用于饲料产品的解毒的角质酶
关于序列表
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发明领域
本发明涉及一种方法，包括使用角质酶处理用于使受到真菌毒素玉米赤霉烯酮污染的饲料产品解毒。
发明背景
谷类上的数种植物病原性和/或收割后镰孢属物种生成家畜和家禽生产者相当关注的有毒物质，例如脱氧瓜萎镰菌醇(deoxynivalenol)、T-2毒素、HT-2毒素、蛇形菌素(diacetoxyscirpenol)和玉米赤霉烯酮(zearalenone)。
玉米赤霉烯酮在全世界见于多种谷类作物，如玉米(maize，corn)、大麦(barley)、燕麦(oats)、小麦(wheat)、黑麦(rye)、稻(rice)、粟(millet)和高粱(sorghum)。在收割之前似乎不发生显著量的玉米赤霉烯酮生成，但是在合适的环境条件下，它易于在贮藏的谷物和小谷粒(small grains)上生成。
当在乙醇生产中使用谷类谷物及消耗淀粉时，玉米赤霉烯酮在发酵副产物中，例如在蒸馏酒干酒糟中浓缩。发酵副产物中的玉米赤霉烯酮含量可以相对于谷类谷物升高为三倍。
该毒素是热稳定的，而且它不受长期贮藏、焙烧(roasting)、或添加丙酸或发霉延迟剂破坏。
尽管它们的结构与类固醇雌激素类不同，但是玉米赤霉烯酮及其数种衍生物拥有雌激素活性。玉米赤霉烯酮经历折叠，使得羟基或潜在羟基变成适当取向的，以便于结合通常结合雌激素的组织受体。
玉米赤霉烯酮是引起不孕不育、流产或其它育种问题的主要毒素，尤其在猪中。青春期前的小母猪中的症状尤其严重，包括扩大的乳房、子宫和外阴肿胀、及卵巢萎缩。在严重的病例中，可发生外阴和直肠脱垂。公猪展现扩大的乳房和萎缩的睾丸。
玉米赤霉烯酮存在于来自用受到污染的谷物喂养的动物的肉以及自受到污染的小麦烤制的面包。虽然罕见人中毒的病例，但是关注人长期暴露于此类雌激素活性的影响。
使用环氧酶或内酯酶灭活真菌毒素，包括玉米赤霉烯酮披露于WO9612414。
需要使受到真菌毒素玉米赤霉烯酮污染的动物饲料产品，例如发酵副产物，包括蒸馏酒湿和干酒糟解毒的其它方法。
发明概述
本发明的发明人发现，用角质酶处理饲料产品能降解饲料产品中的玉米赤霉烯酮。因而，在第一个方面，本发明提供一种用于降解饲料产品中的玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括用角质酶处理所述饲料产品。
在第二个方面，本发明提供角质酶用于降解真菌毒素的用途。
发明详述
玉米赤霉烯酮
在本发明的语境中，术语“玉米赤霉烯酮”包含自某些镰孢属菌种(Fusarium sp.)生成的真菌毒素玉米赤霉烯酮。IUPAC名称是(4S，12E)-15，17-二羟基-4-甲基-3-氧双环[12.4.0]十八-12，15，17，19-四烯-2，8-二酮。术语“玉米赤霉烯酮”还涵盖玉米赤霉烯酮的任何衍生物，其包含对角质酶修饰易感的内部羧酸酯键。
动物饲料产品
术语“动物”包括所有动物，包括人类。动物的例子有牛(包括但不限于母牛(cow)和小牛)；单胃动物，例如，猪(包括但不限于小猪、饲育猪和母猪)；家禽，如火鸡和鸡(包括但不限于仔鸡、蛋鸡)；和鱼(包括但不限于鲑鱼)。
术语“饲料”或“饲料产品”指适合或意图由动物摄取的任何化合物、制备物、混合物或组合物。
饲料产品可以是不含有害水平(unwanted level)的玉米赤霉烯酮的产品，其适合动物消费。饲料产品也可以是怀疑包含有害水平的玉米赤霉烯酮的产品、和/或具有未知水平的玉米赤霉烯酮的产品，包括不包含可检测水平的玉米赤霉烯酮的产品。
优选的是，饲料产品是基于谷物的产品。优选的是，基于谷物的产品包含谷类，例如玉米、小麦、大麦、黑麦、稻、高粱和粟中的一种或多种。还优选的是基于谷物的产品，其包含源自玉米、小麦、大麦、黑麦、稻、高粱和粟中的一种或多种的材料。在一个实施方案中，饲料产品可以例如仅仅衍生自谷类，而且在另一个实施方案中，部分源自豆类(例如大豆)且部分源自谷类。基于谷物的产品可包含整个的或碾碎的谷物，例如湿磨或干磨的谷物，包括含有湿磨或干磨谷物的级分(例如面筋(gluten)、蛋白质、淀粉、和/或油级分)的基于谷物的产品。还优选包含来自酿造和/或发酵方法的副产物，例如酒糟的产品。酒糟指来自含酒精饮料和乙醇燃料生产的副产物。啤酒酒糟(BSG)指使用发芽大麦作为主要原材料的啤酒厂中制造啤酒的残余物。蒸馏酒酒糟(DSG)是蒸馏酒厂中通过自发酵的谷物如玉米、小麦、大麦、黑麦、和稻蒸馏取出酒精后剩下的产物。蒸馏酒酒糟也称作蒸馏酒糟。将湿蒸馏酒酒糟(WDG)干燥以生成干蒸馏酒酒糟(DDG)，其主要用作动物饲料。
角质酶
在本发明的语境中，术语“角质酶”包括酶分类E.C.3.1.1.74所包含的酶。优选下文所述酶以及具有同源序列的酶，尤其是重组的和/或基本上纯化的酶。
角质酶可以源自真菌。具体而言，角质酶可以源自腐质霉属(Humicola)，特别是特异腐质霉(H.insolens)的菌株，更特别的是特异腐质霉菌株DSM1800(US 5,827,719)或镰孢属(Fusarium)，例如大刀粉红镰孢(F.roseumculmorum)，或特别是茄病镰孢(F.solani pisi)的菌株(WO 90/09446；WO94/14964，WO 94/03578)。真菌角质酶也可以源自丝核菌属(Rhizoctonia)，例如立枯丝核菌(R.solani)的菌株或链格孢属(Alternaria)，例如甘蓝链格孢(A.brassicicola)的菌株(WO 94/03578)。角质酶也可以是亲本角质酶的变体，如记载于WO 00/34450或WO 01/92502的那些，通过提述都并入本文。角质酶可以是特异腐质霉角质酶的变体，其包含取代E6Q、G8D、A14P、N15D、E47K、S48E、R51P、A88H、A91H、A130V、E179Q和R189V，其披露于10038.204-WO的第24页第11行。
SEQ ID NO：1是特异腐质霉角质酶的氨基酸序列(对应于US 5,827,719的SEQ ID NO：2的和WO 01/92502的SEQ ID NO：1的成熟部分)，而SEQ ID NO：2是依照WO 94/14964图1D的茄病镰孢的氨基酸序列。
角质酶必须以有效量存在于待解毒的培养基中。优选的是，角质酶以0.01-100mg酶蛋白质每kg干物质，优选0.1-10mg酶蛋白质每kg干物质，或更优选1-5mg酶蛋白质每kg干物质的浓度存在。
培养基
在一个实施方案中，角质酶降解包含饲料产品的培养基中的玉米赤霉烯酮。所述培养基优选是含水的，而且可以是液体、糊体或浆体。为了形成合适的培养基，可以向饲料产品添加水。可以在适合施用于所述培养基的固体或液体配制物中包含角质酶。
在一个实施方案中，角质酶降解玉米赤霉烯酮至一定程度，由此每kg干物质饲料产品的玉米赤霉烯酮含量降低至少于初始量的50％，优选少于60％，更优选少于70％，和最优选少于80％。
本发明的解毒效率取决于例如培养基的缓冲剂、温度、pH和水的可用性。例如，可以在实际角质酶的相对活性为至少50、或60、或70、或80或90％的pH值进行处理。同样地，例如，可以在实际角质酶的相对活性为至少50、或60、或70、或80或90％的温度进行处理。相对于观察到最高活性的pH值处的活性计算相对活性。
培养基中的pH
根据所采用的角质酶的特征等，所采用的培养基中的pH通常应当在5-11的范围中，优选在范围6-10中，例如6.5-8.5。
培养基中的温度
优选的是，应用接近角质酶的最适温度的反应温度。在本发明的众多实施方案中，应当采用10-65℃的范围中的温度，更优选30-50℃。
处理持续时间
处理持续时间取决于处理类型、待处理的项目的类型、培养基的特性(例如温度和pH)及所采用的酶的类型和量等。
继续酶促反应，直至实现期望的结果，之后可以通过灭活酶(例如通过热处理步骤)来终止，或者不这样做。
为了解毒目的，可采用1分钟至1周的范围中的处理时间。在许多情况中，6-48小时的范围中的处理时间会是合适的。
同一性
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性以参数“同一性”来描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用EMBOSS包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定，优选3.0.0版或其后版本。所使用的任选参数是缺口打开罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(EMBOSS版本的BLOSUM62)取代矩阵。使用Needle标记的“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的输出作为百分比同一性，且如下计算：
(相同残基x100)/(比对长度-比对中的缺口总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用EMBOSS包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，见上文)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定，优选3.0.0版或其后版本。所使用的任选参数是缺口打开罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(EMBOSS版本的NCBI NUC4.4)取代矩阵。使用Needle标记的“最长同一性”(使用-nobrief选项获得的)的输出作为百分比同一性，且如下计算：
(相同脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的缺口总数)
同源序列
术语“同源序列”定义为在用规定序列进行的tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，pp.185-219)中给出小于0.001的E值(或期望值)的预测蛋白质。
术语“同源序列”也可以定义为与规定序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％的同一性程度的序列。
实施例
实施例1
酶：重组生产的酶组合物，其包含10038.204-WO第24页第11行披露的来自特异腐质霉的角质酶变体。
测定法：在装有玉米赤霉烯酮30μM，Tris 100mM和酶0.1mg EP/mL的Eppendorf管中的300微升体积中进行反应。在对照反应中，用等量的H2O取代酶体积。将反应于37℃温育24小时，之后通过添加600微升100μM乙腈终止溶液来终止。将反应物保存于-20℃，直至层析分析。
层析分析：将样品离心，并如Smedsgaard(J.Chromatogr.A，1997，760，264-270)所述通过HPLC-DAD对上清液分析玉米赤霉烯酮。DAD扫描200-600nm。在Phenomenex(Torrance，CA)Luna C18(2)10×2mm ID，3微米，柱2上使用线性梯度5％变动至100％乙腈在20分钟里进行分离。相对于对照计算残余玉米赤霉烯酮。结果呈现于表1。
表1：有或无角质酶于pH 7温育24小时后的残余玉米赤霉烯酮。
酶 残余玉米赤霉烯酮(％)
对照 100
角质酶 19
序列表
<110>诺维信公司(Novozymes A/S)
<120>用于饲料产品的解毒的角质酶
<130>11339.204-WO
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>194
<212>PRT
<213>特异腐质霉(Humicola insolens)
<220>
<221>成熟肽
<222>(1)..(194)
<400>1
Gln Leu Gly Ala Ile Glu Asn Gly Leu Glu Ser Gly Ser Ala Asn Ala
1 5 10 15
Cys Pro Asp Ala Ile Leu Ile Phe Ala Arg Gly Ser Thr Glu Pro Gly
20 25 30
Asn Met Gly Ile Thr Val Gly Pro Ala Leu Ala Asn Gly Leu Glu Ser
35 40 45
His Ile Arg Asn Ile Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Pro Tyr Asp Ala
50 55 60
Ala Leu Ala Thr Asn Phe Leu Pro Arg Gly Thr Ser Gln Ala Asn Ile
65 70 75 80
Asp Glu Gly Lys Arg Leu Phe Ala Leu Ala Asn Gln Lys Cys Pro Asn
85 90 95
Thr Pro Val Val Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ile Ala
100 105 110
Ala Ala Val Ser Glu Leu Ser Gly Ala Val Lys Glu Gln Val Lys Gly
115 120 125
Val Ala Leu Phe Gly Tyr Thr Gln Asn Leu Gln Asn Arg Gly Gly Ile
130 135 140
Pro Asn Tyr Pro Arg Glu Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Val Gly Asp
145 150 155 160
Ala Val Cys Thr Gly Thr Leu Ile Ile Thr Pro Ala His Leu Ser Tyr
165 170 175
Thr Ile Glu Ala Arg Gly Glu Ala Ala Arg Phe Leu Arg Asp Arg Ile
180 185 190
Arg Ala
<210>2
<211>199
<212>PRT
<213>茄病镰孢(Fusarium solani pisi)
<220>
<221>成熟肽
<222>(1)..(199)
<400>2
Gly Arg Thr Thr Arg Asp Asp Leu Ile Asn Gly Asn Ser Ala Ser Cys
1 5 10 15
Ala Asp Val Ile Phe Ile Tyr Ala Arg Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn
20 25 30
Leu Gly Thr Leu Gly Pro Ser Ile Ala Ser Asn Leu Glu Ser Ala Phe
35 40 45
Gly Lys Asp Gly Val Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Ala Tyr Arg Ala
50 55 60
Thr Leu Gly Asp Asn Ala Leu Pro Arg Gly Thr Ser Ser Ala Ala Ile
65 70 75 80
Arg Glu Met Leu Gly Leu Phe Gln Gln Ala Asn Thr Lys Cys Pro Asp
85 90 95
Ala Thr Leu Ile Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ala Ala
100 105 110
Ala Ser Ile Glu Asp Leu Asp Ser Ala Ile Arg Asp Lys Ile Ala Gly
115 120 125
Thr Val Leu Phe Gly Tyr Thr Lys Asn Leu Gln Asn Arg Gly Arg Ile
130 135 140
Pro Asn Tyr Pro Ala Asp Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Thr Gly Asp
145 150 155 160
Leu Val Cys Thr Gly Ser Leu Ile Val Ala Ala Pro His Leu Ala Tyr
165 170 175
Gly Pro Asp Ala Arg Gly Pro Ala Pro Glu Phe Leu Ile Glu Lys Val
180 185 190
Arg Ala Val Arg Gly Ser Ala
195