一种含有双价抗虫基因的重组杆状病毒.pdf

东亚钳蝎昆虫特异性神经毒素基因(BmkIT)与一种昆虫几丁质酶基因(Chi)被克隆到一个可转化昆虫细胞的中间载体pAcPDIE1中获得含双价抗虫基因的重组质粒pAcPDIE1－BmkIT－Chi，并将该重组质粒与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV基因组DNA共转染到sf9细胞中，获得含双价抗虫基因的重组杆状病毒AcNPV－BmKIT－Chi。昆虫神经毒素与几丁质酶的协同作用，提高了病毒对棉铃虫等多种鳞翅目害虫的毒杀作用，在新型生物杀虫剂的开发利用方面有良好的应用前景。

1、  一种重组杆状病毒，其特征在于，所述病毒产生的多角体由蝎神经毒素、昆虫几丁质酶和杆状病毒多角体蛋白构成。

2、  权利要求1的重组杆状病毒，其中多角体蛋白为苜蓿银纹夜蛾核型多角体蛋白。

3、  如权利要求1所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，所述方法产生一种含外源蛋白质的重组多角体，所述方法步骤：
a)构建含有东亚钳蝎昆虫特异性神经毒素与昆虫几丁质酶双价抗虫基因的中间载体pAcPDIE1-BmkIT-Chi
b)将中间载体pAcPDIE1-BmkIT-Chi与多角体病毒AcNPV基因组DNA共转染到昆虫细胞sf9中；
c)筛选出重组杆状病毒AcNPV-BmkIT-Chi。

4、  权利要求2中的重组多角体为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。

5、  构建如权利要求1所述的重组杆状病毒的中间载体，其特征在于，将两种外源基因蝎神经毒素基因(BmkIT)和几丁质酶基因(Chi)位于同一载体上，所述载体pAcPDIE1-BmkIT-Chi由氨苄抗性基因Ampr、多角体蛋白基因、昆虫特异性神经毒素基因(BmkIT)和一种昆虫几丁质酶基因(Chi)构成；

6、  一种杀虫组合物，其特征在于，所述组合物含权利要求1所述的重组杆状病毒和农药可用的载体。

7、  权利要求1所述的重组杆状病毒在防治棉铃虫、玉米夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾、红铃虫、印度谷螟等鳞翅目农业和林业害虫方面的应用。

一种含有双价抗虫基因的重组杆状病毒
技术领域
本发明涉及一种含有蝎神经毒素(简称BmkIT)和几丁质酶(简称Chi)双价抗虫基因的重组杆状病毒，该病毒的构建方法，以及含有该病毒的杀虫剂在农业和林业害虫防治中的应用。
技术背景
昆虫杆状病毒作为无公害生物杀虫剂近年来备受关注，并得到广泛应用。杆状病毒是一类昆虫特异性病毒，应用杆状病毒防治害虫有许多明显优点。杆状病毒对脊椎动物和所有植物均无病原性，而且不能进入哺乳动物细胞核内，杆状病毒是自然界本来存在的，特别是杆状病毒对牡蛎、蚌、蟹没有致病性，对两栖类、鱼类、鸟类及哺乳动物亦无任何毒性、致病性或异常变态反应。对有益生物及非靶有机体没有不良影响。应用杆状病毒在环境中不遗留有害残毒，不会污染环境，对人畜安全。使用昆虫病毒后，不仅病虫本身就是病毒生产的“小工厂”，而且有些情况下，病毒还可经卵传染，杀灭次代害虫，并在田间存活，杀灭次年生的害虫，这是化学农药所无法相比的。
苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒在害虫防治中特别引人注目。它至少能侵染玉米夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾、棉铃虫、红铃虫、印度谷螟等39种农业和林业害虫。因而这种杆状病毒在农业和林业生产的应用上有重要意义。
但如何能进一步提高杆状病毒毒力、缩短杀虫时间是应用杆状病毒防治害虫所面临的重大课题。在野生型杆状病毒基因组内插入具有杀虫活性的外源基因被认为是解决该问题的有效途径之一。
蝎毒是一种富含生物活性的多肽物质，蝎毒中有一类神经毒素专一作用于昆虫而对哺乳动物无害或毒性很小，因此可利用此类昆虫特异性的蝎神经毒素来研制新型生物杀虫剂。几丁质是N-乙酰氨基葡萄糖线性同聚物，是组成昆虫外骨骼和消化道的主要成分，昆虫在蜕皮时分泌几丁质酶以分解几丁质，并蜕掉旧皮。但如果昆虫长时间暴露于几丁质酶下，含几丁质的一些主要结构如围食膜、消化道等就会受到严重影响而失去正常功能，换言之则可达到杀死昆虫的目的。
近几年已有重组单价抗虫基因杆状病毒的报道，但具有各自作用单一、昆虫易产生耐药性等缺陷。本发明与已有技术相比主要是在野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒基因组中引入两个外源抗虫基因。重组具有不同抗虫机理的抗虫基因能够改善、提高杆状病毒的杀虫效率并拓宽其杀虫谱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的重组杆状病毒；提供一种该重组杆状病毒的构建方法；提供一种构建用于重组杆状病毒的中间载体的方法；提供该重组杆状病毒的用途在于该病毒与农药载体的组合物具有杀虫作用。
根据本发明的目的，提供一种新的重组杆状病毒，该病毒产生的多角体由蝎神经毒素、昆虫几丁质酶和杆状病毒多角体蛋白构成。其中选用的杆状病毒多角体蛋白为苜蓿银纹夜蛾核型多角体蛋白。提供一种该重组杆状病毒的构建方法，主要是将蝎昆虫特异性神经毒素基因与具有广谱抗虫作用的几丁质酶基因容纳在同一个载体上，进而整合到多角体杆状病毒基因组上，优选使用野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒基因组，形成一种含有双价抗虫基因的新的重组杆状病毒。提供一种用于构建重组杆状病毒的中间载体；该载体由氨苄抗性基因Amp^r、多角体蛋白基因、昆虫特异性神经毒素基因(BmkIT)和一种昆虫几丁质酶基因(Chi)构成；本发明提供的含双价抗虫基因的重组杆状病毒及其获得方法可用于生物杀虫剂的开发。两种抗虫蛋白同时表达，通过几丁质酶的作用，破坏害虫消化道和外表皮，抑制昆虫发育，与此同时，使得蝎昆虫特异性神经毒素作用于神经系统，通过两种蛋白的协同作用，从而大大提高杆状病毒的杀虫效率和拓宽其杀虫谱。
本发明的目的通过下述方案实现：利用PCR方法将蝎昆虫毒素基因(BmkIT)和几丁质酶基因(Chi)分别从含有该基因的质粒中扩增出来，并克隆到一个可转化昆虫细胞的中间载体pAcPDIE1中获得含双价抗虫基因的重组质粒pAcPDIE1-BmkIT-Chi。含蝎昆虫毒素基因的载体由本课题组构建，发表于高技术通讯[梁爱华，李晓玲，苏智广Cloning and Sequencing of an Excitatory Insect-Selective Neurotox in BmKIT cDNAfrom Buthus martensii Karsch.高技术通讯，1999，9(6)：12-15]，蝎昆虫毒素基因登录号Y17050，含几丁质酶基因的载体pBI101-chitinase由张志云等构建[张志云，张虎生，孙毅，梁爱华，双价抗虫基因植物表达载体的构建，西北植物学报，2004，接收发表]，几丁质酶基因基因登录号U02270。
将该重组质粒pAcPDIE1-BmkIT-Chi与线性化的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV基因组DNA(已商品化)共转染到昆虫细胞sf9(已商品化)中，筛选出重组杆状病毒AcNPV-BmkIT-Chi。该重组杆状病毒现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏号CGMCC No.1191)。
附图说明
图1A：中间载体椎pAP建DIE1-BmkIT-Chi的结构示意图。
该载体由氨苄抗性基因Amp^r、多角体蛋白基因polh、以及在两个方向相反的IE1启动子下分别连接有昆虫特异性神经毒素基因(BmkIT)与一种昆虫几丁质酶基因(Chi)构成，该载体的大小为10.58Kb。
图1B：东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)昆虫特异性神经毒素基因(BmkIT)及其氨基酸序列。
图1C：烟草夜蛾(Manduca sexta)昆虫几丁质酶基因(Chi)及其氨基酸序列。
图2：重组杆状病毒中两个外源基因的CR检测电泳图。M：DNA标准分子量；1：几丁质酶基因CR产物，1700bp；3：蝎毒基因CR产物300bp。
图3：利用浸泡了病毒液的棉花叶饲养棉铃虫检测重组杆状病毒的杀虫效果。左图：浸泡了重组杆状病毒液的棉花叶；中图：浸泡了野生型杆状病毒液的棉花叶；浸泡了水的棉花叶。
图4：将野生型和重组型病毒拌入棉铃虫的饲料中饲养棉铃虫检测重组杆状病毒的杀虫效果。W：野生型；r：重组型。
本发明的具体内容通过附图与实例加以说明：
利用CR方法将蝎昆虫毒素基因(BmkIT)和几丁质酶基因(Chi)分别从含有该基因的质粒中扩增出来，并克隆到一个可转化昆虫细胞的中间载体pAP DIE1中获得含双价抗虫基因的重组质粒pAP DIE1-BmkIT-Chi。将中间载体pAP DIE1-BmkIT-Chi与线性化的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒APN V基因组DNA共转染到昆虫细胞sf9中；筛选出重组杆状病毒APN V-BmkIT-Chi。用此新的重组杆状病毒饲喂棉铃虫，结果表明该重组病毒既能抑制棉铃虫生长，又有神经毒素作用，杀虫效果好于重组蝎昆虫毒素基因或重组几丁质酶基因单价抗虫基因的重组杆状病毒和野生型病毒。
中间载体的构建：
利用CR方法将蝎昆虫毒素基因(BmkIT)和几丁质酶基因(Chi)分别从含有该基因的质粒中扩增出来(来源见上文)，并克隆到一个可转化昆虫细胞的中间载体pAP DIE1中获得含双价抗虫基因的重组质粒pAP DIE1-BmkIT-Chi。扩增蝎毒素基因所用引物为(BglII-sP-F：5’-CGCGAG ATCT ATG AAA TTT TTC CTT AT A-3’；BglII-sP-FR：5’-CGCGAG ATCT TTA ACC AAT TAT TTG G AC-3’)其中划线部分为BglII酶切位点.扩增几丁质酶基因的引物为(Chit-SaPII-F：5’-CGGCCGCGG ATG CG AGCG ACA CTG GCG-3’；Chit-SaPII-R：CGGCCG CGG TTA GGG TTG TTG AC ATTC-3’)其中划线部分为SacII酶切位点。中间载体pAP DIE1-BmkIT-Chi由氨苄抗性基因Amp^r、多角体蛋白基因、昆虫特异性神经毒素基因(BmkIT)和一种昆虫几丁质酶基因(Chi)构成，图1A是中间载体pAP DIE1-BmkIT-Chi的结构示意图，该载体地大小为10.58Kb。在该载体原始质粒pAP IE1上又插入一个IE1启动子，便于两个外源基因的克隆。昆虫特异性神经毒素基因(BmkIT)和昆虫几丁质酶基因(Chi)序列分别见图1B和图1C。
重组杆状病毒的获得：
接种昆虫细胞于平皿中，内装含血清的GraPe’s昆虫细胞培养液，贴壁生长，除去培养基，用无血清的GraPe’s昆虫细胞培养液洗两次，再加无血清的昆虫细胞培养液放置，弃去培养基，将转染混合物(含无血清的GraPe’s培养基，线状APN V DNA和重组中间质粒pAP DIE1-BmkIT-Chi，Tfx-20)轻轻加到上述含细胞的平皿中培养后，添加含血清的GraPe’s培养基，继续培养。收集病毒颗粒及多角体，进行空斑纯化。重组病毒感染细胞后，逐天观察细胞中的变化，待细胞中出现大量多角体后，离心收集细胞，将细胞悬浮于SDS中温育，细胞破碎，释放出多角体杆状病毒。裂解液再次离心，洗沉淀多次，最后悬浮于水中，获得重组杆状病毒。
本发明实施的具体条件是：接种sf9细胞于直径为36mm平皿中，内装2ml含血清的GraPe’s昆虫细胞培养液，贴壁生长30分钟，除去培养基，用无血清的GraPe’s昆虫细胞培养液洗两次，再加2ml无血清的GraPe’s昆虫细胞培养液，放置30分钟，弃去培养基，将转染混合物(含1ml无血清的GraPe’s培养基，500ng线状APN V DN A和500ng重组中间质粒pAP DIE1-BmkIT-Chi，4.5ul Tfx-20)轻轻加到上述含细胞的平皿中，25℃培养2h以后，添加1ml含血清的GraPe’s培养基，25℃继续培养5天。收集病毒颗粒及多角体，进行空斑纯化。
重组病毒感染sf9细胞后，逐天观察细胞中的变化，待细胞中出现大量多角体后，11500转离心10min收集细胞，将细胞悬浮于50ml 0.5％SDS中，温育15分钟，细胞破碎，释放出多角体杆状病毒。裂解液再次同上离心，用水洗沉淀多次以除去SDS，最后悬浮于1-2ml水中，获得重组杆状病毒。
重组杆状病毒的检测：
利用病毒提取试剂盒提取杆状病毒的DNA，以提取的病毒DNA为模板，用CR方法扩增蝎昆虫毒素基因片段和几丁质酶基因片段。
本发明实施的具体条件是：将病毒悬浮液20ul移入1.5ml离心管中，离心10秒后弃上清，加入450ul D液(消化液)，20ul RNase A和25ul roteinase K，迅速震荡混匀，置65℃温浴15分钟，期间来回颠倒离心管数次。加入350ul DL液(裂解液)，混匀后，高速离心5分钟，将上清移入另一个离心管中。加入350ul无水乙醇，混匀后，取700ul样品液至吸附柱中，离心30秒，弃去收集管中的液体将吸附柱放入同一个收集管中并将剩余的药品液全部移入吸附柱中，离心30秒，弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。加入400ulW1液(洗涤液)，静置1分钟后，离心30秒，弃掉收集管中的液体。将吸附柱放入另一个干净的收集管中加入500ul W1液，离心15秒，弃掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中，离心1分钟，将吸附柱放入另一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50-100ul T1液(洗脱液)，55℃静置5分钟后，离心1分钟，将1.5ml离心管(DNA)-20℃保存。
以提取的病毒DNA为模板，用CR方法扩增蝎昆虫毒素基因片段和几丁质酶基因片段。扩增所用引物同上(见中间载体构建部分)。扩增得到1700bp几丁质酶基因和300bp蝎毒基因条带，从而证明此杆状病毒含有上述两种基因。如图2。
杀虫活性测定：
本发明的重组杆状病毒的杀虫效果明显好于野生型病毒，既可以单独用作杀虫剂，又可与常用的农药载体形成组合物共同使用。
农药用载体包括液体和固体溶解物，如尘土、悬液、浊液及其类似物，杀虫剂的剂型可以是粉剂、水剂、颗粒等。合适的载体包括但不限制于，水、醇、烃或其它有机溶剂，或者为矿物油、动物油或植物油，或者可以为粉末，例如滑石粉、粘土、硅酸盐或硅藻土，还可以包括湿润剂、涂布剂、紫外保护剂、分散剂和粘着剂。
本发明的组合物还可以包含一种或多种化学杀虫剂。化学杀虫剂包括但不限于拟除虫菊酯类、吡唑啉类、有机磷类、氨基甲酸酯类、甲脒类和吡咯类，它们是本领域技术人员熟知，这些杀虫剂和本发明的重组杆状病毒配合使用，可以使不同杀虫剂的优点都得以体现。
所述的重组杆状病毒单独使用，或和其它的农用载体或其它的杀虫剂共同使用可防治棉铃虫、玉米夜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、菜青虫、小菜蛾、烟青虫、蚜虫、潜叶蝇、红蜘蛛、茶毛虫、烟青虫、红铃虫、印度谷螟等多种农业、林业、蔬菜、和仓储害虫。
本发明的实施中，采用了两种方法对重组型杆状病毒杀虫效果进行检测。表明重组型杆状病毒杀虫效果为野生型病毒APN V的100倍，半致死时间缩短2天。另外，即使是存活的昆虫，其发育受到严重抑制，个头瘦小，行动迟钝，取食极不活跃，化蛹率和成蛾率低。
采用的两种检测方法为：一是在浸泡了病毒水溶液(每升水溶液中含2×10⁸个病毒，10克白碳，10克蔗糖，50克聚已稀醇，1mlTriton X-100)的棉花叶片上放上同等数量的棉铃虫，观察棉花叶片被取食情况。
二是将野生型与重组型多角体病毒拌入人工饲料中，检测病毒对中国棉铃虫的致死作用。人工饲料中配方为：玉米面1200g、黄豆面600g、各种维生素40g、酵母粉540g、琼脂100g、白糖300g、防腐剂：山梨酸11g、对羟基苯甲酸甲酯11g、甲醛30ml。受试虫为中国棉铃虫(Helicoverpa armigera)，购于中国农科院植保所。幼虫孵化后移入装有1mm³大小人工饲料的玻璃瓶中，每瓶一头。实验共设4个多角体浓度，分别为10⁸，10⁷，10⁶，10⁵多角体/头虫，每组30头虫。实验组在饲料中滴加相应浓度的野生型或重组型多角体，对照组滴加蒸馏水，逐天记录棉铃虫存活情况。
图3是利用浸泡了病毒液的棉花叶饲养棉铃虫检测重组杆状病毒的杀虫效果。左图：浸泡了重组杆状病毒液的棉花叶；中图：浸泡了野生型杆状病毒液的棉花叶；右图：浸泡了水的棉花叶。可以看出，浸泡了重组杆状病毒液的棉花叶被棉铃虫咬食的最少，浸泡了野生型杆状病毒液的棉花叶被棉铃虫取食的次之，而浸泡了水的棉花叶被棉铃虫取食的最多。结果表明重组型病毒抗虫效果明显好于野生型病毒。
图4是将野生型和重组型病毒拌入棉铃虫的饲料中饲养棉铃虫检测重组杆状病毒的杀虫效果。W：野生型；r：重组型。可以看出重组型病毒抗虫效果明显好于野生型病毒。
具体实施方式
实施例1、含双价抗虫基因的中间载体pAP DIE1-BmkIT-Chi的构建
利用CR方法分别从质粒pExSeP1-BmkIT和pBI101-Phitinase中扩增得到蝎昆虫毒素基因片段和几丁质酶基因片段。两个重组质粒均由本室构建(见前面说明书部分)。扩增蝎毒素基因所用引物为(BglII-sP-F：5’-CGCGAG ATCT ATG AAA TTT TTCCTT ATA-3’；BglII-sP-FR：5’-CGCGAGA ATCT TTA ACC AAT TAT TTG G AC-3’)其中划线部分为BglII酶切位点.扩增几丁质酶基因的引物为(Chit-SaPII-F：5’-CGGCCGCGG ATG CG AGCG AC A CTG GCG-3’；Chit-SaPII-R：CGGCCG CGG TTA GGGTTG TTG AC A TTC-3’)其中划线部分为SacII酶切位点。将扩增的蝎毒基因片段用BglII消化后，连接于用BglII消化过的pAP DIE1中，利用载体上启动子序列与蝎毒基因下游引物进行CR扩增，从转化子中筛选正向连接的重组质粒，获得pAP DIE1-BmkIT。用SacII消化扩增出的几丁质基因片段，连于用SacII消化过的pAP DIE1-BmkIT质粒中，获得含双价抗虫基因的中间载体pAP DIE1-BmkIT-Chi.酶切消化、片段回收、转化、质粒抽提等按常规方法进行。扩增蝎毒基因片段的条件是：94℃热变性4min后，94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，30个循环后72℃延伸10min.扩增几丁质酶基因片段的条件基本同上，退火温度改为50℃。
实施例2、中间载体pAP DIE1-BmkIT-Chi及线状的APN V DNA共转染
接种sf9细胞于直径为36mm平皿中，内装2ml含血清的GraPe’s昆虫细胞培养液，贴壁生长30分钟，除去培养基，用无血清的GraPe’s昆虫细胞培养液洗两次，再加2ml无血清的GraPe’s昆虫细胞培养液，放置30分钟，弃去培养基，将转染混合物(含1ml无血清的GraPe’s培养基，500ng线状APN V DNA和500ng重组中间质粒pAP DIE1-BmkIT-Chi，4.5ul Tfx-20)轻轻加到上述含细胞的平皿中，25℃培养2h以后，添加1ml含血清的GraPe’s培养基，25℃继续培养5天。收集病毒颗粒及多角体，进行空斑纯化。
实施例3、重组杆状病毒的分离
重组病毒感染sf9细胞后，逐天观察细胞中的变化，待细胞中出现大量多角体后，11500转离心10min收集细胞，将细胞悬浮于50ml 0.5％SDS中，温育15分钟，细胞破碎，释放出多角体。裂解液再次同上离心，用水洗沉淀多次以除去SDS，最后将多角体悬浮于1-2ml水中，用血球计数器计其浓度。
实施例4、重组杆状病毒的鉴定
首先利用试剂盒提取杆状病毒的DNA，将病毒悬浮液20ul移入1.5ml离心管中，离心10秒后弃上清，加入450ul D液(消化液)，20ul RNase A和25ul roteinase K，迅速震荡混匀，置65温浴15分钟，期间来回颠倒离心管数次。加入350ul DL液(裂解液)，混匀后，高速离心5分钟，将上清移入另一个离心管中。加入350ul无水乙醇，混匀后，取700ul样品液至吸附柱中，离心30秒，弃去收集管中的液体将吸附柱放入同一个收集管中将剩余的药品液全部移入吸附柱中，离心30秒，弃去收集管中的液体将吸附柱放入同一个收集管中。加入400ul W1液(洗涤液)，静置1分钟后，离心30秒，弃掉收集管中的液体。将吸附柱放入另一个干净的收集管中加入500ul W1液，离心15秒，弃掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中，离心1分钟，将吸附柱放入另一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50-100ulT1液(洗脱液)，55℃静置5分钟后，离心1分钟，将1.5ml离心管(DNA)-20℃保存。
以提取的病毒DNA为模板，用CR方法扩增蝎昆虫毒素基因片段和几丁质酶基因片段。扩增所用引物与条件同实施例1。
实施例5、杀虫活性测定
采用两种方法对野生型与重组型多角体病毒杀虫效果进行检测。
一是在浸泡了病毒液的棉花叶片上放上同等数量的棉铃虫，观察棉花叶片被取食情况。
二是将野生型与重组型多角体病毒拌入人工饲料中，检测病毒对中国棉铃虫的致死作用。人工饲料中配方为：玉米面1200g、黄豆面600g、各种维生素40g、酵母粉540g、琼脂100g、白糖300g、防腐剂：山梨酸11g、对羟基苯甲酸甲酯11g、甲醛30ml。受试虫为中国棉铃虫(Helicoverpa armigera)，购于中国农科院植保所。幼虫孵化后移入装有1mm³大小人工饲料的玻璃瓶中，每瓶一头。实验共设4个多角体浓度，分别为10⁸，10⁷，10⁶，10⁵多角体/头虫，每组30头虫。实验组在饲料中滴加相应浓度的野生型或重组型多角体，对照组滴加水，逐天记录棉铃虫存活情况。
分析结果表明，重组型杆状病毒明显好于野生型病毒。重组型杆状病毒杀虫效果为野生型病毒APN V的100倍，半致死时间缩短2天。另外，即使是存活的昆虫，其发育受到严重抑制，个头瘦小，行动迟钝，取食极不活跃，化蛹率和羽化率降低。
优点及效果：
利用此重组杆状病毒开发新型生物杀虫剂的抗虫谱宽，能杀死用可防治棉铃虫、玉米夜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、菜青虫、小菜蛾、烟青虫、蚜虫、潜叶蝇、红蜘蛛、茶毛虫、烟青虫、红铃虫、印度谷螟等多种农业、林业、蔬菜、和仓储害虫。两种外源抗虫蛋白的协同作用，可显著提高杀虫效果，重组杆状病毒对环境无污染。
                         序列表.SEQ
序列表
<110>山西大学
<120>一种含有双价抗虫基因的重组杆状病毒
<160>4
<210>1
<211>210
<212>DNA
<213>东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(210)
<400>1
aag aag aat gga tac gct gtc gat agt agt ggt aaa gtt agt gaa tgt        48
Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp Ser Ser Gly Lys Val Ser Glu Cys
1               5                   10                  15
ttg tta aac aat tac tgc aac aac ata tgc aca aaa gta tat tat gct        96
Leu Leu Asn Asn Tyr Cys Asn Asn Ile Cys Thr Lys Val Tyr Tyr Ala
            20                  25                  30
acg agc gga tat tgc tgc tta cta tca tgt tat tgc ttc ggt cta gat       144
Thr Ser Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Cys Tyr Cys Phe Gly Leu Asp
        35                  40                  45
gac gat aaa gca gtt ttg aag atc aag gac gcg acc aaa tct tat tgc       192
Asp Asp Lys Ala Val Leu Lys Ile Lys Asp Ala Thr Lys Ser Tyr Cys
    50                  55                  60
gac gtc caa atc aac taa                                               210
Asp Val Gln Ile Asn
65
<210>2
<211>69
<212>PRT
<213>东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)
<400>2
Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp Ser Ser Gly Lys Val Ser Glu Cys
1               5                   10                  15
Leu Leu Asn Asn Tyr Cys Asn Asn Ile Cys Thr Lys Val Tyr Tyr Ala
            20                  25                  30
Thr Ser Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Cys Tyr Cys Phe Gly Leu Asp
        35                  40                  45
                          序列表.SEQ
Asp Asp Lys Ala Val Leu Lys Ile Lys Asp Ala Thr Lys Ser Tyr Cys
    50                  55                  60
Asp Val Gln Ile Asn
65
<210>3
<211>1665
<212>DNA
<213>烟草夜蛾(Manduca sexta)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1665)
<400>3
atg cga gcg aca ctg gcg acg ttg gct gtc ctg gcc tta gcg acg gcg        48
Met Arg Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu Ala Thr Ala
1               5                   10                  15
gtt caa tcg gac agc aga gcg cgc ata gta tgc tac ttc agc aat tgg        96
Val Gln Ser Asp Ser Arg Ala Arg Ile Val Cys Tyr Phe Ser Asn Trp
            20                  25                  30
gcg gtg tat cgg cct ggt gta ggg cgg tac ggc atc gag gac att cca       144
Ala Val Tyr Arg Pro Gly Val Gly Arg Tyr Gly Ile Glu Asp Ile Pro
        35                  40                  45
gtg gag aag tgt acc cac atc att tac tcc ttc att ggc gtc act gag       192
Val Glu Lys Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ile Gly Val Thr Glu
    50                  55                  60
ggc aac agc gaa gta ctt atc att gat cct gag ttg gat gta gat aag       240
Gly Asn Ser Glu Val Leu Ile Ile Asp Pro Glu Leu Asp Val Asp Lys
65                  70                  75                  80
aat ggt ttc cgc aac ttt aca tcg ctt cgg tct tcg cat ccc agc gtc       288
Asn Gly Phe Arg Asn Phe Thr Ser Leu Arg Ser Ser His Pro Ser Val
                85                  90                  95
aag ttc atg gta gcg gtg ggc ggc tgg gct gaa ggc agt tcg aag tac       336
Lys Phe Met Val Ala Val Gly Gly Trp Ala Glu Gly Ser Ser Lys Tyr
            100                 105                 110
tct cat atg gtt gca cag aag agc acc cgc atg tct ttt atc agg agc       384
Ser His Met Val Ala Gln Lys Ser Thr Arg Met Ser Phe Ile Arg Ser
        115                 120                 125
                           序列表.SEQ
gtt gtc agt ttt ctc aag aag tac gac ttc gac ggt cta gac ctt gat       432
Val Val Ser Phe Leu Lys Lys Tyr Asp Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp
    130                 135                 140
tgg gag tac cca gga gcc gct gat cgt ggc ggc tct ttt tct gac aag       480
Trp Glu Tyr Pro Gly Ala Ala Asp Arg Gly Gly Ser Phe Ser Asp Lys
145                 150                 155                 160
gac aaa ttc tta tac tta gtg caa gag ctg cgg aga gca ttc atc agg       528
Asp Lys Phe Leu Tyr Leu Val Gln Glu Leu Arg Arg Ala Phe Ile Arg
                165                 170                 175
gtt ggt aaa gga tgg gaa ctg act gct gcc gta cca ctg gct aac ttc       576
Val Gly Lys Gly Trp Glu Leu Thr Ala Ala Val Pro Leu Ala Asn Phe
            180                 185                 190
aga tta atg gag ggt tat cat gtc cct gaa ctc tgt cag gaa tta gac       624
Arg Leu Met Glu Gly Tyr His Val Pro Glu Leu Cys Gln Glu Leu Asp
        195                 200                 205
gct atc cac gta atg tcg tac gat ctt cgt ggt aac tgg gct ggg ttt       672
Ala Ile His Val Met Ser Tyr Asp Leu Arg Gly Asn Trp Ala Gly Phe
    210                 215                 220
gcc gat gtg cac tcg cct tta tac aaa cgt cct cac gac cag tgg gct       720
Ala Asp Val His Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Pro His Asp Gln Trp Ala
225                 230                 235                 240
tat gag aaa ctt aac gtg aat gat ggt ctc cat ctt tgg gaa gag aag       768
Tyr Glu Lys Leu Asn Val Asn Asp Gly Leu His Leu Trp Glu Glu Lys
                245                 250                 255
ggt tgt ccc tca aac aag ctg gtc gtc ggt att cca ttc tac ggt cga       816
Gly Cys Pro Ser Asn Lys Leu Val Val Gly Ile Pro Phe Tyr Gly Arg
            260                 265                 270
tct ttc acc cta tct gct ggc aac aac aac tac ggt ctc ggc acc ttc       864
Ser Phe Thr Leu Ser Ala Gly Asn Asn Asn Tyr Gly Leu Gly Thr Phe
        275                 280                 285
atc aac aag gaa gca ggc ggc ggt gac cct gcg cca tac acc aat gct       912
Ile Asn Lys Glu Ala Gly Gly Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Thr Asn Ala
    290                 295                 300
aca gga ttt tgg gct tat tat gag atc tgt aca gaa gta gac aag gat       960
Thr Gly Phe Trp Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Thr Glu Val Asp Lys Asp
305                     310             315                 320
gac tcc ggc tgg acg aag aaa tgg gac gag caa ggc aag tgc ccc tat      1008
                          序列表 SEQ
Asp Ser Gly Trp Thr Lys Lys Trp Asp Glu Gln Gly Lys Cys Pro Tyr
                325                 330                 335
gcc tac aag ggc acc cag tgg gtt gga tac gaa gac cct cgc agc gtg      1056
Ala Tyr Lys Gly Thr Gln Trp Val Gly Tyr Glu Asp Pro Arg Ser Val
            340                 345                 350
gag atc aag atg aac tgg att aaa cag aag gga tac ctt gga gcc atg      1104
Glu Ile Lys Met Asn Trp Ile Lys Gln Lys Gly Tyr Leu Gly Ala Met
        355                 360                 365
act tgg gct atc gac atg gat gac ttc caa gga ctg tgt gga gag aag      1152
Thr Trp Ala Ile Asp Met Asp Asp Phe Gln Gly Leu Cys Gly Glu Lys
    370                 375                380
aac cca ttg atc aag att ctt cat aag cac atg agc tct tac aca gtg      1200
Asn Pro Leu Ile Lys Ile Leu His Lys His Met Ser Ser Tyr Thr Val
385                 390                 395                 400
ccg cct cct cat aca gag aac acc aca ccg act cct gaa tgg gcc cgt      1248
Pro Pro Pro His Thr Glu Asn Thr Thr Pro Thr Pro Glu Trp Ala Arg
                405                 410                 415
cca ccg tca acc cct tcg gat cct tca gaa gga gat ccg atc cct acc      1296
Pro Pro Ser Thr Pro Ser Asp Pro Ser Glu Gly Asp Pro Ile Pro Thr
            420                 425                 430
acc acc aca gct aag cca gct tct acc acc aaa acg acc gtg aag act      1344
Thr Thr Thr Ala Lys Pro Ala Ser Thr Thr Lys Thr Thr Val Lys Thr
        435                 440                 445
act acc act acc aca gca aaa cca cct cag agc gtc att gat gaa gag      1392
Thr Thr Thr Thr Thr Ala Lys Pro Pro Gln Ser Val Ile Asp Glu Glu
    450                 455                 460
aat gat att aat gtg agg cct gaa cca aaa ccc gaa cct caa cca gag      1440
Asn Asp Ile Asn Val Arg Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Gln Pro Glu
465                 470                 475                 480
cct gaa gtt gaa gtg cct cct act gaa aat gaa gtc gat ggt agc gaa      1488
Pro Glu Val Glu Val Pro Pro Thr Glu Asn Glu Val Asp Gly Ser Glu
                485                 490                 495
atc tgc aac tca gac caa gat tat ata ccc gat aag aaa cac tgt gat     1536
Ile Cys Asn Ser Asp Gln Asp Tyr Ile Pro Asp Lys Lys His Cys Asp
            500                 505                 510
aag tac tgg cga tgc gtc aat ggg gaa gca atg cag ttc tct tgt caa     1584
Lys Tyr Trp Arg Cys Val Asn Gly Glu Ala Met Gln Phe Ser Cys Gln
                         序列表 SEQ
        515                 520                 525
cac gga acg gta ttc aat gtg gaa ctg aac gtg tgt gac tgg cct agc      1632
His Gly Thr Val Phe Asn Val Glu Leu Asn Val Cys Asp Trp Pro Ser
    530                 535                 540
aat gca aca cgt cgc gaa tgt caa caa ccc taa                          1665
Asn Ala Thr Arg Arg Glu Cys Gln Gln Pro ***
545                 550
<210>4
<211>554
<212>PRT
<213>烟草夜蛾(Manduca sexta)
<400>4
Met Arg Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu Ala Thr Ala
1               5                   10                  15
Val Gln Ser Asp Ser Arg Ala Arg Ile Val Cys Tyr Phe Ser Asn Trp
            20                  25                  3
Ala Val Tyr Arg Pro Gly Val Gly Arg Tyr Gly Ile Glu Asp Ile Pro
        35                  40                  45
Val Glu Lys Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ile Gly Val Thr Glu
    50                  55                  60
Gly Asn Ser Glu Val Leu Ile Ile Asp Pro Glu Leu Asp Val Asp Lys
65                  70                  75                  80
Asn Gly Phe Arg Asn Phe Thr Ser Leu Arg Ser Ser His Pro Ser Val
                85                  90                  95
Lys Phe Met Val Ala Val Gly Gly Trp Ala Glu Gly Ser Ser Lys Tyr
            100                 105                 110
Ser His Met Val Ala Gln Lys Ser Thr Arg Met Ser Phe Ile Arg Ser
        115                 120                 125
Val Val Ser Phe Leu Lys Lys Tyr Asp Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp
    130                 135                 140
Trp Glu Tyr Pro Gly Ala Ala Asp Arg Gly Gly Ser Phe Ser Asp Lys
145                 150                 155                 160
Asp Lys Phe Leu Tyr Leu Val Gln Glu Leu Arg Arg Ala Phe Ile Arg
                165                 170                 175
Val Gly Lys Gly Trp Glu Leu Thr Ala Ala Val Pro Leu Ala Asn Phe
            180                185                 190
Arg Leu Met Glu Gly Tyr His Val Pro Glu Leu Cys Gln Glu Leu Asp
       195                  200                 205
Ala Ile His Val Met Ser Tyr Asp Leu Arg Gly Asn Trp Ala Gly Phe
    210                 215                 220
Ala Asp Val His Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Pro His Asp Gln Trp Ala
225                 230                 235                 240
Tyr Glu Lys Leu Asn Val Asn Asp Gly Leu His Leu Trp Glu Glu Lys
                245                   250               255
                          序列表SEQ
Gly Cys Pro Ser Asn Lys Leu Val Val Gly Ile Pro Phe Tyr Gly Arg
            260                 265                 270
Ser Phe Thr Leu Ser Ala Gly Asn Asn Asn Tyr Gly Leu Gly Thr Phe
        275                 280                 285
Ile Asn Lys Glu Ala Gly Gly Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Thr Asn Ala
   290                  295                  300
Thr Gly Phe Trp Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Thr Glu Val Asp Lys Asp
305                 310                 315                 320
Asp Ser Gly Trp Thr Lys Lys Trp Asp Glu Gln Gly Lys Cys Pro Tyr
                325                 330                 335
Ala Tyr Lys Gly Thr Gln Trp Val Gly Tyr Glu Asp Pro Arg Ser Val
            340                 345                 350
Glu Ile Lys Met Asn Trp Ile Lys Gln Lys Gly Tyr Leu Gly Ala Met
       355                  360                 365
Thr Trp Ala Ile Asp Met Asp Asp Phe Gln Gly Leu Cys Gly Glu Lys
    370                 375                 380
Asn Pro Leu Ile Lys Ile Leu His Lys His Met Ser Ser Tyr Thr Val
385                 390                 395                 400
Pro Pro Pro His Thr Glu Asn Thr Thr Pro Thr Pro Glu Trp Ala Arg
                405                 410                 415
Pro Pro Ser Thr Pro Ser Asp Pro Ser Glu Gly Asp Pro Ile Pro Thr
           420                 425                  430
Thr Thr Thr Ala Lys Pro Ala Ser Thr Thr Lys Thr Thr Val Lys Thr
        435                440                  445
Thr Thr Thr Thr Thr Ala Lys Pro Pro Gln Ser Val Ile Asp Glu Glu
    450                 455                 460
Asn Asp Ile Asn Val Arg Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Gln Pro Glu
465                 470                 475                 480
Pro Glu Val Glu Val Pro Pro Thr Glu Asn Glu Val Asp Gly Ser Glu
                485                 490                 495
Ile Cys Asn Ser Asp Gln Asp Tyr Ile Pro Asp Lys Lys His Cys Asp
            500                 505                 510
Lys Tyr Trp Arg Cys Val Asn Gly Glu Ala Met Gln Phe Ser Cys Gln
        515                 520                 525
His Gly Thr Val Phe Asn Val Glu Leu Asn Val Cys Asp Trp Pro Ser
    530                 535                 540
Asn Ala Thr Arg Arg Glu Cys Gln Gln Pro
545                 550