鱼类精子冷冻保存的实用化方法.pdf

一种鱼类精子冷冻保存的实用化方法，通过比较不同稀释液、抗冻剂和冻存容器的冷冻保存效果，筛选出适宜我国主要鲤科鱼类(青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊等)和主要海水鱼类(鲈鱼、大菱鲆、牙鲆和石鲽等)精子冷冻保存的稀释液配方、抗冻剂及冻存容器；建立了三步冷冻模式和快速解冻方法。上述11种鱼类精子超低温(－196℃)冷冻保存后的活率稳定在65％以上，受精率达80％以上，孵化率达85％以上。建立了上述四种海水鱼类精子冷冻库。用冻存1年的鲈鱼冻精授精，共获鱼苗32万尾；用冻存1年的大菱鲆精子授精获得大菱鲆鱼苗30多万尾。本方法冻存量大、效果好，无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，可用于几乎所有鱼类精子超低温冷冻保存。

1.  一种鱼类精子超低温冷冻保存的实用化方法，其特征在于它的技术操作方法是，包括鱼类精子采集、精子冷冻保存稀释液的配制、选用抗冻剂、精子的稀释与平衡、精子的分装与冷冻、冷冻精液的解冻与授精：
精液采集：用毛巾擦干成熟雄鱼生殖孔区域，轻压腹部，用吸管收集挤出的精液。置于干净的小瓶中。精液置冰上短期保存，镜检后将成活率在80％以上的精液用于保存。
精子冷冻保存稀释液的配制：淡水鲤科鱼类(包括青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊等)精液稀释液为D-15，其配方为：NaCl 135-136.75mM，KCl 6-6.71mM和葡萄糖83-83.33mM；海水鱼类大菱鲆精子稀释液为TS-2，其配方为：Tris-Cl 9-11mM，pH8.0，蔗糖105-115mM，KHCO₃ 95-105mM，9-11％胎牛血清(体积比)；鲈鱼、牙鲆和石鲽精子稀释液为MPRS，其配方为：NaCl 59.35-61.35mM，NaH₂PO₄ 1.70-1.90mM，NaHCO₃ 2.5-3.5mM，KCl 4.73-5.73mM，CaCl₂·2H₂O 0.63-1.63mM，MgCl₂·6H₂O 0.63-1.63mM，D-Glucose 50.55-60.55mM。
选用的抗冻剂为DMSO，其适宜浓度为8-10％；
精子的稀释与平衡：青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊、鲈鱼、牙鲆及石鲽精液与在4℃冰箱中预冷的稀释液按1∶1或1∶2(体积比)的比例混合后，于4℃冰箱平衡20-30min后进行冷冻。而大菱鲆精液则稀释后直接冷冻，无需平衡期。
精子的分装与冷冻：将平衡好的精液、稀释液1.0-1.8ml分装于2ml冻存管，按照三步降温模式进行冷冻保存。即在液氮面上方6厘米处平衡10min，在液氮面上平衡5min，然后投入液氮中保存。最佳降温速率是31℃/min(16℃到-15℃)和18.6℃/min(从-12℃到-180℃)。
冷冻精液的解冻与授精：解冻时，先将冻存管从液氮中提出置于液氮蒸气中平衡5分钟，然后从液氮罐中拿出，放在37℃水域中快速解冻。冻精解冻后与鲜卵进行人工受精，做法为：将冷冻精液倒于卵子上，搅拌混匀，加少许淡水(鲤科鱼类精子)或海水(海水鱼类精子)激活精子，使之与卵子受精。授精后将受精卵置于孵化器中孵化。

鱼类精子冷冻保存的实用化方法
技术领域：
本发明属于低温生物学中的动物精子超低温冷冻保存技术，是一种在超低温状态(-196℃)中长期保存鱼类精子的实用化技术方法。
背景技术：
种质资源是水产养殖生产、优良品种培育及水产养殖业可持续发展的重要物质基础。我国是一个水生生物种质资源较为丰富的国家，丰富多样的水生生物种质资源和遗传多样性对于我国水产养殖业的快速发展起到了非常重要的作用。然而，由于渔业资源的过度捕捞、无序利用等，造成了某些鱼类资源的衰退和濒临灭绝，如长江鲥、松江鲈等。如果不及时采取保护措施，若干年后，在自然界中将难以找到许多鱼类原种、良种的遗传资源。因此，借助低温生物学技术，建立重要养殖鱼类原种和良种及珍稀濒危鱼类的配子和胚胎冷冻库，将这些鱼类的种质资源和遗传多样性以活的形式长期保存起来，已成为鱼类遗传多样性保护和水产养殖业中亟待攻克的重要科技问题。
精子冷冻保存技术作为长期保存动物种质的一种方法，在防止鱼类物种灭绝以及鱼类遗传育种、鱼类育苗等方面都显示出了巨大的应用潜力。尽管国际上自七十年代开始，开展了鲑鳟鱼类、鲤科鱼类等淡水鱼类以及某些海水鱼类精液冷冻保存的研究工作，但精子冷冻保存技术存在着冻精活率不够高、受精率不高、冻精保存量小、达不到实用化水平等诸多问题。鱼类精子低温保存研究还处于实验阶段，保存的精子量小，难以满足渔业生产和种质保存的需要。如国内洪万树等(1996)曾作过鲈鱼精子冷冻保存的研究，但未作授精试验来检验精子的冻存效果。在国外鱼类精子冷冻保存方面，Dreanno等(1997)曾用0.25ml麦管作为冻存容器进行了大菱鲆精子冷冻保存的研究，但获得的冻精受精率仅为58％，未报道冻精受精鱼苗的孵化率，同时该文报道的方法保存量小，无法满足精子库构建的要求。
发明内容：
本发明的目的是为了建立鲤科鱼类和重要海水养殖鱼类精子批量化冷冻保存的技术方法，为鱼类种质保存、遗传多样性保护、遗传育种和渔业生产提供实用化技术方法。
本发明是按以下技术方案实现的：它的精子冷冻保存技术方法包括精子采集、精子冷冻保存稀释液的配制、抗冻剂的选用、精子的稀释与平衡、精子的分装与冷冻、冷冻精液的解冻与授精。
1、精子采集：用毛巾擦干成熟雄鱼生殖孔区域，轻压腹部，用吸管收集挤出的精液。置于干净的小瓶中。精液置冰上短期保存，镜检后将成活率在80％以上的精液用于保存。
2、精子冷冻保存稀释液的配制：
淡水鲤科鱼类(如青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊等)精液稀释液为D-15，其配方为：NaCl 135-136.75mM，KCl 6-6.71mM和葡萄糖83-83.33mM；
海水鱼类：大菱鲆精子稀释液为TS-2，其配方为：Tris-Cl 9-11mM，pH 8.0，蔗糖105-115mM，KHCO₃ 95-105mM，9-11％胎牛血清(体积比)。鲈鱼、牙鲆和石鲽精子稀释液为MPRS，其配方为：NaCl 59.35-61.35mM，NaH₂PO₄ 1.70-1.90mM，NaHCO₃ 2.5-3.5mM，KCl 4.73-5.73mM mM，CaCl₂·2H₂O 0.63-1.63mM，MgCl₂·6H₂O 0.63-1.63mM，D-Glucose 50.55-60.55mM。
3、选用抗冻剂：上述鱼类精子冷冻保存抗冻剂为DMSO，其适宜浓度为8-10％。
4、精子的稀释与平衡：青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊、鲈鱼、牙鲆及石鲽精液与在4℃冰箱中预冷的稀释液按(体积比)1∶1或1∶2的比例混合后，于4℃冰箱平衡20-30min。而大菱鲆精液则稀释后直接冷冻，无需平衡期。
5、精子的分装与冷冻：将平衡好的精液稀释液以1.0-4.5ml分装于2-5ml冻存管，按照三步降温模式进行冷冻保存。即在液氮面上方6厘米处平衡10min，在液氮面上平衡5min，然后投入液氮中保存。最佳降温速率是31℃/min(从16℃到-15℃)和18.6℃/min(从-12℃到-180℃)。
6、冷冻精液的解冻与授精：解冻时，先将冻存管从液氮中提出置于液氮蒸气中平衡5分钟，然后从液氮罐中拿出，放在37℃水浴中快速解冻。冻精解冻后与鲜卵进行人工授精，做法为：将冷冻精液倒于卵子上，搅拌混匀，加少许淡水(鲤科鱼类精子)或海水(海水鱼类精子)激活精子，使之与卵子受精。授精后将受精卵置于孵化器中孵化。
实施方式：
一、以海水鱼类大菱鲆和鲈鱼精液超低温冷冻保存为例，对本发明的
实施方式进行说明。
1.大菱鲆精液冷冻保存实施例
(1)轻压成熟大菱鲆雄鱼腹部，同时用吸管收集无尿污的精液，在显微镜下镜检。镜检方法为：用牙签蘸取少许精子于载玻片上，然后自然海水激活，并立即在显微镜下观察。精子的成活率为精液激活后显微镜视野中运动精子占总精子数的百分率。成活率在85％以上的精液用于实验。
(2)采集后的大菱鲆精子按1∶2(体积比)比例直接稀释在4℃下预冷的含15％DMSO(体积比)的TS-2中，TS-2成分为：Tris-Cl 10mM，pH 8.0，蔗糖110mM，KHCO₃ 100mM，胎牛血清15％(体积比)。
(3)精液-稀释液混合液无需在4℃平衡，分装于2毫升冻存管(每管1.5ml混合液)后，直接冷冻。
(4)按三步法进行冷冻，即先将冻存管置于液氮面上方6厘米处平衡10min，然后在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中保存。
(5)大菱鲆精子在液氮中保存1天-1年后解冻以检验精子冷冻保存效果或用于授精实验，解冻时，冻存管首先在液氮蒸汽中平衡5分钟，接着在37℃水浴中快速解冻，直至冻存管中的精子全部融化，期间所需要的时间为1.5-2min。镜检发现，冻精活率都在70％以上。
(6)在精卵比分别是1000∶1，2000∶1和5000∶1时，分别做冻精和鲜精的授精实验，以检验在各种精卵比的情况下，冻精的受精率与鲜精的也没有显著差异。结果发现，精卵比为1000∶1时，冻精的受精率是47.9％±0.35，鲜精的为56.4％±2.33，没有显著差异。当精卵比是5000∶1，冻精的受精率是52.1％±0.84，鲜精的是58.9％±16.0，也没有显著差异。
为证实冻存的大菱鲆精子能应用于实际生产，我们共作了7次大量授精实验(所用的大菱鲆卵量在100-440ml之间，冻精(精液-稀释液的混合液)量在1.5-8ml之间，结果表明，冻精和鲜精在受精率和孵化率上都没有显著差异，孵化的鱼苗都达到了实际生产中量的要求。下面以其中一次来说明，用1管冻精(1.5ml)与240ml大菱鲆卵授精。冻精的受精率和孵化率分别为76.5％和55.5％，而鲜精对照组为76.5％和44.2％，两组之间无显著差异。
2.鲈鱼精液冷冻保存实施例
(1)鲈鱼精液也是用轻压成熟雄鱼腹部的方法来采集，质量评价方法同前，成活率高于80％的鲈鱼精子用于冷冻和授精实验。
(2)将收集的鲈鱼精液按1∶1(体积比)比例稀释在4℃预冷的含20％DMSO(体积比)的稀释液中，稀释液配方名称为MPRS，组成为：NaCl60.35mM，NaH₂PO₄ 1.80mM，NaHCO₃ 3.00mM，KCl 5.23mM CaCl₂·2H₂O1.13mM，MgCl₂.6H₂O 1.13mM，D-Glucose 55.55mM.鲈鱼精液-稀释液的混合液在4℃下平衡30min后用于冷冻保存实验。
(3)平衡30min后地鲈鱼精液-稀释液混合液分装于2毫升冻存管(每管1.5ml)后立即冷冻，冷冻时，先将冻存管置于液氮面上方6厘米处平衡10min，然后在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中保存。
(4)鲈鱼精子在液氮中保存1天-1年后解冻，解冻时先将冻存管从液氮中提出置于液氮蒸气中平衡5分钟，接着在37℃水浴中快速解冻。多次镜检结果发现，冻精成活率在70-80％之间。
(5)鲈鱼冻精在液氮中保存三天后，解冻授精，当精卵比为20000∶1，40000∶1，80000∶1和320000∶1时，冻精受精率和孵化率与鲜精的都没有显著差异。鲈鱼精子在液氮中保存一年后，解冻授精，在各种精卵比的情况下，冻精受精率与鲜精的也没有显著性差异。说明冻精是完全可以在液氮中长期保存的。
(6)鲈鱼冻精大量授精实验结果。用在液氮中保存一年的3.5ml鲈鱼冻精与230ml鲈鱼卵授精，授精后在原肠中期计算受精率，冻精的受精率达84％，孵化率达90％，与鲜精对照组(96.8％±2.3和87.2％±3.1)无显著差异。
二、以淡水鱼类草鱼精液超低温冷冻保存为例，对本发明的实施方式进行说明
(1)配子收集：在草鱼人工繁殖盛期，挤压成熟雄鱼的腹部，用吸管收集草鱼精液。草鱼卵也是通过轻压成熟雌鱼腹部的方式获得。
(2)精液稀释：在稀释液中添加20％DMSO后，放在4℃下预冷，再将采集的精液与上述混合物以1∶1的比例稀释。所用的稀释液是D-15，其成分是：NaCl 136.75mM，KCl 6.71mM和葡萄糖83.33mM。稀释后的精液在4℃冰箱中平衡20min后冷冻。
(3)精子冷冻及解冻：精液-稀释液的混合液分装于2ml冻存管(每管1.5ml)后，首先置液氮面上方6cm处平衡10min，接着在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中。草鱼精子在液氮中保存2天-2年后解冻。解冻时先将冻存管在液氮蒸汽中平衡5min，然后在37℃水浴中快速解冻。
(4)在液氮中保存2天的草鱼精子授精结果：用在液氮中保存2天的1ml草鱼冻精与15ml卵授精，冻精组受精率和孵化率分别是90.2％±4.7，90％±10，对照组为98％±3.2和91％±4.5。两者无显著性差异。
(5)在液氮中保存2年的草鱼精子授精结果：用在液氮中保存2年的1ml草鱼冻精与15ml卵授精，冻精组受精率是73.％±3.1，鲜精组的为88.5％±0.6，两者差异不显著。
本发明与已有技术对比其特点是：(1)稀释液配方组成较为简单，试剂来源方便；(2)建立了三步降温冷冻模式，冷冻保存效果稳定、可靠，操作简单方便，易于推广；(3)单管精子冻存量从原来的0.25ml麦管增加到1.8ml冻存管，适合于建立精子冷冻库和在渔业生产、遗传育种和种质保存中推广应用；(4)本发明建立的技术在所试验的10多种鱼类中都获得稳定的结果，冻精活率稳定在65％以上，受精率和孵化率都达到鲜精的水平。