶Lys-C肽与0．5μl基质在靶板上混合。为覆盖片段离子的整个光谱范围，在11个步骤中将镜电压由20降低至1．2kV。
可溶性且膜结合形式的Shh的电子喷射离子化质谱数据表明，原始物质的质量分别为19560和20167Da(图2)。19560Da的测量质量与以Cys-1起始并以Gly-174结束的Shh的预期质量(计算质量为19560．02Da)相匹配。相反地，20167Da质量既不与预测的一致，而且结合的与可溶形式质量之间的差值607Da也不能用任何已知的改性或酶解过程来解释。以前，Porter等人(18)证实，Drosophila hedgehog包含胆固醇基团，而且因此人系统中的质量差异有可能至少是部分地由于胆固醇(酯化胆固醇的计算质量为368．65Da)。19796Da处的结合Shh质谱中存在微小组分，其与主峰差371Da，支持该结论。
对于胆固醇的进一步证据是通过用中等碱在能够断裂胆固醇连接但不破坏肽键的条件下处理结合Shh而得到的(18)，然后通过质谱(MS)再分析反应产物。简言之，昆虫细胞衍生的Shh用50mM KOH、95％甲醇在室温下处理1小时，然后用ESI-MS分析或者用内切蛋白酶Lys-C消化，并在Micromass Quattro II三联四极质谱仪上进行LC(液体色谱)-MS。对于进行LC-MS的样品，蛋白首先用4-乙烯基吡啶处理。碱处理使质量移动387Da，这与胆固醇加水的丢失相一致(见表3)。可溶性Shh的质量不受碱处理的影响。这些观察一起提示出，膜结合的人Shh包含两个改性，胆固醇和质量为236Da的第二个基团。该值与所添加的棕榈酰基团的质量(238Da)之间的类似性提示出蛋白可能被棕榈酰化。如下所述，更精确的质量测算表明在0．1Da的棕榈酰基团的预期质量内的相关关系。表3：结合Shh的MS特征。在部分a中计算质量值使用平均残基质量来确定，而在部分b中为单同位素质子化质量。蛋白质量(Da)计算测量a．KOH处理的Shh未结合的 (－处理)19560．0219560未结合的 (＋处理)19560．0219561结合的 (－处理)20167．1420167结合 (－处理)19798．4919780b．N-端内切酶Lys-C肽(MH+)*未结合的983．49983．50结合的1221．721221．79*在此所述的所有质量值都是质子化的质量。
随后我们测定了结合Shh有可能用改变的洗脱梯度通过HPLC分馏在亚种中，并研制出一种简单的HPLC分析来定量各种形式。这些分析的结果见图3所示。在该分析中，未改性的Shh首先洗脱(峰1)，然后是胆固醇改性的Shh洗脱出(峰2)，而最后是包含胆固醇和棕榈酸改性的Shh的产物洗脱(峰3)。峰3的复杂形状反映了棕榈酰基改性形式的存在，其是通过MALDIPSD测量的测序来鉴别的。变化为2Da，小于预测的，并因此有可能包含不饱和键(数据未显示)。D、在人Sonic hedgehog序列中棕榈酸改性的局部化
人序列中棕榈酰化的位点是通过组合使用肽作图和序列分析来鉴别的。图4B表明了用LC-MS读数由肽作图分析可溶性蛋白得到的结果。98％以上的可溶性Shh序列的质量数据可由该分析中计算出。用星号标注的峰相应于N-端肽(残基1-9加4-乙烯基吡啶，观察质量为983．50Da，计算质量为983．49Da，表3)。在对应的结合产物的分析中(图4A)，该肽没有，替代的是疏水性更强的肽，其质量为1221．79Da(用星号标注)。
1221．79Da基团与存在N-端肽的改性形式相一致，即983．49Da对应于肽成分加238．23Da。1221．79Da肽接下来通过MALDI PSD测量进行序列分析。所得的PSD谱示于图5中。检测到对应于b1、b2、b4、b5、b8+H2O、y8、y7、y5、y4、y3、y2、y1片段的离子。另外，b1和b2离子表明吡啶基乙基化的Cys-1加成物是棕榈酰化的。只有包含Cys-1的离子包含所添加的238．23Da质量。
因为胱氨酸是蛋白体内棕榈酰化的正常位点，所以发现连接在N-端胱氨酸上的新型加成物并不令人惊奇。但是，两个证据提示脂质连接在胱氨酸的氨基上，而不是硫醇上。首先，在肽作图研究中，我们使用4-乙烯基吡啶作为光谱标记物以监测游离的硫醇基团(72)。吡啶基乙基化对于胱氨酸硫醇是高度特异性的，并增加105Da加成物，其可用MS检测。在PSD光谱中观察到的包含Cys-1的片段包括棕榈酰基和吡啶基乙基两个改性，表明存在游离硫醇基团。第二，结合Shh进行自动N一端Edman测序，但没有得到序列，这提示在N-端的α-胺处的阻断。相反地，相应的可溶形式的Shh可容易地测序。实施例2：人Sonic hedgehog可在无细胞系统中用棕榈酸改性
用3H-棕榈酸在无细胞的系统中标记可溶性Shh，其中使用改进版的公开程序(24)。肝匀浆在3000×g下10分钟、9000×g下20分钟、以及100000×g下30分钟顺序进行离心，由此从鼠肝中分离粗的微粒体组分。将100000×g沉淀物悬浮在10mM HEPES pH7．4、10％蔗糖中，然后再于100000×g下离心20分钟。将最终沉淀物(得自于10g肝脏)悬浮在3ml的20mM Tris-HCl pH7．4、150mM NaCl、1mMEDTA、10μg／ml亮抑蛋白酶肽、0．15％Trition X-100中，等分并储存在-70℃下。反应物包含3μg Shh、1μl鼠微粒体、50ng／ml辅酶A(Sigma)、0．3mM ATP、20mM Tris-HCl pH7．4、150mM NaCl、1mMEDTA、10μg／ml亮抑蛋白酶肽、以及0．5μCi-[9，10-3H]-棕榈酸(50Ci／mmol；New England Nuclear)，反应在室温下进行1小时。随着减少电泳样品缓冲液反应停止，在10-20％梯度凝胶上进行SDS-PAGE，然后用荧光进行肉眼观察。
如图1所示(泳道e)，Shh很容易地标记有放射性示踪物。反应混合物中约1百个其他蛋白中没有一个被标记(见泳道j中相应的考马斯蓝染色的凝胶图谱)，这表明棕榈酰化反应的高度特异性。棕榈酰化反应的特异性的进一步证据是，我们测试了两种Shh变体，其中棕榈酰化的位点已被消除。图1(泳道f)显示了截短形式的可溶性Shh的分析结果，该Shh缺少成熟序列的头10个氨基酸残基，而泳道g是Shh的突变体，其在N-端包含单个Cys-1向Ser的点突变。这些变体没有一个被标记。
N-端胱氨酸作为脂质衍生化位点的重要性已被以下事实进一步证实：野生型可溶性Shh容易被标记，而N-端胱氨酸向丝氨酸的突变体不被标记。不能标记N-端丝氨酸突变体引发了对简单反应机制的争论，在该机制中棕榈酰基直接连接在N-端的α-胺上，这是因为在测试条件下丝氨酸应取代胱氨酸。
我们还使用可溶性的Shh检测了游离N-端的作用，该Shh带有N一端组氨酸(His)-标记物突出。在这些研究中所用的可溶性Shh首先制成为His标记的融合蛋白，其在成熟序列的连接处具有肠激酶断裂位点，然后用肠激酶处理以除去His标记物。尽管存在胱氨酸的游离硫醇基团，但His标记的Shh仍未能棕榈酰化(见图1，泳道i)。虽然我们不能排除N-端突出立体地抑制了棕榈酰化发生的可能性，但Cys-1是在肠激酶断裂位点的PI，位置上，而且易于被酶处理。因此，似乎Cys-1的硫醇和α-胺都对棕榈酰化反应有帮助。因为所有已知的棕榈酰化反应定向于Cys、Ser或Thr残基的侧链，所以我们推论hedgehog上的改性以形成硫酯中间体开始，而且棕榈酰基通过形成环状中间体转移至N-端上。使用棕榈酰基辅酶A改性人Sonic hedgehog的研究证实了上述假设(见实施例8)。实施例3：证实天然脂肪酰化的人Sonic hedgehog在以细胞为基础的(C3H10T1／2)实验中效力增加
测试Shh在以细胞为基础的实验中的功能，其中在C3H10T1／2细胞(25)测量碱性磷酸酯酶诱导作用，共进行5天。该实验在96孔板中进行。样品重复进行两次。对于结合Shh(100μg／ml)，样品首先用正常生长培养基稀释200倍，然后在板中进行系列的2倍稀释。各孔对于所添加的辛基糖苷的潜在作用进行归一化，其中是在培养基中添加0．005％辛基糖苷。使用中和鼠mAb 5E1(26)的阻断研究如下进行：在室温下于培养基中混合Shh和一系列的抗体稀释物30分钟，然后在板中添加测试样品。
在该实验中，可溶性人Shh产生剂量依赖性的反应，其中IC50为1μg／ml，最大信号出现在3μg／ml(图6A)。结合的人Shh中，在C-端连接胆固醇，在N-端连接棕榈酰基，其在实验中类似地产生剂量依赖性的反应，但IC50为0．03μg／ml，最大信号出现在0．1μg／ml，这表明其效力约为可溶性Shh的30倍。为证实所观察到的活性是hedgehog特异性的，我们还测试了该活性是否可被抗hedgehog中和mAb 5E1抑制。5E1处理可抑制可溶性和结合的Shh(图6B)。结合Shh的抑制需要5E1的十分之一，这与其实验中活性增加相一致。
在受体结合实验中测试了结合Shh，监测其结合patched的能力，其中使用最近公开的实验的改进版(10)。结合Shh显示出剂量依赖性地结合表达patched的细胞，其中表观IC50为400ng／ml(图7)。在相同的实验中，可溶性Shh结合patched的表观IC50为150ng／ml，这表明结合形式仅与其受体略微紧密地结合。实施例4：在重组为脂质体后分析结合的人Sonic hedgehog
本实施例说明在1∶1-100∶1之宽范围的脂质∶蛋白比(w／w)中通过洗涤剂稀释重组实验为正电荷和负电荷的脂质体对C3H10T1／2实验中结合Shh的活性没有作用。
重组为包含磷脂的脂质体为含脂质的蛋白提供了一种有用的制剂，这是因为它能够使含脂质的蛋白在接近正常沉降中存在。为测试此等制剂对于结合Shh是否是可行的，我们使用了洗涤剂稀释法以将蛋白掺入在脂质体中(60)，其中所用的脂质体与辛基糖苷和目的蛋白混合，然后将洗涤剂稀释至低于其临界胶束浓度，由此驱动重组。虽然可以利用大量纯的或者脂质混合物的任何一种，我们选择了两种市售的混合物作为模型：包含卵L-α-磷脂酰胆碱、二鲸蜡基磷酸酯和胆固醇的负电荷脂质体试剂盒(Cat．No．L-4262；Sigma，St．Louis，MO)；以及由卵磷脂酰胆碱、硬脂胺和胆固醇组成的正电荷脂质体试剂盒(Cat．No．L-4137，Sigma)。
简言之，将脂质转移至Pyrex管中，在氮气流中干燥，然后冻干残留的溶剂。将脂质悬浮在10mM HEPES pH7．5、100mM NaCl、2．0％辛基糖苷中，搅拌，然后进行超声处理，直至悬浮液的外观变为透明的。接着由0．2微米过滤器中过滤脂质。在辛基糖苷中用400、1000、5000和20000倍过量的脂质(w／w)处理由杆状病毒感染的High FiveTM昆虫细胞中得到的结合Shh等份，然后在预温育15分钟后稀释样品，并在C3H10T1／2实验中分析活性。
正或负电荷脂质体处理对hedgehog的活性都没有作用，这表明脂质载体是可行的制剂。为证实hedgehog的确已被重组，用平行的样品进行离心，其条件是结合Shh正常沉淀，而脂质体飘浮在样品的表面。在此情况下，结合Shh飘浮在表面上，这表明重组已经发生。实施例5：由哺乳动物(EBNA-293)细胞得到的膜结合人Sonic hedgehog的特征
为评估棕榈酰化对于Sonic hedgehog是常规改性通路或者其对于昆虫细胞形成是特异性的，还在哺乳动物系统中于EBNA-293中制造蛋白。为在哺乳动物细胞中表达全长Shh，将包含全长Shh的1．4kb NotI片段(见实施例1)克隆入载体CH269 pCEP4(Invitrogen，San Diego，CA(21))的衍生物中。使用转染胺(Life Technologies，Inc．)将构建物转染入EBNA-293细胞中，然后于转染48小时后收集细胞。表面Shh的表达用FACS和Western印迹分析证实。
在窄孔C4柱(见实施例3)上用反相HPLC使由EBNA-293得到的结合Shh分级分离。用ESI-MS(表4中的部分a和b)或MALDI-TOF MS在Finnigan LaserMat质谱仪上使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质(表4的部分c)分析各个峰。通过SDS-PAGE证实，蛋白移动略快于可溶性的Shh，其在反相HPLC分析中滞后在C4柱上，而且通过质谱证实其包含相应于棕榈酸加胆固醇改性的离子。但是，昆虫细胞衍生的产物中超过80％的产物包含棕榈酸和胆固醇改性，但与此不同的是，HPLC洗脱图和质谱分析的数据表明，大多数哺乳动物细胞衍生的蛋白缺乏棕榈酰基(见表4和图3C)。也就是说，在EBNA-293细胞的峰2中，经修剪的(des-1-10)对完整蛋白的MS信号的比例为50％，而峰1中仅约10％的Shh是经修剪的。令人感兴趣的是，昆虫细胞和哺乳动物细胞衍生的产物都在C3H10T1／2实验中显示了可比的活性，这提示胆固醇以及胆固醇加棕榈酸改性都是官能化的。是否简单地使用第二脂质连接以进一步稳定蛋白与膜的结合或者其是否起着更重要的作用以及是否影响其形成或蛋白-蛋白接触仍需要确定。
蛋白的脂肪酸衍生化是常见的翻译后改性，其在成熟过程中后期发生(28，29)。对于胱氨酸衍生物，该过程是动态的，涉及单独的酶，该酶添加和除去巯基上的改性。此等衍生化(如棕榈酰化)的最常见功能是改变蛋白的物理-化学性质，如将蛋白靶向至其功能位点、促进蛋白-蛋白的相互作用、以及介导蛋白-膜的相互作用(30)。对于hedgehog，虽然在昆虫和哺乳动物细胞衍生的制剂的棕榈酰化程度上存在差异(昆虫细胞为80％，而哺乳动物细胞为30％)是令人惊奇的，但我们不知道其是否为生理显著性的或者其是否简单地反映两种测试系统对于添加和除去棕榈酸的细胞机制上的差异。昆虫和哺乳动物细胞中改性程度的差异不可能是物种相关性的，这是因为在昆虫细胞中产生的结合的Drosophila hedgehog缺乏棕榈酸(19)，尽管其具有独立的N-端序列。
表4：EBNA-293衍生的结合人Sonic hedgehog的质谱分析实施例6：鼠Sonic hedgehog的脂质改性
本实施例说明各种脂质可连接在可溶性的鼠hedgehog上，如果编码残基1-174的鼠Shh基因是在High FiveTM昆虫细胞中表达的，基本上与实施例1中所述的全长人Shh一样。脂质改性使该部分为膜结合的。N-端片段(未处理的鼠Sonic hedgehog的残基1-174)与人Sonichedgehog的N-端片段的差异仅有2个氨基酸残基。在鼠Sonic hedgehogN-端片段中，苏氨酸替代了44位处的丝氨酸，而天冬氨酸替代了173位处的甘氨酸。如果在High-FiveTM昆虫细胞／杆状病毒表达系统中表达缺乏自动处理域的鼠Sonic hedgehog，绝大多数的蛋白分泌在培养基中，这是因为其缺少将胆固醇基团连接在C-端上的能力。该可溶性的形式具有特异性的生物活性(用实施例3中C3H10T1／2碱性磷酸酯酶诱导实验来测量)，该活性类似于由E．Coli表达并纯制的人Sonic hedgehog的可溶性N-端片段。
但是，总蛋白的小部分仍与昆虫细胞有关。细胞结合的鼠Sonichedgehog蛋白基本上如实施例1所述进行纯制，而且发现其在碱性磷酸酯酶实验(数据未示出)中比分别由E．Coli和High FiveTM昆虫细胞／杆状病毒表达系统纯制的人或鼠Sonic hedgehog的可溶性N-端片段具有更显著的活性。随后用HPLC和电子喷射质谱分析对鼠Sonic hedgehog N-端片段的研究(如实施例1中所述)提示，蛋白是脂质改性的，而且有超过1种类型的脂质改性。支持证据包括以下事实：
1、细胞结合形式比可溶性的人和鼠sonic hedgehog N-端片段在C4反相HPLC柱(Vydac目录号214TP104)中更慢被洗脱，该柱用在0．1％三氟乙酸中的0-70％乙腈梯度线性洗脱30分钟；
2、如表5所示，细胞结合形式的质量与脂质改性蛋白的预测值一致。
表5：鼠Sonic hedgehog的各种脂质改性形式的质量 蛋白 加合物预期质量*(MH+)观察质量(MH+) 未经改性的 无 19632．08 19632 肉豆蔻酰基 CH3(CH2)12CO- 19842．50 19841 棕榈酰基 CH3(CH2)14CO- 19870．55 19868 硬脂酰基 CH3(CH2)16CO- 19898．60 19896 二十碳酰基 CH3(CH2)18CO- 19926．66 19925*在计算预期质量时实验平均质量
脂质基团的位置使用序列分析和肽作图的组合法来确定。自动N-端Edman测序脂质改性形式表明，N-端被阻断，提示脂质连接在N-端胱氨酸的α-胺上。使用4-乙烯基吡啶烷基化的脂质改性形式的Endo-Lys-C肽作图、MALDI-TOF质谱分析和MALDI PSD分析(如实施例1中所述)来证实脂质改性的位置并确定它们的精确质量。
如表6所示，携带脂质改性的N-端肽(包括残基1-9加上连接在N-端胱氨酸的硫醇侧链上的4-乙烯基吡啶)的质量在0．1Da范围内与脂质改性的肽预期值一致。
表6：由各种脂质改性的鼠Sonic hedgehog分离的N-端肽的质量 蛋白 加合物 预期质量*(MH+) 观察质量(MH+) 肉豆蔻酰基 CH3(CH2)12CO- 1193．69 1193．76 棕榈酰基 CH3(CH2)14CO- 1221．72 1221．65 硬脂酰基 CH3(CH2)16CO- 1249．75 1249．71*在计算预期质量时实验平均质量
除表6中所示的脂质改性肽，还可检测到质量为1191．74、1219．84和1247．82的肽。这些质量分别与不饱和形式的肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯和硬脂酸酯一致，但是未能确定烷基链中双键的位置。这些事实表明，饱和以及不饱和脂肪酸可共价键地连接在N-端胱氨酸上。对于饱和以及不饱和脂质改性的肽，如实施例1中所述的MALDI PSD分析证实脂质共价键地连接在N-端胱氨酸残基上。实施例7：Indian hedgehog的脂质改性
为评估棕榈酰化反应对于人Shh是否是独特的或者它是否发生在其他hedgehog蛋白上，我们测试了人Indian hedgehog(在E．Coli中表达为His标记的融合蛋白，在紧邻成熟序列的起始部分处具有肠激酶断裂位点，并精确地如重组人Sonic hedgehog进行纯制(实施例9))是否能够被棕榈酰化，其中使用了如实施例2中所述的实验。人Indian hedgehog是经改性的(见图1，泳道h)，表明棕榈酰化有可能是hedgehog蛋白的一个常见特征。用放射性棕榈酸在无细胞的系统中直接标记Shh和Ihh的能力能够简单筛选改性反应中所涉及的氨基酸。另外，用实施例8中所述的方法棕榈酰化的Indian hedgehog在C3H10T1／2实验中明显比未经改性的Ihh具有更强的效力。实施例8：使用酰基辅酶A对Sonic hedgehog进行脂质改性
包含N-端胱氨酸的蛋白的体外酰化可通过一个两步的、与脂肪酸-硫酯供体的化学反应来完成。在第一步中，硫酯供体的酰基通过自发的转酯化反应转移至蛋白之N-端胱氨酸的巯基上。随后，酰基进行S至N迁移转移至N-端胱氨酸的α-胺上，形成稳定的酰胺键。蛋白上胺官能团的直接酰化也随与硫酯的长时间温育而发生，但是蛋白上胱氨酸的存在将加速该反应，并控制在酰化位点上。在本实施例中，使用市售辅酶A衍生物(Sigma Chemical Company，St．Louis MO)，但其他硫酯基团也可达到相同的结果。事实上，某些硫酯离去基团，如硫苄基酯，有可能反应更迅速。内部胱氨酸残基也可促进至邻近的赖氨酸(如在内部胱氨酸-赖氨酸对中)的酰化，而且这可通过使用合成肽方便地进行测试。在与硫酯反应期间发生在蛋白上的第二酰化可通过控制缓冲液组成、pH或者通过邻近赖氨酸的位点针对性诱变来防止。
在预分析酰化对人Sonic hedgehog于C3H10T1／2细胞中诱导碱性磷酸酯酶的能力的影响时，反应混合物包含1mg／ml人Sonic hedgehog(51μM)、500μM特殊的市售酰基辅酶A(测试的化合物包括乙酰基辅酶A(C2：0)、丁酰基辅酶A(C4：0)、己酰基辅酶A(C6：0)、辛酰基辅酶A(C8：0)、癸酰基辅酶A(C10：0)、月桂酰基辅酶A(C12：0)、肉豆蔻酰基辅酶A(C14：0)、棕榈酰基辅酶A(C16：0)、棕榈油酰基辅酶A(C16：0)、硬脂酰基辅酶A(C18：0)、二十碳酰基辅酶A(C20：0)、二十二碳酰基辅酶A(C22：0)、二十四碳酰基辅酶A(C24：0)、琥珀酰基辅酶A和苯甲酰基辅酶A)、25mM DTT、以及50mM Na2HPO4 pH7．0。反应物在生物下温育3小时，然后立即如实施例3所述在C3H10T1／2实验中分析(无需纯制)生物活性。反相HPLC以及其他物理方法中所分析的样品通常储存在-70℃下。HPLC分析在Vydac C4反相柱(4．6mm内径×250mm，5微米颗粒)上进行，其中用在0．1％TFA中的5-85％乙腈梯度洗脱40分钟，流速为1ml／min。在280nm处监测洗脱物，在一些实验中收集流分，并在SDS-PAGE上分析hedgehog蛋白，其中用考马斯染色和Western印迹检测。
各种反应混合物的活性比较(图10)表明，与未改性的蛋白相比，12-18个碳原子之间的链长在诱导碱性磷酸酯酶活性方面是最佳的。增加链长进一步导致活性的表观下降，而且不饱和棕榈油酰基辅酶A(C16：1)中的双键使其活性与完全饱和的棕榈酰基辅酶A(C16：0)的相同。在反相HPLC分析反应混合物时，我们观察到许多更短链的酰基辅酶A衍生物不与hedgehog蛋白反应，并因此图10中所示的生物活性的依赖性并不完全反映酰基链长。
为得到经改性蛋白的真实活性的数据、以及活性对酰基链长的依赖性的数据，我们研制了合成并纯制单独N-端酰基化形式的方法。棕榈酰化、肉豆蔻酰化、月桂酰化、癸酰化、以及辛酰化的人Sonic hedgehog蛋白携带单个连接在N-端胱氨酸的α-胺上的酰基链，它们是在包含以下物质的反应混合物中制得的：0．80mg／ml(41μM)人Sonichedgehog，410μM(10倍摩尔浓度过量)的棕榈酰基辅酶A、肉豆蔻酰基辅酶A、或月桂酰基辅酶A，或者4．1mM(100倍摩尔浓度过量)的癸酰基辅酶A或辛酰基辅酶A，25mM DTT(对于包含棕榈酰基辅酶A、肉豆蔻酰基辅酶A或月桂酰基辅酶A的反应混合物)或者0．5mMDTT(对于包含癸酰基辅酶A或辛酰基辅酶A的反应混合物)，以及40mM Na2HPO4 pH7．0。反应混合物在28℃下温育24小时。N-端胱氨酸与酰基硫酯的反应使得酰基通过自发的转酯化反应转移至巯基上，然后通过S至N迁移转移至α-胺上，形成稳定的酰胺键。游离巯基接着进行第二转酯化反应，产生带有脂肪酰基的蛋白，该脂肪酰基通过硫酯键连接在巯基上。硫酯连接的酰基则如下除去：顺序地添加0．11体积的1M Na2HPO4 pH9．0和0．11体积的1M羟胺(0．1M最终浓度)，然后在28℃下温育18小时，这将仅剩下连接在蛋白上的酰基酰胺(62)。然后添加0．25体积的5％辛基糖苷(1％最终浓度)，并在室温下温育混合物1小时。然后在1％辛基糖苷存在下使用SP-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)和Bio Scale S(Biorad)阳离子交换色谱纯制蛋白。经纯制的蛋白相对于5mM Na2HPO4 pH5．5、150mM NaCl、1％辛基糖苷、0．5mM DTT进行透析，然后储存在-70℃下。需要辛基糖苷的存在，以维持所有的溶解度，通过稀释和透析除去洗涤剂分别导致丢失75％、41％和15％的棕榈酰化、肉豆蔻酰化和月桂酰化蛋白。HPLC纯制的蛋白的ESI-MS证实它们的完整性：棕榈酰化的Sonic hedgehog，测量质量=19798，计算质量=19798．43；肉豆蔻酰化的Sonic hedgehog，测量质量=19770，计算质量=19770．33；月桂酰化的Sonic hedgehog，测量质量=19742，计算质量=19742．33；癸酰化的Sonich edgehog，测量质量=19715，计算质量=19714．28；辛酰化的Sonic hedgehog，测量质量=19686，计算质量=19686．23。
在C3H10T1／2实验中分析各种酰化形式的人Sonic hedgehog(图11)表明，蛋白的活性取决于链长。棕榈酰化的、肉豆蔻酰化的、以及月桂酰化的蛋白显示出几乎相同的活性，其中EC50值为5-10ng／ml(与未改性的蛋白相比，效力增加100-200倍)。癸酰化的人Sonic hedgehog的EC50值为60-70ng／ml(与未改性的蛋白相比，效力增加15-30倍)，其活性低于棕榈酰化的、肉豆蔻酰化的、和月桂酰化的蛋白，而辛酰化的形式显示最低的活性，其EC50为100-200ng／ml(与未改性的蛋白相比，效力增加10倍)。所有酰化形式都比未改性的蛋白的效力高，后者的EC50为1000-2000ng／ml。除EC50降低外，棕榈酰化的、肉豆蔻酰化的、以及月桂酰化的蛋白与未改性的蛋白相比诱导约2倍更高的碱性磷酸酯酶活性，而癸酰化的和辛酰化的蛋白多诱导1．5倍。
在C3H10T1／2实验中除观察到肉豆蔻酰化的人Sonic hedgehog的效力增加外，在胚胎期E11鼠端脑的外植体中诱导前脑神经元方面，肉豆蔻酰化形式比未改性的蛋白明显更有效力。用各种浓度的未经改性的或者肉豆蔻酰化的Sonic hedgehog温育E11端脑外植体，并随后染色dlx和islet-1／2基因(前脑神经元的标记物)的产物的外植体，它们表明在48nM时首先观察到未经改性的蛋白的诱导作用，但在3nM时首先观察到肉豆蔻酰化形式的诱导作用。而且，未经改性的蛋白在3070nM时诱导限制性表达，而肉豆蔻酰化的蛋白在48nM时诱导宽范围的表达。当胚胎期E9预期端脑与未经改性的或者肉豆蔻酰化的蛋白一起温育时，观察到类似的效力增加。染色Nkx2．1基因产物(前脑神经元的早期标记物)的外植体表明，在384nM时首先观察到未经改性的蛋白诱导Nkx2．1，而肉豆蔻酰化的蛋白在12nM时首先观察到表达Nkx2．1。再者，在48nM肉豆蔻酰化的Sonic hedgehog时，Nkx2．1的表达被扩展，而使用未经改性的形式时在该浓度下没有检测到。
另外，肉豆蔻酰化的人Sonic hedgehog已显示出比未改性的蛋白具有更显著的保护性，减少由于向鼠脑纹状体给药丙二酸酯而导致的损伤体积(见实施例16)。实施例9：人Sonic hedgehog的N-端胱氨酸的化学衍生物A、总的方法蛋白的烷基化。在50μl的6M盐酸胍、50mM Na2HPO4 pH7．0中于室温下用0．5μl的4-乙烯基吡啶处理包含约20μg蛋白的样品2小时。添加40体积的冷乙醇，由此使S-吡啶基乙基化的蛋白沉淀。在-20℃下储存溶液1小时，然后在14000×g和4℃下离心8分钟。弃掉上清液，然后用冷乙醇洗涤沉淀物。蛋白储存在-20℃下。肽作图。烷基化蛋白(0．4mg／ml，在1M盐酸胍、20mM Na2HPO4 pH6．0中)用endo Lys-C(Wako Pure Chemical Industries，Ltd．)以1∶20的比例进行消化。消化在室温下进行30小时。用5μl的25％三氟乙酸进行酸化，由此使反应停止。在Waters 2690 Separation Module上分析消化物，该仪器上装有996型光电二极管矩阵检测器。在注射前，将固态的盐酸胍添加在消化物中至6M的浓度，以溶解不溶的物质。分离时使用反相Vydac C18(2．1mm内径×250mm)柱，用0．1％三氟乙酸／乙腈梯度洗脱90分钟，0．1％三氟乙酸／乙腈的流速为0．2ml／min。手工收集每个峰用于质谱分析。质量测定。完整蛋白的分子质量用电子喷射离子化质谱(ESI-MS)在Micromass Quattro II三联四极质谱仪上测定。使用在线Michrom超快微量蛋白分析仪用Reliasil C4(1mm内径×50mm)柱使样品脱盐。流速为20μl／min。使用Micromass MassLynx数据系统处理所有的电子喷射质谱数据。肽的分子质量在Voyager-DETM STR(PerSeptive Biosystems，Framingham，MA)上通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)进行测定。在相同的仪器上通过源后衰变(PSD)测量来进行改性肽的测序。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质。N-端测序。蛋白通过Edman降解在Perkin-Elmer Applied Biosystems477A型脉冲液体蛋白测序仪上测序。在测序仪的样品添加柱中直接添加硫脯氨酸(thiaproline)(噻唑烷-4-羧酸)，由此在线制备PTH-硫脯氨酸。用于化学改性的野生型可溶性人Sonic hedgehog N-端片段的细菌表达和纯制。由表达Shh的细胞得到的细菌沉淀物，为总蛋白的4-5％，将其融化，以1∶4(w／v)的比例重新悬浮在溶胞缓冲液(25mM Na2HPO4pH8、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM PMSF、0．5mM DTT)中，然后由12000p．s．i．的Gaulin压缩机(由APV Rannie，Copenhagen，Denmark制造)中通过两次以进行溶解。除非另有说明，所有随后的纯制步骤都在2-8℃下进行。在19000×g下离心匀浆60分钟，然后在所得的溶胞产物中以1∶10(v／v)的比例添加MES 0．5m pH5。将溶胞产物(pH5．5)添加在SP Sepharose Fast Flow(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱(4g E．Coli湿重／ml树脂)上，该柱用25mM Na2HPO4 pH5．5、150mMNaCl平衡。用4柱体积(CV)的平衡缓冲液洗涤，然后用3CV的25mMNa2HPO4 pH5．5、200mM NaCl、0．5mM DTT洗涤，再于相同的缓冲液中用800mM NaCl洗脱His标记的Shh。用280nm处的吸光度和SDS-PAGE分析洗脱流分。在峰值Shh的池中添加咪唑(1M原料液pH7)和NaCl(5M原料液)以分别形成20mM和1M的最终浓度，该峰值Shh的池中包含由SP Sepharose洗脱液的流分。然后将该物质添加在NTA-Ni琼脂糖(Qiagen，Santa Clara，CA)柱(20mg／ml树脂)中，该柱用25mM Na2HPO4 pH8、1M NaCl、20mM咪唑、0．5mM DTT平衡。用5CV的相同缓冲液洗涤上述柱，然后用3CV的25mM Na2HPO4 pH8、1M NaCl、200mM咪唑、0．5mM DTT洗脱His标记的Shh。由NTA-Ni柱中流出的在洗脱池中的蛋白含量用280nm处的吸光度来测定。将所述池温热至室温，然后添加等体积的2．5M硫酸钠。在室温下进行Phenyl Sepharose步骤。将所述物质添加在Phenyl Sepharose Fast Flow(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱(20mg／ml树脂)上，该柱用25mMNa2HPO4 pH8、400mM NaCl、1．25M硫酸钠、0．5mM DTT平衡。用25mM Na2HPO4 pH8、400mM NaCl、0．5mM DTT洗脱His标记的Shh。通常情况下，我们由0．5kg的细菌浆液(湿重)中回收2-3g的His标记的Shh。产物由0．2μm过滤器中过滤，等分，然后储存在-70℃下。用SDS-PAGE测定His标记的Shh的纯度为95％。进一步估算经纯制的产物的特征，对样品进行电子喷射离子化质谱(ESI-MS)分析。约50％的蛋白失去N-端蛋氨酸。
为断裂六组氨酸标记物，以1∶1000(w／w)的酶：Shh比例使肠激酶(Biozyme，San Diego，CA)与His标记的Shh在28℃下温育2小时。使消化物由第二NTA-Ni琼脂糖柱(20mg Shh／ml树脂)中通过，由此除去未断裂的His标记的Shh和游离His标记物。在装填前，将咪唑(1M原料液，pH7)和NaCl(5M原料液)添加在消化物中使最终浓度分别为20mM和600mM。将该物质装填在NTA-Ni柱上，该柱在25mMNa2HPO4 pH8、600mM NaCl、20mM咪唑、0．5mM DTT中平衡，然后收集流分。用1CV的相同缓冲液洗涤该柱，并收集流分。在NTA-Ni琼脂糖未结合的流分中添加MES(0．5M原料液，pH5)至最终浓度为50mM，然后添加2体积的水。将该物质装填在第二个SP SepharoseFast Flow柱(20mg／ml树脂)上，该柱用5mM Na2HPO4 pH5．5、150mMNaCl、0．5mM DTT平衡。所述柱用3CV的平衡缓冲液、1CV包含300mMNaCl的相同缓冲液洗涤。用5mM Na2HPO4 pH5．5、800mM NaCl、0．5mM DTT洗脱Shh。原子吸收数据表明在该阶段Shh包含0．5mol当量的Zn2+。在Shh洗脱液中添加等摩尔浓度的ZnCl2，然后相对5mMNa2HPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．5mM DTT透析蛋白。SDS-PAGE、大小排阻色谱(SEC)和ESI-MS证实所得的Shh的纯度大于98％，而原子吸收证实其包含0．9-1．1Zn2+／Shh。
His标记的Shh以及除去His标记物后得到的产物的ESI-MS数据总结于表7中。
表7：Shh的ESI-MS特征蛋白质量(Da)计算测量His标记的Shh(-Met)21433．8221434(完整的)21565．0121565肠激酶断裂的Shh19560．0219560B、特异性的化学改性用N-乙基马来酰亚胺改性人Sonic hedgehog。在5mM Na2HPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．5mM DTT中经纯制的Shh用10mM N-乙基马来酰亚胺在冰上处理1小时，然后在5mM Na2HPO4 pH5．5、150mM NaCl中透析。MALDI-TOF-MS数据表明，N-乙基马来酰亚胺(NEM)改性的蛋白的质量增加126Da，这表示在Shh中仅有一个胱氨酸残基被该试剂改性。N-端测序数据表明，蛋白是可测序的，而且在第一个循环中检测出一个不寻常的峰(数据未显示)，可能与PTH-NEM-Cys有关。吡啶基乙基化的NEM-Shh在变性条件下的质谱分析表明在蛋白中仅有两个胱氨酸残基被烷基化，证实了仅有N-端胱氨酸残基的硫醇基团在天然条件下被NEM改性(表8)。其他两个胱氨酸残基明显被埋在蛋白的疏水性芯中，在变性前没有被改性。
表8：NEM改性的Shh的MS特征 蛋白 质量(计算) 质量(测量) 吡啶基乙基化的NEM Shh 19895Da 如果包含2个游离胱氨酸残基 19895Da 如果包含3个游离胱氨酸残基 20000Da
当在C3H10T1／2实验(见实施例2)中测试时，N-乙基马来酰亚胺改性的hedgehog蛋白在活性上与未经改性的蛋白相同。这证实hedgehog N-端处的游离巯基对于活性不是必须的，而且N-乙基马来酰亚胺的疏水性与其他疏水性更强的改性基团相比足以使hedgehog具有某些活性，所述其他改性例如将Cys-1转化为His或Asp，这将降低活性。用甲醛改性人Sonic hedgehog以形成N-端硫脯氨酸，以及用乙醛和丁醛处理形成N-端硫脯氨酸衍生物。对于甲醛改性，在5mM Na2HPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．5mM DTT中3mg／ml经纯制的Shh用0．1％甲醛在室温下处理1-6小时，其中使用或不使用10％甲醇。蛋白相对于5mMNa2HPO4 pH5．5、150mM NaCl进行透析，或者在如以下所述的CM-Poros柱(Perseptive Biosystems)上纯制，然后相对于5mM Na2HPO4 pH5．5、150mM NaCl进行透析。对于用乙醛或丁醛的改性，在5mMNa2HPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．5mM DTT中3mg／ml经纯制的Shh用0．1％乙醛或丁醛在室温下处理1小时，然后在CM-Poros柱上纯制蛋白。甲醛、乙醛和丁醛处理的蛋白的ESI-MS数据表明，它们的质量比未经改性的蛋白分别高出13Da、27Da和54Da(见表9)。表9：用甲醛、乙醛和丁醛处理的人Sonic hedgehog的预期和观察质量 蛋白 预期质量*(MH+) 观察质量*(MH+) 未经改性的 19560．02 19560 甲醛处理的 19572．03 19573 乙醛处理的 19586．06 19587 丁醛处理的 19614．11 19614*使用平均质量用于计算预期质量。
对于甲醛处理的蛋白，如上所述，肽作图证实改性位点发生在跨越头9个N-端残基的肽中，而且精确的质量增加是12Da。该肽之MALDI-PSD MS研究结果表明改性发生在Cys-1上，而且可用N-端α-胺和Cys-1硫醇侧链的改性形成硫脯氨酸来解释(见图12)。硫脯氨酸的结构通过自动N-端Edman测序使用“在线”制备的PTH-硫脯氨酸作为标准物来证实。对于乙醛和丁醛处理的蛋白，ESI-MS数据与通过如与甲醛反应相同的化学发生的改性一致，但尚未明确改性位点。当在C3H10T1／2以细胞为基础的实验中测试时，甲醛、乙醛和丁醛改性的蛋白的效力比未经改性的Shh分别高约8、2和3倍。用N-异丙基碘代乙酰胺改性人Sonic hedgehog。本实施例表明与未经改性的Shh相比，用碘代乙酰胺的疏水性衍生物改性人Shh可增强蛋白的效力。经纯制的Shh(1mg／ml，在5mM Na2HPO4 pH7．0、150mMNaCl、0．1mM DTT中)在4℃下与1mM的N-异丙基碘代乙酰胺(NIPIA)温育18小时。将DTT添加至10mM最终浓度，然后样品相对于5mM Na2HPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．5mM DTT进行广泛透析。在SP Sepharose Fast Flow树脂上纯制样品，并相对于5mM Na2HPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．5mM DTT进一步透析。ESI-MS数据表明完全转化为质量是19660的物质，相应于单一改性的蛋白的预期质量值(19659)。N-端胱氨酸的特异性改性用蛋白水解片段的肽作图证实。当在C3H10T1／2以细胞为基础的实验中测试时，NIPIA改性的人Shh的效力比未经改性的蛋白高约2倍。虽然蛋白的改性仅导致效力的中度增加，但预期用长链烷基碘代乙酰胺衍生物改性蛋白将产生效力增加更高的疏水性改性的蛋白，可能类似于在棕榈酰化、肉豆蔻酰化、和月桂酰化的Shh蛋白中观察到的100-200倍(见实施例8)。用1-溴-2-丁酮改性人Sonic hedgehog以在N-端形成6元疏水性环。Shh的硫代吗啉基-(四氢噻嗪基-)衍生物如下制备：在室温下使人Shh-N(3mg／ml，在5mM Na2HPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．15mMDTT中)与11mM 1-溴-2-丁酮一起温育60分钟，然后用5mMNaCNBH3在室温下还原60分钟。在如下所述的CM-Poros柱(PerseptiveBiosystems)上纯制反应产物，并相对于5mM Na2HPO4 pH5．5、150mMNaCl、0．5mM DTT进行透析。ESI-MS和蛋白水解肽作图的数据表明，所述产物是所期望的硫代吗啉基衍生物(计算质量=19615，观察质量质量=19615)和两种蛋白形式的混合物，所述蛋白都具有16个额外的质量单位。这些形式之一是未环化的酮基-硫醚中间体。在C3H10T1／2实验中测试混合物，表明其比未经改性的蛋白的效力高5倍。实施例10：人Sonic hedgehog的遗传工程诱变A、N-端胱氨酸的遗传工程诱变
在本实施例中，我们显示在如实施例3所述的C3H10T1／2以细胞为基础的实验中与野生型蛋白相比，单和多疏水性氨基酸残基特异性替换人Sonic hedgehog的N-端胱氨酸(Cys-1)导致效力的增加。Shh Cys-1突变体的构建。携带由p6H-SHH产生的His标记的野生型ShhN-端片段的584 bp NcoI-XhoI限制性片段亚克隆在pUC野生的克隆载体pNN05中，以构建质粒pEAG649。根据制造商的建议方案使用Pharmacia试剂盒对pEAG649质粒模板进行独特的位点消除诱变，由此制备可溶性人Shh的Cys-1突变体。在设计诱变引物时，如果所希望的突变不产生限制性位点变化，则在邻近的编码子中引入产生限制性位点变化的沉默突变，以有利于诱变后突变克隆的鉴别。为避免异常编码子的使用，从至少在人Shh cDNA序列中其他地方发生至少一次的那些编码子中选择经取代的编码子。使用以下诱变引物：(1)对于C1F：5＇GGCGAT GAC GAT GAC AAA TTC GGA CCG GGC AGG GGG TTC 3＇(SEQID NO：)，其引入一个ApoI位点以制成pEAG837；(2)对于C1I：5＇GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATA GGA CCG GGC AGG GGG TTC3＇(SEQ ID NO：)，其失去RsrII位点以制成pEAG838；以及(3)对于C1M：5＇GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATG GGC CCG GGC AGGGGG TTC GGG 3＇(SEQ ID NO：)，其失去RsrII和AvaII位点以制成pEAG839。通过携带质粒pEAG837-839中突变SHH蛋白的N-端的180 bp NcoI-BglII限制性片段由DNA测序来证实突变。将各突变质粒的180 bp NcoI-BglII片段和得自于pEAG649的404 bp BglII-XhoI片段亚克隆于p6H-SHHH的用磷酸酯酶处理过的5．64kb XhoI-NcoIpET11d载体骨架中，由此构建表达载体。引入的限制性位点变化的存在在各Cys-1突变体(在pEAG840中的C1F，在pEAG841中的C1I，以及在pEAG842中的C1M)的表达载体中重新证实。根据制造商的建议方案将表达载体转化入竞争性E．Coli BL21(DE3)pLysS(Stratagene)中，然后在包含100μg／ml氨苄青霉素和30μg／ml氯霉素的LB琼脂板上进行选择。选择单独的菌落，并使转化的细菌生长至0．4-0．6的A600，然后用0．5mM IPTG诱导3小时。通过还原SDS-PAGE和Westem印迹分析细菌沉淀物对突变蛋白的表达。
根据制造商的建议方案使用Pharmacia试剂盒，通过独特的位点消除诱变制备带有多个N-端疏水性取代(ClII)的可溶性人Shh突变体。在设计诱变引物时，如果所希望的突变不产生限制性位点变化，则在邻近的编码子中引入产生限制性位点变化的沉默突变，以有利于诱变后突变克隆的鉴别。为避免异常编码子的使用，从至少在人Shh cDNA序列中其他地方发生至少一次的那些编码子中选择经取代的编码子。对于ClII，在C1F模板质粒pEAG837上使用以下诱变引物：5＇GCG GCG ATGACG ATG ACA AAA TCA TCG GAC CGG GCA GGG GGT TCG GG 3＇(SEQ ID NO：)，其除去ApoI位点以制备pEAG872。通过携带突变ClII Shh的0．59kp NcoI-XhoI限制性片段由DNA测序来证实突变。将突变质粒的NcoI-XhoI片段亚克隆于p6H-SHHH的用磷酸酯酶处理过的5．64kb XhoI-NcoI pET11d载体骨架中，由此构建表达载体。引入的限制性位点变化的存在在ClII突变体的表达载体pEAG875中重新证实。根据制造商的建议方案将表达载体转化入竞争性E．ColiBL21(DE3)pLysS(Stratagene)中，然后在包含100μg／ml氨苄青霉素和30μg／ml氯霉素的LB琼脂板上进行选择。选择单独的菌落，并使转化的细菌生长至0．4-0．6的A600，然后用0．5mM IPTG诱导3小时。如上所述分析细菌沉淀物，以证实突变Shh蛋白的表达。人Sonic hedgehog的Cys-1突变体的纯制。如上述对野生型蛋白的描述由细菌沉淀物中纯制His标记的突变hedgehog蛋白，但有两个变化。(1)取消Pheny Sepharose步骤，取而代之的是在肠激酶断裂步骤中的制备中，将由第一个NTA-Ni柱中的蛋白池透析入25mM Na2HPO4 pH8、400mM NaCl、0．5mM DTT中。(2)最终离子交换步骤由在SP-Sepharose Fast Flow上洗脱变化为在CM-Poros柱(PerseptiveBiosystems)上进行梯度洗脱。这在50mM Na2HPO4 pH6．0中进行，用超过30个柱体积的0-800mM NaCl梯度。由该步骤中汇集的峰流分透析入5mM Na2HPO4 pH5．5、150mM NaCl中，然后储存在-80℃下。纯制蛋白的质谱给出各纯制形式的预期质量离子。人Sonic hedgehog的Cys-1突变体的活性。如表10所示，在C3H10T1／2实验中，N-端胱氨酸的突变对于所得hedgehog蛋白的效力产生显著的作用。对于单个变化，效力通常与取代氨基酸的疏水性有关，也就是说，与野生型胱氨酸相比，苯丙氨酸和异亮氨酸产生最大的活化作用，蛋氨酸的活化作用较低，而组氨酸和天冬氨酸消除了活性。用两个异亮氨酸替代胱氨酸比单个异亮氨酸替换产生更大的活性增加。如果将9种氨基酸归类为比胱氨酸的疏水性更大(蛋白：结构和分子性质(Proteins：structures and molecular properties)，第2版，1993，T．E．Creighton，W．H．Freeman Co．第154页)，上述测试的取代明显地不是对能够提升hedgehog活性的N-端处的可能突变的穷尽研究。但是，该结果证实，活化作用不限于单个氨基酸结构，而且多于1个的氨基酸的取代能够进一步增加效力。因此，本领域技术人员能够用其他N-端处的氨基酸取代产生效力比野生型蛋白更高的hedgehog形式。表10：在C3H10T1／2实验中人Sonic hedgehog氨基酸改性的相对效力 N-端 相对效力 C(野生型) 1X M 2X F 4X I 4X II 10XB、内部残基的遗传工程诱变ClII／A169C突变体的构建。根据制造商的建议方案用Pharmacia试剂盒并采用如上所述的诱变寡设计原则进行独特的位点消除诱变，由此制备可溶性人Shh突变体ClII／A169C(其中胱氨酸替换可缺少的C-端残基A169，该残基预测具有高度的分离溶剂接近性)。在ClII Shh模板pEAG872上使用以下诱变引物：5＇GAG TCA TCA GCC TCC CGA TTTTGC GCA CAC CGA GTT CTC TGC TTT CAC C 3＇(SEQ ID NO：)，以添加FspI位点制备pSYS049。通过0．59kb NcoI-XhoI限制片段由DNA测序证实ClII／A169C突变。将NcoI-XhoI片段亚克隆于p6H-SHHH的用磷酸酯酶处理过的5．64kb XhoI-NcoI pET11d载体骨架中，由此构建表达载体。引入的限制性位点变化的存在在表达载体中重新证实。如上所述将表达载体转化入竞争性E．Coli BL21(DE3)pLysS中，选择菌落，诱导并筛选对于Shh的表达。ClII／A169C突变体的纯制。如实施例9对野生型Shh所述纯制ClII／A169C突变体，但有以下变化。(1)在溶胞缓冲液中除去EDTA。(2)交换NTA-Ni和SP Sepharose步骤的顺序，并省略Phenyl Sepharose步骤。(3)在离心澄清溶胞细菌后，在上清液中添加额外的氯化钠至最终浓度为300mM。(4)NTA-Ni柱的洗脱缓冲液包含25mM Na2HPO4 pH8．0、200mM咪唑、400mM NaCl。(5)NTA-Ni柱的洗脱池用3体积的100mM MES pH5．0稀释，然后装填在SP Sepharose柱上。(6)在添加肠激酶前，SP Sepharose洗脱池用半体积的50mM Na2HPO4 pH8．0稀释。以及(7)最终SP Sepharose柱的缓冲液中的DTT包含0．2mM DTT，而且该步的洗脱池等分，并储存在-70℃下。ClII／A169C突变体的疏水性改性和活性。对于用N-(1-芘)马来酰亚胺(Sigma)的改性，用等体积的50mM MES pH6．5稀释经纯制的ClII／A169C(4．6mg／ml，在5mM Na2HPO4 pH5．5、800mM NaCl、0．2mMDTT中)，在该混合物中添加二十分之一体积的芘马来酰亚胺，其源自于在DMSO中的2．5mg／ml原料液。样品在黑暗中于室温下温育1小时。此时，添加另外的DTT至0．5mM，并在室温下进一步温育样品1小时。在如实施例3中所述的C3H10T1／2实验中直接测试经改性的蛋白的活性。在改性前，蛋白的特异性活性是EC50=0．22μg／ml，而用芘马来酰亚胺处理后，其特异性活性增加至EC50=0．08μg／ml。经常可观察到改性产物的特异性活性增加3倍，这表明与ClII起始物相比，接近于Shh的C-端添加疏水性基团可进一步增加活性。与野生型未改性的Sonichedgehog蛋白相比，N-(1-芘)马来酰亚胺改性的ClII蛋白的效力高出约30倍。虽然芘马来酰亚胺提供了一个用于评估在此位点上的改性的简单测试系统，但还可使用其他的疏水性马来酰亚胺或其他的胱氨酸靶向化学品。实施例11：在C3H10T1／2实验中比较各种疏水性改性的人Sonichedgehog的效力
在如实施例3所述的C3H10T1／2实验中测试各种疏水性改性的人Sonic hedgehog(使用部分V中所述的化学法和遗传工程法制备的)的活性。
在如实施例3中所述的浓度范围上实验各衍生物。在实验中产生50％最大反应的hedgehog衍生物的浓度与野生型浓度进行比较。相对活性见下表11和图13。
表11：在C3H10T1／2实验中hedgehog衍生物的相对效力 改性 EC50(比野生型Shh的效力高出的倍数) C：16棕榈酰基 100 C：14肉豆蔻酰基 100 C：12月桂酰基 100 C：10癸酰基 33 带有A169C芘基的异亮氨酰基-异 亮氨酰基 30 C：8辛酰基 10 异亮氨酰基-异亮氨酰基 10 C：Othiaprolyl 8 硫代吗啉基 5 苯丙氨酰基 4 异亮氨酰基 4 N-异丙基乙酰胺基 2 蛋氨酰基 2 N-乙基马来酰亚胺基 1 胱氨酰基(野生型) 1 天冬氨酰基 ＜1 组氨酰基 ＜1C3H10T1／2实验证实与野生型未经改性的蛋白相比hedgehog的各种疏水性改性都增加了蛋白的活性。亲水性改性(天冬氨酸和组氨酸)没有这种作用。实施例12：疏水性改性的人Sonic hedgehog在鼠丙二酸诱导的纹状体损伤实验中的效力评估
在鼠纹状体(等同于灵长类caudate和putamen的啮齿类动物)中注射丙二酸(线粒体酶琥珀酸酯脱氢酶的抑制剂)可导致纹状体中脊髓神经元的变性。在人中，caudate和putamen中的中脊髓神经元变性是亨廷顿病的主要病理特征。因此，在鼠中丙二酸诱导的纹状体损伤可被用作测试疏水性改性的hedgehog蛋白是否能够防止在亨廷顿病中变性的神经元死亡的模型。
使用立体定位技术向Sprague-Dawley鼠的纹状体注射各种浓度的疏水性改性的人Sonic hedgehog。在戊巴比妥钠麻醉(40mg／kg)下进行立体定位注射(2μl)，并放置在以下协同部位上：在前囱之前0．7mm、横向距中线2．8mm、以及垂直距离前囱处头骨表面5．5mm。在注射疏水性改性的蛋白后的各种时间(通常48小时)处用异氟烷麻醉鼠，并在纹状体的相同协同部位处进行丙二酸的立体定位注射(2μmol，在2μl中)。丙二酸注射后4天，杀死鼠，并取出脑用于组织学分析。以25μm的厚度由纹状体切下冠状部分并染色，用于细胞色素氧化酶活性，以区别损伤和未损伤的组织。使用图象分析系统测量纹状体中的损伤体积。
疏水性改性的人Sonic hedgehog蛋白在丙二酸诱导的鼠纹状体损伤模型中的作用见图14所示。未改性的Sonic hedgehog(如在实施例9中制得的)、肉豆蔻酰化的Shh(如实施例8中制得的)、以及Shh的ClII突变体(如在实施例10中制得的)，都在该模型中以类似的程度减少损伤体积。但是，疏水性改性的蛋白(肉豆蔻酰化的Shh和ClII Shh)与未改性的Sonic hedgehog相比显示出效力增加。实施例13：sHh-N的N-辛基马来酰亚胺衍生化对于1mg／ml的最终浓度
(1)制备在DMSO(约4．2mg／ml)中的20mM辛基马来酰亚胺(m．w．=209)溶液。
(2)用PBS(Gibco产品#20012-027，pH7．2)10倍稀释10mg／ml sHh-N的原料液(在5mM NaPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．5mM DTT中)，形成1mg／ml(或者50μM)的sHh-N溶液。(注：DTT在随后的反应中与sHh-N竞争马来酰亚胺，其在该溶液中也是50μM)
(3)在1mg／ml sHh-N中立即添加1／200体积的辛基马来酰亚胺(即5μl／ml)。这使辛基马来酰亚胺与sHh-N的摩尔比为2∶1(100μM：50μM)。
(4)轻柔摇晃试管以混合上述溶液，并在室温下温育1小时。
(5)最后，在各试管中添加1／1000体积的0．35M DTT，以清除任何残余的辛基马来酰亚胺，并作为还原剂。
(6)对于载体对照，按1∶10的比例混合载体溶液(5mM NaPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．5mM DTT)和PBS(Gibco产品#20012-027，pH7．2)。添加1／400体积的20mM辛基马来酰亚胺之DMSO溶液和1／400体积的DMSO，以形成50μM N-辛基马来酰亚胺和0．5％DMSO的最终浓度。最后，添加1／1000体积的0．35M DTT。1mg／ml N-辛基马来酰亚胺sHh溶液的大约组成：PBS(约pH7．2)50μM结合在N-辛基马来酰亚胺上的sHh-N50μM结合在N-辛基马来酰亚胺上的DTT350μM DTT0．5％DMSON-辛基马来酰亚胺载体溶液的大约组成：PBS(约pH7．2)50μM结合在N-辛基马来酰亚胺上的DTT350μM DTT0．5％DMSO对于3mg／ml的最终浓度
(1)制备在DMSO(约12．6mg／ml)中的60mM辛基马来酰亚胺(m．w．=209)溶液。
(2)用PBS(Gibco产品#20012-027，pH7．2)10倍稀释10mg／ml sHh-N的原料液(在5mM NaPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．5mM DTT中)，形成3mg／ml(或者150μM)的sHh-N溶液。(注：DTT在随后的反应中与sHh-N竞争马来酰亚胺，其在该溶液中也是150μM)
(3)在3mg／ml sHh-N中立即添加1／200体积的辛基马来酰亚胺(即5μl／ml)。这使辛基马来酰亚胺与sHh-N的摩尔比为2∶1(300μM：150μM)。
(4)轻柔摇晃试管以混合上述溶液，并在室温下温育1小时。
(5)最后，在各试管中添加1／1000体积的0．35M DTT，以清除任何残余的辛基马来酰亚胺，并作为还原剂。
(6)对于载体对照，按3∶7的比例混合载体溶液(5mM NaPO4 pH5．5、150mM NaCl、0．5mM DTT)和PBS(Gibco产品#20012-027，pH7．2)。添加1／400体积的60mM辛基马来酰亚胺之DMSO溶液和1／400体积的DMSO，以形成150μM N-辛基马来酰亚胺和0．5％DMSO的最终浓度。最后，添加1／1000体积的0．5M DTT。3mg／ml N-辛基马来酰亚胺sHh溶液的大约组成：PBS(约pH7．2)150μM结合在N-辛基马来酰亚胺上的sHh-N150μM结合在N-辛基马来酰亚胺上的DTT500μMDTT0．5％DMSON-辛基马来酰亚胺载体溶液的大约组成：PBS(约pH7．2)150μM结合在N-辛基马来酰亚胺上的DTT500μM DTT0．5％DMSO0．5％DMSO
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Benjamin编辑
所有上述文献和出版物都在此并入作为参考。等同物
虽然我们已经描述了许多本发明的实施方案，但对于本领域普通技术人员显而易见的是，上述基础性的实施方案还可进行变化，形成可利用本发明组成和方法的其他实施方案。因此，可以理解的是，本发明的范围包括所有在上述说明书中以及为所附权利要求书定义的替代性实施方案和变化，而且本发明不仅限于实施例中所述的具体实施方案。