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阳离子抗菌肽
【技术领域】
本发明涉及抗菌肽，具体地说是蜂毒肽(melittin)的片断及其类似物多肽，以及阳离子抗菌肽作为抗菌素的应用。
【背景技术】
抗菌素的使用挽救了无数的生命，使人的预期寿命增加了十年以上。但随着抗菌素的广泛使用，细菌也逐渐对其产生了耐药性，迫使人们不断寻找新的抗菌素。虽然目前临床使用(包括已停用)的抗菌素约有150种之多，但它们大都属于30多年前已定型的6大类，新研制的抗菌素一般都在这6大类范围之内，与已有的抗菌素往往有交叉耐药性，寻找抗耐药细菌的新抗菌素变得愈来愈困难。现在细菌的耐药性已变得非常严重，一些超级细菌对目前使用的所有抗菌素包括被称为抗菌最后防线的万古霉素具有耐药性(A.H.Wong，R.P.Wenzel，M.B.Edmond，Am.J.Infect.Control，2000，28，277-281)。由于耐药细菌引起的感染致人于死地的病例近年来已屡见不鲜，一些本来已得到控制的传染病近年来又卷土重来。因此寻找新类型的、细菌对其不易产生耐药性的抗菌素已迫在眉睫。
各种生物(包括植物、动物和人类)体内存在许多抗菌肽，用来对付细菌、病毒和真菌等，这是一类最古老但至今仍很有效的广谱抗菌素，说明细菌不易对其产生耐药性(M.Zasloff，Nature，2002，415，389-395)。这类多肽因都含有较多的碱性氨基酸，亦称阳离子抗菌肽。天然阳离子抗菌肽种类繁多，已发现的超过500种；结构各异，大小从十四、五个氨基酸到近百个氨基酸，有线型肽也有含二硫健或不含二硫健的环肽。由于独特的抗菌机理，细菌不易对其产生耐药性。因此这类多肽及其类似物作为抗耐药细菌的新一代抗菌素已引起人们的高度重视。虽然从各种生物中已发现超过500种抗菌肽，但直接利用天然抗菌肽作为抗菌素的尝试很少。主要原因有：某些天然抗菌肽抗菌活性较低；一些天然抗菌肽肽链较长因而合成成本高；还有一些天然抗菌肽除其抗菌活性外，还有很强的溶血等副作用。因此人们往往尝试合成天然抗菌肽的类似物，其目的是：提高抗菌活性、降低溶血副作用、减小肽的氨基酸残基数。
在众多的天然抗菌肽中，存在于蜜蜂毒液中的蜂毒肽(melittin)受到人们的广泛关注。蜂毒肽是由26个氨基酸组成的多肽，它的氨基酸序列为：
Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-The-The-Gly-Leu-
Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-GIn-NH₂
蜂毒肽对革兰氏阳性和阴性菌都有很强的抑制作用，还具有抗真菌、抗肿瘤、抗辐射、抗类风湿关节炎的作用。但同时蜂毒肽还具有非常强的溶血副作用，这使蜂毒肽作为抗菌素的应用受到了极大的阻碍。
【发明内容】
本发明的一个目的正是针对上述的蜂毒肽作为抗菌素的缺点，而通过化学法，通过合成蜂毒肽片断、蜂毒肽片断的取代、颠倒肽链中氨基酸残基的顺序的试验，合成了一组具有较高抗菌活性、较低溶血活性和较短链长的蜂毒肽类似物，即阳离子抗菌肽。本发明的另一个目的是将这种阳离子抗菌肽应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌感染的药物中。
本发明提供了一组阳离子抗菌肽，其特征是每个抗菌肽由二部分组成：一部分为2-4个连续的碱性氨基酸组成的碱性氨基酸簇，另一部分为8个或9个中性氨基酸组成的中性氨基酸片断，碱性氨基酸簇既可以位于C端，也可位于N端。
本发明研究发现，蜂毒肽的12-24残基的片断(Mel(12-24))、12-23残基的片断(Mel(12-23))、12-22残基的片断(Mel(12-22))、13-24残基的片断(Mel(13-24))、13-23残基的片断(Mel(13-23))和13-22残基的片断(Mel(13-22))，通过化学法合成的这些蜂毒肽片断的C端既可以是自由羧基，也可以是酰胺基，更倾向于酰胺基。其结构见表1。与蜂毒肽相比，这些合成肽的抗菌活性有些略有下降，一些变化不大，而另一些的抗菌活性甚至比蜂毒肽的还大；但它们的溶血副作用显著地减小；它们地链长由26个氨基酸残基减少到10-13个氨基酸残基。链长的减小使其合成成本大大地降低。
                               表1蜂毒肽片断的氨基酸序列

    代号                            氨基酸序列Mel(12-24)Mel(12-23)Mel(12-22)Mel(13-24)Mel(13-23)Mel(13-22) Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Lys-Arg-Arg-NH₂ Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Lys-Arg-NH₂ Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Lys-NH₂ Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Lys-Arg-Arg-NH₂ Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Lys-Arg-NH₂ Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Lys-NH₂
本发明的另一发现是，当用其它氨基酸单一取代或同时多个取代肽链中2个Lys左侧的8个(对于Mel(13-24)、Mel(13-23)、Mel(13-22))或9个(对于Mel(12-24)、Mel(12-23)、Mel(12-22))氨基酸时，每一位上的氨基酸残基的种类的特异性不强。总体来说，这8个或9个氨基酸的疏水性愈大，则其抗菌活性愈大。要保持较高的抗菌活性，这8个或9个氨基酸残基中至少要有4个疏水性氨基酸直至全部为疏水性氨基酸，这里疏水性氨基酸包括Leu、Ile、Trp、Phe、Tyr或Val。用酸性氨基酸(如Glu或Asp)取代这8个或9个氨基酸中的一个或多个都会显著地减小肽的抗菌活性。如上所述，增加中性氨基酸片断中的疏水性氨基酸的数量会增大其抗菌活性，但多肽的固相合成收率会降低，而且所得肽的水溶性也较低。
本发明的另一发现是，当这些肽的C端的Lys用Arg取代、或Arg用Lys取代时，其肽的抗菌活性变化不大。
与蜂毒肽相比，上述这些蜂毒肽片断的取代的类似物的溶血活性都显著降低。
本发明的另一发现是，上述的这些合成肽的序列颠倒时(即原来的C端作为N端，而原来的N端作为C端，这样的合成肽叫反序肽，反序肽的C端仍为酰胺基)，其抗菌活性变化不大，而其溶血活性更低。
根据这些合成肽的氨基酸序列，总结出它们的结构特征是：这些合成肽由二部分组成，一部分为2-4个连续的碱性氨基酸组成的碱性氨基酸簇，它可以由任何碱性氨基酸组成；另一部分为8个或9个中性氨基酸组成的中性氨基酸片断。取代中性氨基酸片断的试验表明，中性氨基酸片断中至少含有4个疏水性氨基酸，包括Leu、Ile、Trp、Phe、Tyr或Val；其它为任何中性氨基酸，如Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、Asn或Gln。碱性氨基酸簇既可以位于C端，也可位于N端，肽的C端为酰胺基。一些(但不局限于这些)反序肽的氨基酸序列见表2。
                     表2一些反序肽的氨基酸序列      代号                            氨基酸序列RetroMel(12-24)RetroMel(12-23)RetroMel(12-22)RetroMel(13-24)RetroMel(13-23)RetroMel(13-22) Arg-Arg-Lys-Lys-Ile-Trp-Ser-Ile-Leu-Ala-Pro-Leu-Gly-NH₂ Arg-Lys-Lys-Ile-Trp-Ser-Ile-Leu-Ala-Pro-Leu-Gly-NH₂ Lys-Lys-Ile-Trp-Ser-Ile-Leu-Ala-Pro-Leu-Gly-NH₂ Arg-Arg-Lys-Lys-Ile-Trp-Ser-Ile-Leu-Ala-Pro-Leu-NH₂ Arg-Lys-Lys-Ile-Trp-Ser-Ile-Leu-Ala-Pro-Leu-NH₂ Lys-Lys-Ile-Trp-Ser-Ile-Leu-Ala-Pro-Leu-NH₂
本发明在其优选方案中，当上述的抗菌肽(包括正序和反序)中的任一氨基酸残基被相应的D型氨基酸取代时(一个多肽中取代一个或多个残基，直至全部残基被相应的D型氨基酸取代)，其抗菌活性基本不变，而溶血活性会进一步降低。用D型氨基酸取代的另一优点是，其多肽在人体内被降解的速度会大大的减小。
本发明所述的抗菌多肽可以采用固相多肽合成法或液相多肽合成法进行合成。
本发明的阳离子抗菌肽用来应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌感染的药物中。
【具体实施方式】
实施例l
以Mel(12-24)为例，说明采用固相法合成多肽的方法：
在50ml侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1g Rinkamide MBHA树脂(0.74mmol N/g)，加15ml DMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入15ml 20％哌啶/DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入1.44g(2.22mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf为2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0.46g(2.22mmol)DCC(二环己基碳二亚胺)和0.30g(2.22mmol)HOBt(1-羟基苯并三氮唑)和15ml DMF，室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色试验，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的第一个(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接由C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面的操作，即从用20％哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的α-氨基都用Fmoc保护，有侧链保护基的氨基酸为：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH(tBu为叔丁基)、Fmoc-Trp(Boc)-OH。最后树脂用甲醇洗涤三次，真空干燥。
将上述已接肽的树脂加入到50ml圆底烧瓶中，加入15ml试剂K(三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/1，2-二巯基乙二醇＝82.5/5/5/5/2.5，体积比)，室温下搅拌4小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱中过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到Mel(12-24)粗肽。
将200mg上述的Mel(12-24)粗肽溶于2ml纯水中，用制备型反相HPLC纯化，色谱柱为μBondapak C18(19mm×300mm)，流动相为：三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68，体积比)，流速为12ml/分钟，收集保留体积为16分钟的主峰。收集液经旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得Mel(12-24)纯肽。纯肽的质谱表明，其分子量为1537，与计算值相符。
实施例2
多肽的抗菌活性的测定：用灭菌生理盐水配制浓度为～lmg/ml多肽样品溶液。试验用菌种分别接种于营养肉汤，于370C培养18-24小时，临用前用生理盐水作1∶105稀释，取12支细菌培养管并编号，于第一管中加入营养肉汤1.8ml，其余11管中均加入1.0ml肉汤。于第1管加入0.2ml多肽溶液，混匀后取出1.0ml加入到第二管中，如此反复，依次稀释到第12管，弃去lml余下lml，每管各加备妥菌液0.2ml，轻轻振摇均匀，置370C培养18-24小时，观察。培养后培养管呈现澄清，振摇后仍澄清，认为该管无菌生长；培养管呈现浑浊状态表明有菌生长。从无菌生长的各管中找出最低多肽浓度的培养管，该管的多肽浓度，即为抑制细菌生长的最低样品浓度(MIC)。表3为部分抗菌肽对几种细菌的最低抑菌浓度。
             表3抗菌肽最低抑菌浓度MIC(μg/ml)         多肽^*金葡菌  苦草杆菌 大肠杆菌 白色念珠菌melittinMel(12-24)Mel(12-23)Mel(12-22)Mel(13-24)Mel(13-22)Mel(12-24，L¹)Mel(12-24，S⁶)Mel(13-22，L³)Mel(12-24，F⁸)Mel(12-23，dL⁴dI⁹)RetroMel(12-24)RetroMel(12-23)RetroMel(12-22)RetroMel(13-24)RetroMel(12-24，L¹¹)RetroMel(12-24，L¹¹L¹³)RetroMel(13-23，L⁶) 0.72     1.4       12        24 2.6      1.3       21        42 5.2      5.2       42        84 10       5.2       42        84 2.6      2.6       21        84 10       10        21        42 0.65     1.3       5.2       10 7.3      29        117       230 5.2      2.6       10        21 3.0      6.0       24        48 5.2      5.2       21        42 2.9      1.5       5.4       10 6.6      6.6       6.6       13 25       13        52        100 2.9      1.5       2.9       6.0 1.2      2.4       9.6       20 0.32     0.32      1.3       5.2 0.6      1.2       4.8       10
*括号内大写字母带右上角标数字表示该多肽在数字所示的位置被该大写字母代表的氨基酸取代，d表示D型氨基酸。如Mel(12-24，L¹)为Mel(12-24)的第1位上的氨基酸被Leu(单字母缩写为L)取代；再如RetroMel(12-24，L¹L³)为RetroMel(12-24)的第11位和第13位分别被Leu取代。表中其它单字母缩写为：S-Ser；F-Phe。表中抑菌浓度愈小，则抗菌活性愈高。
实施例3
多肽的溶血活性的测定：将人血红细胞悬浮在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，得到血红细胞悬浮液(5％v/v)。将多肽溶解在磷酸盐缓冲液中，配成约5mg/ml储备液，取14支1.5ml离心管，于第一支离心管中加1ml多肽储备液，其余各管中加0.5ml磷酸盐缓冲液，从第一管中取出0.5ml多肽储备液加至第二管中，用微量混合仪混合均匀，再从第二管中取出0.5ml溶液加至第三管中混合均匀，以此类推，即以倍半稀释法依次稀释到第14管，弃去0.5ml，各管补加0.5ml配好的5％血红细胞悬浮液至终体积1.0ml，轻轻摇匀，37℃恒温箱中保温60分钟后于4000转/分钟离心10分钟，取上清液在414nm下比色，以血红细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中为空白，以血红细胞悬浮在1％TritonX-100中为100％溶血。溶血百分率用下式计算：

定义溶血百分率为50％时的多肽浓度为半数溶血剂量(HC₅₀)。表4为部分多肽的溶血活性。
         表4抗菌肽的溶血活性HC₅₀            多肽    HC₅₀(μg/ml)^*melittinMel(12-24)Mel(12-23)Mel(12-22)Mel(13-24)Mel(13-22)Mel(12-24，L¹)Mel(12-24，S⁶)Mel(13-22，L³)Mel(12-24，F⁸)Mel(12-23，dL⁴dI⁹)RetroMel(12-24)RetroMel(12-23)RetroMel(12-22)RetroMel(13-24)RetroMel(12-24，L¹¹)RetroMel(12-24，L¹¹L¹³)RetroMel(13-23，L⁶)    5.0    2200    ＞2500    ＞2500    ＞2500    ＞2500    1800    ＞2500    140    1900    ＞2500    ＞2500    ＞2500    ＞2500    ＞2500    ＞2500    ＞2500    ＞2500
^*HC₅₀愈小，则溶血活性愈高。
                               序列表
<110>南开大学
<120>阳离子抗菌肽
<160>24
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>意大利蜜蜂(Apis mellifera)
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的13-22残基片断
<400>1
Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Lys
 1           5              10
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>意大利蜜蜂(Apis mellifera)
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的13-23残基片断
<400>2
Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Lys Arg
 1           5              10
<210>3
<211>12
<212>PRT
<213>意大利蜜蜂(Apis mellifera)
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的13-24残基片断
<400>3
Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Lys Arg Arg
 1           5              10
<210>4
                               序列表
<211>11
<212>PRT
<213>意大利蜜蜂(Apis mellifera)
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的12-22残基片断
<400>4
Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Lys
 1           5              10
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>意大利蜜蜂(Apis mellifera)
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的12-23残基片断
<400>5
Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Lys Arg
 1           5              10
<210>6
<211>13
<212>PRT
<213>意大利蜜蜂(Apis mellifera)
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的12-24残基片断
<400>6
Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Lys Arg Arg
 1           5              10
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的13-22残基片断的反序肽
<400>7
                               序列表
Lys Lys Ile Trp Ser Ile Leu Ala Pro Leu
 1           5              10
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的13-23残基片断的反序肽
<400>8
Arg Lys Lys Ile Trp Ser Ile Leu Ala Pro Leu
 1               5              10
<210>9
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的13-24残基片断的反序肽
<400>9
Arg Arg Lys Lys Ile Trp Ser Ile Leu Ala Pro Leu
 1            5              10
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的12-22残基片断的反序肽
<400>10
Lys Lys Ile Trp Ser Ile Leu Ala Pro Leu Gly
 1               5              10
<210>11
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
                               序列表
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的12-23残基片断的反序肽
<400>11
Arg Lys Lys Ile Trp Ser Ile Leu Ala Pro Leu Gly
 1               5              10
<210>12
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<223>蜂毒肽的12-24残基片断的反序肽
<400>12
Arg Arg Lys Lys Ile Trp Ser Ile Leu Ala Pro Leu Gly
 1               5                  10
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2，3，4，5，6，7，8)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<222>(9，10)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<400>13
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2，3，4，5，6，7，8)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<222>(9，10，11)
                               序列表
<223>Xaa＝Arg或Lys
    <400>14
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>15
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2，3，4，5，6，7，8)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Ash或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<222>(9，10，11，12)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<400>15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2，3，4，5，6，7，8，9)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<222>(10，11)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<400>16
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2，3，4，5，6，7，8，9)
                            序列表
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<222>(10，11，12)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<400>17
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>18
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2，3，4，5，6，7，8，9)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<222>(10，11，12，13)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<400>18
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<222>(3，4，5，6，7，8，9，10)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<400>19
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>20
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
                             序列表
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2，3)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<222>(4，5，6，7，8，9，10，11)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<400>20
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>21
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2，3，4)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<222>(5，6，7，8，9，10，11，12)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<400>21
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<222>(3，4，5，6，7，8，9，10，11)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<400>22
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>23
<211>12
                            序列表
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2，3)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<222>(4，5，6，7，8，9，11，12)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<400>23
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>24
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>VARIANT
<222>(1，2，3，4)
<223>Xaa＝Arg或Lys
<222>(5，6，7，8，9，10，11，12，13)
<223>Xaa＝Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val或Gly或Ala或Ser或Thr或Pro或Asn或Gln，其中至少4个Xaa为Leu或Ile或Trp或Phe或Tyr或Val
<400>24
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10