用于治疗和诊断与胰岛素相关疾病的方法和组合物 【发明背景】
细胞蛋白质降解是一系列复杂的相互作用的过程。蛋白质分解代谢具有深远的临床意义。许多病理症状与蛋白质分解的增加有关，经常对患者造成损害。在未经控制的糖尿病(例如糖尿病患者中肌肉实体的丢失)、严重的应激反应(例如外伤、烧伤、脓毒病)、急性心肌梗死、慢性消耗性疾病(例如AIDS、癌症)和其它情况和疾病中经常发生过度的蛋白质和／或肌肉衰竭。
尽管传统上已经将溶酶体蛋白水解看作细胞蛋白降解的主要场所，但是近来的研究已经证实了胞质蛋白水解过程、特别是选择性蛋白水解途径的重要作用，诸如靶向蛋白质的降解和细胞蛋白水解中的短期改变(即通过胰岛素的抑制作用)。蛋白酶体和溶酶体是两种主要的亚细胞蛋白水解区室。这两种区室受胰岛素影响。在极限条件(胰岛素总体缺乏)下激活溶酶体自噬，而在大多数生理和病理生理条件(例如应激反应)下蛋白酶体可以是胰岛素的主要靶向物(例如膳食后蛋白水解的减少)。
前体是在每种生物体中主要各细胞类型的细胞溶胶内发现地普遍存在的圆柱状细胞器，占总细胞蛋白质的1-2％。在发现该前体与高分子量多催化蛋白酶(MCP)相同时，将其名称变为蛋白酶体。多催化蛋白酶具有多个不同的催化位点(多达5个)和SDS凝胶上带有20-35kDa范围多重带的特征带型。多催化蛋白酶及其成分是部分复合蛋白水解系统，该系统包括不同分子形式(15S、20S和26S)和不同途径(ATP依赖性、遍在蛋白质、和非ATP依赖性)。
对该系统的开发已经得到了高度的关注并且发展迅速。近来的证据支持蛋白酶体(胞质蛋白水解复合物)作为细胞蛋白质更新中的中心成分这一结论。蛋白酶体的活性对于遍在蛋白质介导的蛋白水解、胰岛素改变的蛋白水解、抗原加工、编程性蛋白死亡、细胞生长和分化以及许多其它的蛋白水解依赖性细胞功能来说是重要的。尽管在大多数情况下多催化蛋白酶与所有的细胞降解功能有关，但是对于其控制来说几乎不了解。
胰岛素降解酶(IDE)胰岛素酶首先由其对降解胰岛素的相对高的特异性而被鉴定。随后，尽管胰岛素对所述的酶具有最高的亲和性，但是人们已经认识了用于胰岛素降解酶的其它底物。虽然已经有大量关于诸如分子量、蛋白水解活性的类型和最佳pH这样基本特性的不同报导，但是证明所述酶的特征仍然是困难的。特别是蛋白质的纯化难以理解，这是由于不稳定性和随不同的手段而改变的各种性能。通过对同种性的纯化和随后对cDNA的分离已经明确了某些有争论的问题。胰岛素降解酶与传统蛋白酶类没有同源性，而是所提出的带有所需Zn2+而不带有典型Zn2+结合位点的金属蛋白酶新型总纲的最初代表。胰岛素降解酶具有约110，000道尔顿的分子量。
胰岛素降解酶对于细胞加工和降解胰岛素来说是重要的。细胞胰岛素降解的一般特征与该酶的特性相一致，且胰岛素降解酶存在于胰岛素开始降解的内体中。胰岛素的细胞降解产物与公知的胰岛素降解酶的裂解位点相一致。然而，胰岛素降解酶的初级细胞位置是胞质，且该酶存在于所有经检测的细胞类型中、包括不结合和摄入胰岛素的细胞，从而提示胰岛素降解酶具有比单纯的胰岛素降解更宽的功能。这一概念得到了从大肠杆菌到人的生物体中存在胰岛素降解酶及其进化保守性的支持。还证实胰岛素降解酶可以得到试验性地调节并与细胞的生长及分化有关。
胰岛素降解酶已显示出可以调节多催化蛋白酶或蛋白酶体的活性。可以从细胞溶胶中分离出一种胰岛素降解酶和多催化蛋白酶的复合物。在维持这些酶的相关性的条件下，胰岛素抑制了某些而不是所有这种多催化酶的底物的多催化蛋白酶的降解。在通过纯化而分离胰岛素降解酶和多催化蛋白酶后，胰岛素的作用消失。胰岛素降解酶、多催化蛋白酶及其复合物与蛋白质的分解代谢有关。
然而，还没有发现一般可接受的胰岛素的胞内作用，也没有研究过这类作用。对产生胰岛素的胞内作用的已知机理缺乏了解因而解决这些难题的途径受到了限制。由于在介导细胞蛋白水解中蛋白酶体有重要的作用，所以用于改变和评估改变蛋白酶体活性的系统对涉及可变蛋白质分解代谢的疾病诸如糖尿病、应激反应、AIDS、癌症等具有重要的临床意义且有了对这类系统的需求。
发明的概要
本发明涉及用于治疗或缓解绝对或相对胰岛素缺乏(例如过度肥胖的受治疗者中的2型糖尿病)、严重胰岛素抗性、脂类蓄积或脂类合成过度(例如在过度肥胖和／或糖尿病受治疗者中体内脂肪或脂类合成的增加)、或蛋白质分解代谢或降解(例如在患糖尿病或消耗性疾病受治疗者中的肌肉实体的丢失)的疾病症状的方法和组合物并涉及可以在这类方法中使用的肽类。在需要治疗的患者中治疗或缓解这类疾病症状的优选方法包括给患者使用一种多肽，所述的多肽包括一个位于胰岛素的胰岛素降解酶裂解位点侧面的序列。该肽类优选抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的一种或多种活性。在一个实施方案中，治疗或缓解症状的方法可以包括使用一种可抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物活性的肽。
本发明还包括检测上述这些疾病的方法，这些疾病即为绝对或相对胰岛素缺乏(例如过度肥胖的受治疗者中的2型糖尿病)、严重胰岛素抗性、脂类蓄积或脂类合成过度(例如在肥胖和／或糖尿病受治疗者中体内脂肪或脂类合成的增加)、或蛋白质分解代谢或降解(例如在患糖尿病或消耗性疾病受治疗者中的肌肉实体的丢失)。这类检测方法包括在来源于患者的生物样品中测定胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物活性的步骤。在一种优选的检测方法中，将这种活性的水平与合适的对照组的活性水平比较。在一个实施方案中，该方法可以包括测定抑制剂对胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物活性的影响。
在本发明的另一个实施方案中，测定患者的生物样品中胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的活性可用来评估治疗以下这些疾病的疗效，即：绝对或相对胰岛素缺乏(例如过度肥胖的受治疗者中的2型糖尿病)、严重胰岛素抗性、脂类蓄积或脂类合成过度(例如在过度肥胖和／或糖尿病受治疗者中体内脂肪或脂类合成的增加)、或蛋白质分解代谢或降解(例如在患糖尿病或消耗性疾病受治疗者中肌肉实体的丢失)。在该方法中，将这种活性的水平与合适的对照组进行比较以便测定患者的这一活性水平是否已经恢复到或进入了正常的范围。
附图的简要描述
附图1解释了胰岛素降解酶高亲和性配体的肽通过胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物来抑制LLVY的降解。将所述酶的复合物(□)或纯化的多催化蛋白酶(■)在有和没有1μmol／l肽激素类存在的情况下进行培养。比较肽-激素通过该复合物与纯化的多催化蛋白酶对降解的影响(*P＜0．01)。将LLVY降解表示为与仅添加载体相比每60分钟所释放出的荧光百分比(任意单位)。将数值表示为三次独立实验的平均值±SE。所用的缩略同包括：GLC，胰高血糖素；INS，胰岛素；PRO，胰岛素原；RXN，松弛素。
附图2代表的结果表示胰岛素降解酶高亲和性配体的肽类通过胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物来抑制LSTR的降解。将所述酶的复合物(□)或纯化的多催化蛋白酶(■)在有和没有1μmol／l肽激素类存在的情况下进行培养。比较肽-激素通过所述复合物与多催化蛋白酶对降解的影响(*P＜0．05，**P＜0．01)。将LSTR降解表示为与仅添加载体相比每60分钟所释放出的荧光百分比(任意单位)，将数值表示为三次独立实验的平均值±SE。所用的缩写包括：GLC，胰高血糖素；INS，胰岛素；PRO，胰岛素原；RXN，松弛素。
附图3表示肽对多催化蛋白酶使LLE降解几乎没有影响。将酶复合物(□)或纯化的多催化蛋白酶(■)在有和没有1μmol／l肽激素类存在的情况下进行培养。比较肽-激素通过所述复合物与多催化蛋白酶对降解的影响(*P＜0．05)。将LLE降解表示为与仅添加载体相比每60分钟所释放出的荧光百分比(任意单位)，将数值表示为三次独立实验的平均值±SE。所用的缩写包括：GLC，葡萄糖；INS，胰岛素；PRO，胰岛素原；RXN，松弛素。
附图4A和4B代表胰岛素和类似物通过胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物对LLVY降解(A)和LSTR降解(B)的影响的剂量-反应曲线。胰岛素和1ys-pro胰岛素具有基本上相同的作用。B10-asp抑制作用较小，而EQF没有表现出显著的抑制作用。
附图5A和5B的剂量-反应曲线解释了胰岛素和肽类通过水解催化的IDE-MCP对LLVY(A)和LSTR(B)降解的影响。HLVEALY有三个阶段的影响，其中在10-5M时具有最大的抑制作用。LVEALY在10-3M时抑制。
附图6解释了对抑制由MCP-IDE复合物催化的125I胰岛素降解的剂量反应作用。测试了胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素衍生的肽类。B10-asp胰岛素和野生型胰岛素作用相同。EQF胰岛素更有效。肽类HLVEALY和LVEALY在10-6-10-5M范围的浓度下起抑制作用。
附图7解释了FLF通过完整HepG2细胞内的胰岛素发生降解的剂量依赖性抑制作用。将HepG2细胞的分会合培养物除血清过夜，然后用所示浓度的胰岛素处理2小时，随后添加底物(FLF)1小时。将数值表示为至少4次独立实验的仅用载体的FLF降解％的平均值±SEM。EC50为1．5×10-13M胰岛素，最大抑制作用为19．1％。**表示与不添加胰岛素有显著差异的结果(p＜0．01)。
附图8A和8B解释了由胰岛素和胰岛素衍生的肽类对HepG2细胞内FLF通过胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物降解的抑制作用。在添加胰岛素或所述肽后60(A)和120分钟(B)时表示了胰岛素、HLVEALY和LVEALY的剂量反应曲线。
附图9解释了在分离的肝细胞内由FLF通过胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物降解的胰岛素随时间变化的抑制作用，在不添加胰岛素的情况下为0时间的抑制％。
附图10A和10B表示LVEALY(A)和HLVEALY(B)在分离的肝细胞内对FLF通过胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物而降解的影响，在不添加肽的情况下为0时间的降解％。
附图11解释了由胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素衍生的肽对H4细胞内总细胞蛋白质降解的抑制作用。将细胞标记过夜后洗涤；然后测定胰岛素、类似物和肽类的作用。
附图12解释了在未标记情况下预培养3小时后由胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素衍生的肽对H4细胞内总细胞蛋白质降解的抑制作用。将细胞标记过夜后洗涤。在3小时的预培养后评估4小时内的蛋白质降解情况。
附图13解释了对照组和HLVEALY处理的动物的尿排出量。
附图14解释了对照组和HLVEALY处理的动物的体重。
附图15解释了对照组和HLVEALY处理的动物的尿排出量。
附图16解释了对照组和HLVEALY处理的动物的体重。
附图17解释了用胰岛素或胰岛素衍生的肽治疗的糖尿病动物中的初始血糖水平。
附图18解释了用胰岛素或胰岛素衍生的肽治疗的糖尿病动物中的最终血糖水平。
附图19解释了尿N-甲基组氨酸从用胰岛素或胰岛素衍生的肽治疗的糖尿病动物中的排泄量。
附图20解释了用胰岛素或胰岛素衍生的肽治疗的糖尿病动物中血清甘油三酯的水平。
附图21解释了用胰岛素或胰岛素衍生的肽治疗的糖尿病动物中血清β-羟基丁酸酯的水平。
附图22解释了用胰岛素或胰岛素衍生的肽治疗的糖尿病动物中血清未酯化脂肪酸的水平。
附图23表示用胰岛素、HLVEALY和LVEALY治疗的对照组动物和大鼠中的绝对肱骨内上髁(epitrocharis)肌肉重量。
附图24解释了对表示为总体重％的对照组和实验动物中绝对肱骨内上髁(epitrocharis)肌肉重量。
附图25表示用胰岛素、HLVEALY和LVEALY治疗的对照组动物和大鼠中绝对付睾脂肪垫重。
附图26解释了对表示为总体重％的对照组和实验动物中付睾脂肪垫重的影响。
附图27解释了对表示为总腿重％的对照组和实验动物中付睾脂肪垫重的影响。
附图28解释了对表示为总比目鱼肌(solus)重的对照组和实验动物中付睾脂肪垫重的影响。
附图29解释了对表示为肱骨内上髁(epitrocharis)重％的对照组和实验动物中付睾脂肪垫重的影响。
附图30解释了用胰岛素、HLVEALY和LVEALY治疗的对照组动物和大鼠中的体重变化。
附图31表示胰岛素对在标准条件下(18小时标记、3小时洗涤和4小时培养)标记的完整细胞内减少蛋白质降解的剂量依赖性作用。
附图32表示胰岛素和肽类对在不同标记和处理(不洗涤，培养基不含Ca++，而含有氨基酸)条件下与附图31中所用的条件相比标记的完整细胞内减少蛋白质降解的影响。
附图33解释了将葡萄糖掺入用胰岛素和HLVEALY处理的完整脂肪细胞的脂类中的情况。
附图34解释了用胰岛素和HLVEALY处理的完整脂肪细胞内葡萄糖的氧化情况。
附图35解释了在地塞米松、胰岛素和TNF中的相互作用及其对来自呼吸内皮细胞的IL8分泌的作用。
附图36解释了胰岛素和胰岛素衍生的肽类对H4肝细胞内DNA合成的作用。
附图37解释了HLVEALY处理对由肥胖的2型糖尿病大鼠的尿3-甲基组氨酸排泄量的影响。
附图38解释了HLVEALY处理对肥胖的2型糖尿病大鼠脂肪细胞中总脂肪酸氧化的影响。
附图39解释了HLVEALY处理对肥胖的2型糖尿病大鼠脂肪细胞中过氧化物酶体脂肪酸氧化的影响。
发明详述
胰岛素降解酶
胰岛素降解酶是一种金属酶，含有Zn++(和可能是Mn++)且其降解活性需要一种或多种二价阳离子。除Zn++和Mn++外，还表明Ca++可在体外和完整细胞内影响胰岛素降解酶的降解活性。胰岛素降解酶使胰岛素在一些位点上裂解，这些位点包括在B链中的残基9和10、残基10和11、残基16和17、残基24和25以及残基25和26之间。尽管胰岛素是具有最大亲和性的底物，但是胰岛素降解酶也与其它肽类和蛋白质发生相互作用。一般来说，由该酶识别的底物与胰岛素具有某种结构同源性(胰岛素原、胰岛素原中间产物、表皮生长因子[EGF]、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、松弛素和心房肽[ANP])。这一发现已导致得出酶可识别这些蛋白质结构特征的结论。
胰岛素降解酶可以在完整细胞或生物体内被纯化、分离、或研究。该酶可以作为胰岛素降解酶存在、作为它与多催化蛋白酶复合物的一部分存在、或作为其它胞内系统的成分存在。胰岛素降解酶的活性可以使用本领域技术人员公知的各种检测法来测定。使用放射性标记蛋白质底物的典型检测法是使用三氯乙酸来沉淀底物，同时产物保持可溶性。以HPLC为基础检测胰岛素降解酶活性的方法也是本领域所公知的。可以将公知的方法用于监测体外或在完整细胞或生物体内用于监测胰岛素降解酶的活性。
多催化蛋白酶
多催化蛋白酶(MCP)也称作蛋白酶体，具有多重催化位点，包括胰凝乳蛋白酶样的、胰蛋白酶样的和肽基-谷氨酰的降解活性等。这些催化位点降解不同的用于体外和体内检测法中的底物，包括蛋白质和肽类。该多催化蛋白酶可以在完整细胞或生物体内被纯化、分离、或研究。使用本领域技术人员公知的各种检测法可以测定多催化蛋白酶的各种活性。使用放射性标记蛋白质底物的典型检测法是使用三氯乙酸来沉淀底物，同时产物保持可溶性。此外，以肽为基础的检测法是利用肽在多催化蛋白酶或多催化蛋白酶与胰岛素降解酶的复合物裂解时释放的产色或荧光化合物。可以将公知的检测法在体外或在完整细胞或生物体内用于监测多催化蛋白酶或所述复合物的活性。
添加到分离的蛋白酶体中的胰岛素非竞争性地抑制了胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样的活性。这种抑制作用可以用在研究蛋白质对多催化蛋白酶活性的影响，该多催化蛋白酶可以是单独的或它与胰岛素降解酶的复合物的一部分。在体外系统中可以直接评估蛋白酶体活性调节物的作用。胰岛素和相关蛋白质对这种系统具有直接的作用。这具有重要的基础研究意义，同时更为普遍的和临床重要性在于可将该系统用于筛选不相关的物质对蛋白水解的影响。例如，可以使用可渗透底物的膜来检测完整细胞内的蛋白酶体活性。作为一种临床检测法，可以用来筛选患者的血清或其它组织对蛋白酶体活性的作用且重要的是可以评估治疗对蛋白酶体活性的影响。导致蛋白酶体活性降低的治疗方法对蛋白质的分解代谢具有有效的有利作用(例如在患糖尿病或消耗性疾病的受治疗者中维持肌肉重量或减少肌肉的衰竭)。类似地，蛋白酶体活性的降低发生在某些病理条件下，固而一种用于评估增加活性的有效手段在临床上是很重要的。
检测疾病和评估治疗的方法
胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的一种或多种活性测定值可用于检测绝对或相对胰岛素缺乏(例如过度肥胖的受治疗者中的2型糖尿病)、严重胰岛素抗性、脂类蓄积或脂类合成过度(例如在过度肥胖和／或糖尿病受治疗者中的增加的体内脂肪或脂类合成)、或蛋白质分解代谢或降解(例如在患糖尿病或消耗性疾病受治疗者中肌质的损失)的疾病或用于评估对这类疾病的疗效(例如在患糖尿病或消耗性疾病的受治疗者中维持肌肉重量或减少肌肉的衰竭)的方法中。本文描述了用于测定胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的几种活性的方法，它们是本领域技术人员所公知的。
可以在一种合适的生物样品中测定这种活性以便检测或评估绝对或相对胰岛素缺乏(例如过度肥胖的受治疗者中的2型糖尿病)、严重胰岛素抗性、脂类蓄积或脂类合成过度(例如在过度肥胖和／或糖尿病受治疗者中身体脂肪或脂类合成的增加)、或蛋白质分解代谢或降解(例如在患糖尿病或消耗性疾病受治疗者中的肌肉实体的丢失)疾病的治疗情况。合适的生物样品包括血液、血浆、胰、肌肉、脂肪、肝、尿等。然后将测定值与对照组的活性相比较。合适的对照组包括在不同时间的同一患者、有该疾病病史的患者群体、预定的水平等。这种比较确定了诸如患者是否患有这种疾病和该疾病已经发展到了何种程度或已经成功地治疗到了何种程度这样的因素。还可以将这类检测法用于评估实际或候选治疗剂对蛋白质分解代谢的影响。
胰岛素
本文所用的术语“胰岛素”指的是哺乳动物的胰岛素，诸如牛、猪或人胰岛素，其序列和结构在本领域中是公知的。牛、猪和人胰岛素是优选的哺乳动物胰岛素；人胰岛素更为优选。人胰岛素的氨基酸序列和空间结构是众所周知的。人胰岛素由通过二硫键交联的21个氨基酸A-链和30个氨基酸B链组成。适当交联的人胰岛素含有3个二硫键：一个在A链的7位和B链的7位之间，第二个在A链的20位和B链的19位之间，第三个在A链的6位和11位之间。
术语“胰岛素类似物”指的是带有A-链和B-链的蛋白质，具有分别与人胰岛素的A-链和B-链基本上相同的氨基酸序列，但与人胰岛素A-和B-链不同的是具有一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸取代、一个或多个氨基酸添加和／或不破坏所述胰岛素类似物的胰岛素活性的一个或多个侧链改变。
一类胰岛素类似物“单体胰岛素类似物”在本领域中是众所周知的。这类人胰岛素类似物包括例如B28位上的Pro被Asp、Lys、Leu、Val或Ala所取代的人胰岛素、以及其中B29位Lys是Lys或被Pro取代的；还包括AlaB26-人胰岛素、des(B28-B30)人胰岛素和des(B27)人胰岛素。单体胰岛素类似物公开在Chance等于1996年5月7日公告的美国专利5，514，646；Brems等《蛋白质工程》(Protein Engineering)6：527-533(1992)；Brange等《结构生物学的最新观点》(Current Opinion in Structural Biology)1：934-940(1991)中。这些公开文献引入本文作为描述单体胰岛素类似物的参考。本发明制剂中所用的单体胰岛素类似物是与人胰岛素在相同位置上适当交联的一样。
胰岛素类似物还可以带有用酸的形式取代的酰胺化的氨基酸。例如，Asn可以被Asp或Glu取代。同样，Gln可以被Asp或Glu取代。特别地，AsnA18、AsnA21或AspB3或这些残基的任意组合，可以被Asp或Glu取代。此外，GlnA15或GlnB4或它们两者均可以被Asp或Glu取代。另外的胰岛素类似物是那些在其它取化或缺失情况中具有或没有B21上的Asp或B3上的Asp取代或缺失，或者两者均取代的胰岛素类似物。
胰岛素衍生的抑制剂
在绝对或相对胰岛素缺乏(例如过度肥胖的受治疗者中的2型糖尿病)、严重胰岛素抗性、脂类蓄积或脂类合成过度(例如在过度肥胖和／或糖尿病受治疗者中体内脂肪或脂类合成的增加)、或蛋白质分解代谢或降解(例如在患糖尿病或消耗性疾病受治疗者中的肌肉实体的丢失)的情况或疾病中使用一种或多种活性的IDE和MCP复合物的胰岛素衍生的抑制剂代表了一种缓解所述情况或疾病的症状或影响的有效方法。这类疾病包括(但不限于)糖尿病、严重的应激反应(外伤、烧伤、饥饿)、心肌梗死、或慢性消耗性疾病(AIDS、癌症等)。没有预计到这样一种肽对葡萄糖代谢或细胞生长和细胞分裂具有直接的影响，因为胰岛素对这些过程的作用是通过不同机理发生的。直接、潜在的有益作用(降低葡萄糖、减少细胞分裂)是可能的。
胰岛素可抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物的某些活性。从胰岛素衍生的多肽类也可抑制所述复合物的这些活性。例如，通过胰岛素降解酶裂解的胰岛素的多肽产物可抑制所述的复合物。更完全降解的胰岛素、例如包括溶于三氯乙酸的初始物质在内的胰岛素降解产物在抑制所述复合物时效果较小。这表明包括位于胰岛素降解酶裂解位点侧面上的氨基酸序列的胰岛素衍生的多肽类都是所述复合物的有效抑制剂。本文所用的位于裂解位点侧面的多肽是带有一个与裂解位点邻接的序列且其中一个氨基酸通过所述酶进行了键的裂解。
包括位于裂解位点侧面的氨基酸序列的多肽类抑制剂其氨基酸个数较小，可以是约4-约15个氨基酸，优选约5-约8个氨基酸。这类优选的多肽类包括HLVEALY(SEQID NO：1)和LVEALY(SEQ ID NO：2)。这些优选的多肽类分别代表来自胰岛素B-链的10-16位氨基酸和11-16位氨基酸。所述的胰岛素降解酶的胰岛素裂解位点是在B链中的残基9-10、残基10-11、残基16-17、残基24-25和残基25-26之间。因此，所述肽HLVEALY和LVEALY各自位于两个裂解位点侧面。另外位于这些裂解位点侧面的肽类包括例如代表胰岛素B链中的1-9、5-9、1-10、7-10、9-24、9-25、10-24、10-25、16-21、16-25、16-26、17-24、17-25、17-30、24-30和25-30等残基的肽类。也包括这些的某些衍生物，如r-谷氨酰基。
本发明的多肽类、蛋白质和肽类可以通过合成或重组技术来生产。小于约15-20个氨基酸的多肽类可以通过肽合成的众所周知的方法诸如自动固相肽合成法方便地制备。这类多肽类还可以通过重组方法来制备。例如，这类多肽可以作为融合蛋白的一部分来制备或可以将所需序列的重复单位表示为长链聚合物中的多个单位。大于约20-90个氨基酸的多肽类可以通过大量公知的重组方法方便地制备。
胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物的合适抑制剂包括基本上符合上述胰岛素内的氨基酸序列的多肽类。为了达到本发明的目的，多肽的定义基本上符合胰岛素内氨基酸序列，包括符合胰岛素等位变体或突变体内的氨基酸序列的肽类。这些等位变体和突变体具有与天然序列(例如取代、缺失或添加突变体)的高度同源性的序列。基本上符合胰岛素氨基酸序列的多肽类一般具有与天然序列至少约70％、更优选至少约90％的同源性。优选的情况是，基本上符合胰岛素氨基酸序列的多肽类一般具有与天然序列至少约70％、更优选至少约90％的序列同一性。
除基本上符合胰岛素内的氨基酸序列外，本发明中的多肽类还保留了所需胰岛素或胰岛素抑制片段的特性。优选的情况是，本发明的多肽类可维持胰岛素的功能活性以便结合和／或抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物。此外，本发明的多肽类可以是胰岛素降解酶和／或胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的产物或底物。具有另外所需特性(例如耐降解或高的膜渗透性)的这些肽类的类似物或衍生物也包括在本发明内。使用本文所述的体外和其它检测试验系统可筛选潜在有用的化合物。
优选的情况是，本发明胰岛素衍生的多肽变体是通过缺失或保守氨基酸替换来修饰的。一般来说，这类保守氨基酸的置换包括诸如由Dayhoff在《蛋白质序列和结构图谱》5(1978)和Argos在《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J．)8，779(1989)中所述的置换，这些文献引入本文作为参考。例如下列类别之一内的氨基酸的交换代表保守置换：Ⅰ类：Ala、Gly、Ser、Thr和Pro(代表小的脂族侧链和羟基侧链)；Ⅱ类：Cys、Ser、Thr和Tyr(包括-OH或-SH基团的侧链)；Ⅲ类：Glu、Asp、Asn和Gln(代表含有侧链的羧基)；Ⅳ类：His、Arg和Lys(代表碱性侧链)；Ⅴ类：Ile、Val、Leu、Phe和Met(代表疏水侧链)；Ⅵ类：Phe、Trp、Tyr和His(代表芳香侧链)；和Ⅶ类：Lys、Asp、Glu、Asn和Gln。这些类别还包括相关的氨基酸诸如Ⅰ类中的3Hyp和4Hyp；Ⅱ类中的高半胱氨酸；Ⅲ类中的2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、g-羧基谷氨酸、b-羧基天冬氨酸和相应的氨基酸酰胺类；Ⅳ类中的鸟氨酸、高精氨酸、N-甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、高精氨酸、肌氨酸和羟基赖氨酸；Ⅴ类中取代的苯丙氨酸类、正亮氨酸、正缬氨酸、2-氨基辛酸、2-氨基庚酸、抑制素和b-缬氨酸；以及Ⅵ类中的萘基丙氨酸类、取代的苯丙氨酸类、四氢异喹啉-3-羧酸和卤化酪氨酸类。
在本领域技术人员所公知的各种出版物、例如Bachem Biosciences，Inc．(King of Prussia，PA)的目录中可以找到相关氨基酸和氨基酸衍生物的较长编码。此外，这些类型可以包括L和D立体异构体，但对替换来说L-氨基酸是优选的。本文所用的术语“保守性氨基酸替换”还包括由Gribskov等在《核酸研究》(Acid Res．)14(16)，6745(1986)中所述的通常发生的保守性氨基酸替换所鉴定的大量其它的氨基酸替换，该文献引入本文作为参考。在这类保守性氨基酸替换中所包括的是用Cys、Asp或Glu交换Ala；用Asp、Glu或Gln交换Gly或His；用Asn、Phe或Trp交换Ser；用Tyr或Trp交换Leu；以及用Glu、Gln或Arg交换Pro。氨基酸衍生物还可以是磷酸化的氨基酸、γ-谷氨酰氨基酸或另一种天然出现的氨基酸衍生物。优选的情况是，所述氨基酸衍生物是一种在胰岛素或胰岛素降解产物中天然出现的氨基酸衍生物。
另外的多肽抑制剂
某些其它的蛋白质也可抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物的一种或多种活性。这些蛋白质包括心房肽、松弛素、TGFα或胰岛素样生长因子Ⅱ以及来源于这些蛋白质的某些多肽类。例如，通过胰岛素降解酶裂解心房肽、松弛素或胰岛素样生长因子Ⅱ的多肽产物可抑制所述的复合物。这表明来源于这些蛋白质并包括位于胰岛素降解酶裂解位点侧面的氨基酸序列的多肽类是所述复合物的有效抑制剂。包括裂解位点侧面的氨基酸序列的抑制剂多肽类的大小可以约4-约15个氨基酸，优选约5-约8个氨基酸。胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物的合适抑制剂包括带有基本上符合上述蛋白质和上述蛋白质衍生物的氨基酸序列的多肽类。基本上符合前房先天肽(atrial naturetic peptide)、松弛素、TGFα、或胰岛素样生长因子Ⅱ的多肽类以及来源于这些蛋白质的某些多肽类的特征具有与上述符合胰岛素序列相类似。
多肽类的药物组合物
可以将本胰岛素衍生的和其它的多肽类用于药物组合物，该药物组合物用于治疗或缓解诸如糖尿病、严重的应激反应(外伤、烧伤、饥饿)、心肌梗死、和慢性消耗性疾病(AIDS、癌症等)、其它疾病包括绝对或相对胰岛素缺乏(例如过度肥胖的受治疗者中的2型糖尿病)或严重胰岛素抗性、脂类蓄积或脂类合成过度(例如在过度肥胖和／或糖尿病受治疗者中体内脂肪或脂类合成的增加)、和／或蛋白质分解代谢或降解的破坏(例如在患糖尿病或消耗性疾病受治疗者中的肌肉实体的丢失)的疾病症状。
本发明的药物组合物包括有效单位剂量形式的胰岛素衍生的多肽类和药物上可接受的载体。本文所用的术语“有效单位剂量”指的是足以有效治疗或缓解疾病症状的预定量，所示疾病包括绝对或相对胰岛素缺乏(例如过度肥胖的受治疗者中的2型糖尿病)或严重胰岛素抗性、脂类蓄积或脂类合成过度(例如在过度肥胖和／或糖尿病受治疗者中身体脂肪或脂类合成的增加)、或包括蛋白质降解或分解代谢破坏在内的疾病(例如在患糖尿病或消耗性疾病受治疗者中的肌肉实体的丢失)。药物上可接受的载体是用于给药目的的物质，它们优选是无毒的，可以是固体、液体或气体物质，它们也可以是惰性的和医药上可接受的且与可活性组分兼容的。
水、盐、葡萄糖水溶液和乙二醇是优选的液体载体、特别用于(当等渗时)注射用溶液。所述载体可以选自各种油包括石油、动物的、植物的或合成的那些油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、干燥脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。可以将该组合物进行常规的药物上所需的处理诸如灭菌处理，且该组合物可以含有常规的药物添加剂，诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、用于调整渗透压的盐、缓冲剂等。合适的药物载体及其配方描述在Martin的《Remington的药物科学》第15版中，Mack Publishing Co_Easton(1975)；参见例如pp．1405-1412和pp．1461-1487。这类组合物一般含有有效量的活性化合物以及合适量的载体以便制备用于对宿主进行适当给药的合适剂型。
这些药物组合物可通过非肠道给药，包括注射；口服；有或没有离子电渗的贴剂；栓剂或阴道栓剂；局部施用的软膏、霜剂、气雾剂、粉剂；或眼用或鼻用滴剂等，这取决于所述制剂是用来治疗内部疾病还是外部疾病。
所述的组合物可以含有0．1％-99％的活性物质。例如，对于局部给药来说，一般含有0．01％-20％、更优选0．5％-5％的活性物质。
本发明还涉及用于治疗或缓解诸如糖尿病、严重的应激反应(外伤、烧伤、饥饿)、心肌梗死、和慢性消耗性疾病(AIDS、癌症等)、其它疾病包括绝对或相对胰岛素缺乏(例如过度肥胖的受治疗者中的2型糖尿病)或严重胰岛素抗性、脂类蓄积或脂类合成过度(例如在过度肥胖和／或糖尿病受治疗者中体内脂肪或脂类合成的增加)、或包括蛋白质降解或分解代谢破坏(例如在患糖尿病或消耗性疾病受治疗者中的肌肉实体的丢失)的其它疾病在内的疾病症状的方法。一般来说，将所述的组合物根据需要对患者(人或其它动物，包括哺乳动物诸如但不限于猫、马、猪、绵羊、狗和牛以及鸟类物种)按有效量进行给药以便治疗或缓解所述疾病的症状。可以将本组合物经口服、静脉内、肌内或局部进行给药。
对于口服给药来说，细粉或颗粒可以含有稀释剂、分散剂和／或表面活性剂，且它可以以水或糖浆中的饮剂形式、干态的胶囊或小药囊的形式或非水溶液或混悬剂的形式存在，可以包括悬浮剂；在片剂或包衣肠溶的丸剂中可以包括粘合剂和润滑剂，或以水混悬剂或糖浆剂形式。如果需要或必要，可以包括调味剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂或乳化剂。片剂和颗粒剂是优选的，且可以将它们进行包衣。
对于含化给药来说，所述的组合物可以采用常规方式配制片剂或锭剂。
对于非肠道给药或滴剂(如对眼部感染)来说，所述的化合物可以以浓度约0．1-10％、更优选0．5-2．0％、最优选1．2％w／v存在于水溶液中。该溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂等。
还可以将本发明的组合物配制成注射剂且可以以单位剂量形式存在于安瓿中或带有防腐剂的微量容器中。该组合物可以采用溶于油或水载体中得到的混悬剂、溶液或乳剂的这类的剂型，且可以含有各种配方试剂诸如悬浮剂、稳定剂和／或分散剂。或者，可以在使用前将活性组分与合适的载体一起构成粉剂，所述的载体例如无菌无热原的缓冲盐水。本发明组合物还可以是脂质体胶囊的剂型。
可以将所述的组合物作为局部用软膏或霜剂施用于患者身体。所述的化合物可以存在于含有例如水溶性软膏基质的软膏或含有例如水包油霜剂基质的霜剂中，其浓度约为0．1-10％，优选0．5-2．0％，最优选1．2％w／v。对于局部给药来说，对于成人治疗所用的每日剂量范围在0．1mg-1000mg，优选0．5mg-10mg。然而，严重的疾病要使用较高的剂量较好。
还可以将所述的组合物以喷雾剂或滴剂的形式施用于开口部位诸如鼻部、口腔和耳部。例如，可以将所述的组合物以栓剂或霜剂的形式施用于身体的开口部位中诸如直肠和阴道。
对于系统性给药来说，对于成人治疗所用的每日剂量范围为5mg-5000mg的活性组分，优选50mg-2000mg，可以使用l-5个日剂量，这取决于给药途径和患者的情况。当所述的组合物为剂量单位时。各单位优选含有2mg-2000mg的活性组分，例如50mg-500mg。对于严重的感染来说，可以使用例如0．01-10mg／kg／小时的活性组分通过静脉内输注使用所述的化合物。
本发明还包括装有本药物组合物的一种试剂盒且它在使用本发明的方法时使用。该试剂盒可以装有一个小瓶，内含本发明胰岛素衍生的多肽和合适载体(干燥或液体形式)。该试剂盒中的说明书有标记在小瓶上的和／或插在一个盒中，在该盒中装有要用的化合物的小瓶。也可以将该说明打印在装有小瓶的盒上。该说明书中的资料有足够的有关用量和给药方式的信息供该本领域的工作人员进行给药操作。本领域工作人员包括可以进行给药操作的医生、护士或技术人员。
本发明还涉及一种包括胰岛素衍生的多肽和适于本文所述目的或用途的药物组合物。根据本发明，可以将胰岛素衍生的多肽用于制备适于非肠道或口服给药的组合物或药剂。本发明还涉及用于制备适于非肠道或口服剂型的包括胰岛素衍生的多肽的组合物的方法。例如，可以使用常规技术按几种方式制备非肠道或口服制剂。液体制剂的制备可以通过在合适的pH下将胰岛素衍生的多肽溶于诸如水这样的合适溶剂、包括缓冲剂或其它赋形剂中的方法。
参照下面的实施例可以更好地理解本发明。这些实施例用来作为本发明特殊实施方案的代表，而不用来限定本发明的范围。
实施例
实施例1-胰岛素和其它IDE底物抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物的活性
胰岛素降解酶与胰岛素和另外的肽类和蛋白质发生相互作用、与它们结合并使它们裂解。一般来说，由该酶识别的底物与胰岛素有某种结构同源性。这类底物的实例包括胰岛素原、胰岛素原中间产物、表皮生长因子(EGF)、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、松弛素和心房肽(ANP)。在这些底物中，包括胰岛素原、EGF和IGF-Ⅰ在内的几种结合而仅被缓慢地裂解，而其它几种(包括IGF-Ⅱ和ANP)易被降解。令人感兴趣的是确定了这些底物多肽类中哪些是可抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物活性的。
研究设计和方法
特异性标记在TyrA14或TyrB26上的[125I]碘胰岛素由Eli Lilly ResearchLaboratory的Bruce Frank博士提供或由本领域公知的方法制备。结晶猪胰岛素、胰高血糖素、人胰岛素原、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ由Eli Lilly ResearchLaboratory的Ronald Chance博士提供。酶级硫酸铵购自ICNBiomedicals(Irvine，CA)。类似于琥珀酰-leu-leu-val-tyr-7-酰胺基-4-甲基香豆素[LLVY]、CBZ-leu-leuβ-萘基-酰胺[LLE]和boc-leu-ser-thr-arg-7酰胺基-4-甲基香豆素[LSTR]这样的荧光肽类购自Sigma。DEAE-葡萄糖纤维素、苯基琼脂糖、葡萄糖凝胶G-50和Mono-Q购自Pharmacia。Bio-Gel P-200购自Bio-Rad。所有其它的化学物质均为试剂级或更好的级别。
酶样品的制备
由大鼠肌肉制备胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物并通过超速离心和本领域公知的方法进行硫酸铵沉淀来纯化。对于某些实验来说，用DEAE-葡萄糖纤维素进一步纯化所述的复合物。如上所述制备纯化的多催化蛋白酶，随后通过本领域公知的方法进行苯基琼脂糖、Bio-Gel P-200和Mono-Q的层析。
降解活性的测定
使用A14[125I]碘胰岛素或其它标记的胰岛素的降解作用通过三氯乙酸沉淀法来测定，并将其表示为37℃下每15分钟培养的可溶物百分比。
荧光肽类的降解通过本领域公知淀粉来进行并通过在390nm和440nm(LLVY和LSTR)或335nm和410nm(LLE)的激发和发射波长处的荧光来确定。LLVY的降解是通过在37℃下在一种代谢振动器上用溶于0．1M、pH7．5的Tris缓冲液(测试体积，lml)的13μm LLVY将酶样品培养60分钟来测定的。该反应通过在冰上加入0．2ml的乙醇来中止。在具有激发和发射波长分别为390nm和440nm的Sequdia-Turner荧光计上测定因释放的AMC而增加的荧光。将数据以柱分布图表示为每60分钟释放的AMC纳摩尔数或每60分钟产生的荧光单位。
在37℃下，在380nm(缝宽，15nm)的激发波长和440nm(缝宽，5nm)的发射波长处进行LLVY降解的连续监测。用Tris中(2ml的100mM总测试体积、pH7．5)的13μmLLVY培养硫酸铵级分(100μl的1∶10稀释液)并监测因AMC释放所产生的荧光直到产生线性速率为止。将处于10- 5M(220μl，10-4M)的胰岛素导入比色杯，将AMC释放的速率变化与导入的等体积的缓冲液进行比较。另一方面，导入重复剂量的10-6M胰岛素(20μl，10-4M)并将该速率与添加的等体积的缓冲液进行比较。
肽激素对荧光底物降解的影响
酶复合物或完全纯化的多催化蛋白酶用和不用不同浓度的胰岛素、ANP、松弛素、IGF-Ⅱ、胰岛素原、胰高血糖素、EGF或IGF-Ⅰ培养并测定LLVY、LSTR和LLE的降解情况。肽激素对通过胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物降解量的影响与它们对通过纯化的多催化蛋白酶降解的影响进行比较。此外，测定不同的肽和蛋白质(包括胰岛素C-肽、促胰液素、促卵泡激素(FSH)、生长激素、牛血清清蛋白(BSA)、肿瘤坏死因子、α2巨球蛋白、钙调蛋白、缓激肽、牛胰多肽(BPP)、遍在蛋白质、血管活性肠肽(VIP)和缩胆囊素(CCK))的作用并将它们与单独的载体比较。
动力学实验
测定不同底物和胰岛素浓度下LLVY和LSTR通过所述复合物(硫酸铵级分)的降解情况。LLVY或LSTR的浓度在3-67mmol／l之间改变，且将胰岛素的浓度设定为1．0mmol／l、10mmol／l、50mmol／l、0．1μmol／l、0．5μmol／l或1．0μmol／l。在该数据下进行狄克转化。在所有浓度下扣除没有酶存在情况下的背景荧光。使用酪蛋白进行类似的实验。如上所述使用不同浓度的α-酪蛋白(0、2．1、8．5和21mmol／l)测定LLVY的降解。
结果
分离胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物，并观察通过LLVY降解所测定的胰岛素抑制所述复合物中多催化蛋白酶的胰凝乳蛋白酶样的活性。表1表明胰岛素、胰岛素降解酶的底物和LLVY(用于多催化蛋白酶的底物)对从所述复合物中分离后的其它纯化的酶没有直接的影响。这些数据证明胰岛素对LLVY降解的影响需要胰岛素降解酶与多催化蛋白酶之间有相互作用。
表1胰岛素和LLVY对胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物以及纯化的胰岛素降解酶和多催化蛋白酶的活性的影响
测定1mmol／l胰岛素对LLVY降解和40mmol／lLLVY对胰岛素降解的影响。如METHODS中所述，该降解是通过胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物或通过纯化的胰岛素降解酶或多催化蛋白酶进行的。将胰岛素降解活性表示为每15分钟来自胰岛素的可溶性TCA计数的百分比。将LLVY降解表示为每60分钟释放的荧光(任意单位)。数据为来自两次独立实验的平均值±SE。ND表示未测定。
尽管胰岛素是胰岛素降解酶的优选底物，但是其它肽类可以结合这种酶并起底物或抑制剂的作用。将它们中的几种加入到IDE-MCP复合物中及各自加入到纯化的多催化蛋白酶中，测定LLVY的降解情况。公知与胰岛素降解酶有相互作用的所有肽类可通过所述的复合物抑制LLVY的降解，其中胰岛素是最有效的(附图1)。胰岛素降解酶的底物ANP和IGF-Ⅱ以及与胰岛素具有结构同源性的松弛素抑制了所述的复合物。被胰岛素降解酶结合并降解的胰高血糖素和可被结合但是一种极差底物的EGF对纯化的多催化蛋白酶以及所述的复合物具有直接的影响。然而，胰高血糖素对所述的复合物的影响比对纯化的多催化蛋白酶更大。胰岛素原，一种本身难以降解的胰岛素降解的竞争性抑制剂，具有部分的作用。这些数据支持了复合物在胰岛素降解酶的结合和降解与多催化蛋白酶的调节之间存在相互作用的结论。
多催化蛋白酶对其它底物具有蛋白水解活性，因为在多催化蛋白质内存在多个活性位点。本领域中公知胰岛素对带有胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样活性(分别是LLVY和LSTR的降解)的活性具有不同的作用、其影响超过了肽基-谷氨酰水解活性(LLE降解)。附图2和3表明与胰岛素降解酶有相互作用的肽类对LSTR降解的作用类似于对LLVY降解的作用而对通过IDE-MCP复合物的LLE降解没有作用。这些数据支持了胰岛素作用的特异性和IDE与MCP相互作用的特异性的结论。这些数据还证明胰高血糖素对所述复合物的作用不同于其对多催化蛋白酶的直接作用，这是因为激素通过所述复合物而不是通过纯化的多催化蛋白酶减少了LSTR的降解。所关注的还有胰岛素具有较小但是却显著的抑制LLE降解的作用。这些数据支持了胰岛素降解酶具有调节多催化蛋白酶活性和胰岛素不同作用的功用的结论。
在我们的系统中已检测表明，与胰岛素降解酶没有相互作用的大量其它肽类。这些肽类包括胰岛素C-肽、促胰液素、FSH、生长激素、BSA、TNF、I2巨球蛋白、钙调蛋白、缓激肽、BPP、遍在蛋白质、VIP和CCK。这些肽类不会显著改变胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物的蛋白水解活性(未显示数据)。这些数据证明了胰岛素降解酶底物的特异性并证实了抑制作用不是因本体肽或载体的作用所导致的。
除胰岛素、胰高血糖素、和胰岛素原外，最有特征的胰岛素降解酶底物还有IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。IGF-Ⅰ结合到带有相对高的亲和性的胰岛素降解酶，但是降解缓慢、类似于胰岛素原；而IGF-Ⅱ降解迅速、类似于胰岛素。
结论
IDE-胰岛素相互作用以一种与胰岛素公知生物作用相一致的方式改变了胞质蛋白质(多催化蛋白酶)的功能。
这些生物作用包括细胞糖皮质激素作用的降低和细胞蛋白质降解的抑制。
实施例2-活性胰岛素降解酶对于胰岛素介导的对胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的抑制作用是需要的
通过某些公知的蛋白酶抑制剂在不影响多催化蛋白酶相关活性的浓度下抑制胰岛素降解酶。将这些抑制剂用于研究是否需要活性胰岛素降解酶来观察胰岛素对胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的作用。
材料和方法
除下述外，方法和试剂与实施例1中所述。所用的酶制剂使用本领域公知的程序通过硫酸铵分级分离来部分纯化。将所述酶对至少20个体积的乙酸钠(pH6．2)(其中不添加其它物质)、lmM EDTA或1mM EGTA(有三种变化)透析过夜。在所示的浓度下添加二价阳离子的乙酸盐。
结果
通过用EDTA处理而降低了通过胰岛素降解酶的胰岛素降解作用。胰岛素降解酶的这种调节功能也受到EDTA的影响。EDTA处理胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物降低了多催化蛋白酶的胰凝乳蛋白酶样活性，如LLVY低的降解所反映出的。胰岛素和胰岛素降解酶可调节胰蛋白酶样(LSTR降解)以及胰凝乳蛋白酶样(LLVY降解)活性。EDTA处理显著降低了LSTR的降解并消除了胰岛素的作用。
为了进一步测试胰岛素降解酶在控制多催化蛋白酶中的调节功能，检测所筛选的抑制剂(表2)。金属蛋白酶抑制剂二氮杂菲可抑制了胰岛素降解酶并消除了类似于EDTA的胰岛素对LLVY降解的作用。公知是胰岛素降解酶抑制剂，NEM和杆菌肽，也可阻断胰岛素的作用。在低浓度下PMSF没有显著的作用。
表2不同抑制剂对胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的作用
添加物 浓度 IDE(％) LLVY降解
-胰岛素 +胰岛素
无 100 100 51．31，10菲咯啉 0．1mM 44．4 73．1 76．2
1．0mM 0．2 30．6 30．6PMSF 0．1mM 93．7 111．2 68．0
1．0mM 85．3 116．1 62．7NEM 0．01mM 56．0 63．4 66．0
1．0mM 13．4 24．7 18．6杆菌肽 10μg／ml 59．9 71．3 52．0
100μg／ml 24．5 39．2 35．4PCMB 0．05mM 5．1 * *
0．5mM 6．4 * *EDTA 1．0mM 52．4 33．7 28．8
10mM 7．9 32．8 30．1EGTA 1．0mM 50．0 44．0 44．0
10mM 5．7 31．0 29．6
*没有LLVY降解。
如“材料与方法”中所述制备IDE-MCP制剂。在有所示浓度的抑制剂或载体存在的情况下测定胰岛素和LLVY的降解情况。在有1．0μM或仅有载体存在的情况下测定LLVY的降解。将数值表示为仅有载体存在情况下的降解活性的％。数据是四次独立实验的平均值。
表3比较了胰岛素降解酶抑制剂对胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的蛋白水解活性和对相应的纯化多催化蛋白酶活性的影响。当将多催化蛋白酶与胰岛素降解酶复合时，菲咯啉、NEM和杆菌肽均可抑制LLVY降解，而这些试剂对纯化的多催化蛋白酶无效。这些发现支持了胰岛素降解酶对多催化蛋白酶活性具有调节作用的结论。
表3IDE抑制剂对MCP活性LLVY降解活性的作用(相对的％)
添加物 IDE-MCP 纯化的MCP
无 100％ 100％菲咯啉(0．2mM) 21％ 95％NEM(0．2mM) 3％ 100％杆菌肽(1．0mM) 10％ 85％
结论
胰岛素降解酶的活性对于所观察到的胰岛素对胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的作用是需要的。
实施例3-胰岛素片段抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物
实施例2中所报导的结果表明，胰岛素对于胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的作用是需要有活性胰岛素降解酶存在。这就提出了由胰岛素降解酶降解的胰岛素产物可以决定该胰岛素在该复合物中的作用。
材料和方法
除下述外方法和试剂如实施例1和2中所述。为了测试胰岛素片段的作用，用胰岛素降解酶培养胰岛素并在SephadexG-50柱上分离产物。收集完整胰岛素后洗脱的产物(胰岛素片段的不均匀混合物)并将其加回到胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物中。检测LLVY通过粗物质(硫酸铵纯化的)和纯化的复合物降解的抑制作用。
结果
如表4中所示，胰岛素降解产物抑制LLVY的降解作用比10-7mol／l胰岛素更为有效。
表4胰岛素和胰岛素降解产物对多催化蛋白酶活性的影响
数据为100％。将数值标准化为未添加的MCP活性。在有胰岛素(0．1μmol／l)或由胰岛素降解酶产生且然后通过Sephadex G-50层析纯化的的胰岛素降解产物(浓度未知)存在的情况下测定不同纯化阶段的LLVY-MCP的降解情况。
由于上述实验使用了高浓度但未测定浓度的胰岛素降解产物且由于某些胰岛素片段是胰岛素降解酶的底物，所以表5中所报导的实验对其检测更为仔细。用含有微量B26碘胰岛素的5×10-8mol／l的胰岛素将高度纯化的胰岛素降解酶培养不同的时间。通过TCA沉淀法来评估胰岛素的降解情况。在所示的时间处，与LLVY或LSTR一起添加胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物(硫酸铵制备法)。在添加60分钟后检测这些底物的降解情况(表5)。表5培养时间对产生的胰岛素降解产物和多催化蛋白酶活性的作用
数值是每小时产生的荧光(LLVY或LSTR降解)或TCA溶解度的百分比。通过用纯化的胰岛素降解酶将胰岛素(50nmol／l)预降解所示的时间而产生不同大小和浓度的胰岛素降解产物。然后加入含有IDE-MCP的酶复合物并测定预降解的胰岛素对LLVY降解的影响。胰岛素在预培养中的降解程度近似为TCA的溶解度。
正如所观察到的，不经过预培养的5×10-8mol／l胰岛素抑制的LLVY降解达27％且抑制LSTR降解达30％。在与纯化的胰岛素降解酶接触5分钟后，胰岛素的TCA溶解度为3％，在15和30分钟后分别上升到12．3％和22．1％。正如在本领域中已经证明的，TCA溶解度明显将实际降解程度估计过低，因为部分降解的胰岛素保留了TCA感受性。根据高效液相层析法研究了实际缺失的完整胰岛素比产生的TCA可溶性片段高3-4倍。因此，降解的胰岛素分别在5、15和30分钟时占～10、40和80％。尽管如此，所有的时间点均表明了LLVY和LSTR降解的抑制作用，这表明胰岛素降解产物还可影响多催化蛋白酶的活性。通过胰岛素及其产物损失的抑制作用近似为产生的可溶性TCA的放射活性。这提示了不与胰岛素降解酶结合的低分子量产物是无效的。
结论
胰岛素通过胰岛素降解酶的降解产物可抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物。
实施例4-胰岛素衍生的肽类抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物
使用带有胰岛素片段序列的合成肽类进一步研究胰岛素片段抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的能力。
材料和方法
除下述外，方法和试剂如实施例1和2中所述。使用固相肽合成的标准方法来合成带有胰岛素B-链中的10-16位氨基酸和11-16位氨基酸的序列的肽类。这些肽类分别带有序列HLVEALY和LVEALY。
结果
使用用于胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的胰凝乳蛋白酶样、胰蛋白酶样、谷氨酰转移酶和蛋白质降解活性的检测法来测定胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素衍生的肽类的作用。胰岛素和lys-pro胰岛素表现出胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样活性的最高水平的抑制(附图4A和AB)。肽类HVEALY和LVEALY在10-6-10-5摩尔之间表现出抑制作用(附图5A和5B)。胰岛素、胰岛素类似物和每一种肽类没有表现出对胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的谷氨酰转移酶活性的显著抑制作用。当测定125I-胰岛素通过胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物水解的降解情况时，胰岛素及其全长类似物表现出最强的抑制作用(附图7)。所述肽类在10-6-10-5摩尔之间再一次表现出抑制作用。
结论
几种胰岛素和胰岛素衍生的肽类HLVEALY和LVEALY各自抑制了胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的胰凝乳蛋白酶样、胰蛋白酶样和一般蛋白质的降解活性。
胰岛素降解酶裂解了残基B9-10、残基B10-11和残基B16-17之间的胰岛素。B10-16(HLVEALY)肽具有胰岛素样作用。B11-B16(LVEALY)肽在高浓度下具有作用。在B10处取代的胰岛素类似物(B10ASP)比胰岛素的作用低。在B16-B17处取代的胰岛素类似物(EQF)没有作用。
实施例5-在完整细胞内胰岛素抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物
本研究证实了胰岛素对细胞蛋白质降解的主要作用是因为对蛋白酶体活性的作用。
材料和方法
除下述外，方法和试剂如实施例1和2中所述。HepG2细胞系是OmahaVAMC的D．Clemens给予的。Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)来自Life Technologies(Gand Island，NY)。胎牛血清来自Intergen Co．(Purchase，NY)。荧光底物甲氧基琥珀酰-phe-leu-phe-7-酰胺基4-三氟甲基香豆素(FLF)来自Enzyme Systems Products(Dublin，CA)。钙蛋白酶抑制剂N-乙酰基-leu-leu-正亮氨酸(钙蛋白酶抑制剂Ⅰ，ALLN)和N-乙酰基-leu-leu-甲硫氨酸(钙蛋白酶抑制剂Ⅱ，ALLM)来自Sigma(St．Louis，MO)。
肽通过部分纯化的多催化蛋白酶的降解
通过本领域公知的方法从大鼠骨骼肌的细胞溶胶中部分纯化多催化蛋白酶(蛋白酶体)。在37℃下，在含有FLF(13μM终浓度)的Tris缓冲液(0．1M，pH7．5)中使用所示浓度的胰岛素将所述的酶培养60分钟。用冰冷乙醇中止反应并分别在390nm和515nm的激发和发射波长处测定因释放7-酰氨基-4-三氟甲基香豆素而产生的荧光。
完整细胞内的细胞培养和肽的降解
将人肝癌(HepG2)细胞维持在5％ CO2／95％空气环境中补充了10％胎牛血清的DMEM中。对于肽的降解试验来说，在处理前将分会合培养物除血清过夜(18小时)。用膜渗透底物(FLF)通过改变预先公开的方法来评估肽的降解情况。在用激素和／或抑制剂处理后，将FLF加入到细胞中至终浓度为13μM并培养1小时。由添加FLF而得的DMSO的浓度不超过0．04％。然后通过超声处理破碎细胞并将所得细胞培养基／裂解物在如上所述的荧光计上读数。
对细胞肽降解的抑制剂研究
通过在如上所述添加胰岛素和／或FLF前用抑制剂将细胞处理2小时来检测蛋白酶抑制剂对HepG2细胞使FLF降解的作用。由溶于DMSO的储备溶液制备钙蛋白酶抑制剂Ⅰ和Ⅱ(分别为ALLN和ALLM)。来自添加的抑制剂的DMSO的浓度不超过0．15％。
结果
胰岛素以剂量依赖性方式抑制FLF的降解，所计算的EC50=1．1×10-6M。因此，FLF表现的作用非常类似于LLVY的蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样底物在体外的作用。在人肝癌(HepG2)细胞内检测FLF的胞内降解。为了测定FLF作为蛋白酶体底物的特异性，使用蛋白酶抑制剂。钙蛋白酶抑制剂ALLN和ALLM在纳摩尔浓度下抑制钙蛋白酶和组织蛋白酶，具有类似的潜能。但是在微摩尔浓度下ALLN和ALLM对蛋白酶体也有抑制作用，且具有显著的不同潜能。由于与多催化蛋白酶催化的FLF水解相一致，所以ALLN抑制微摩尔浓度范围内的FLF降解，而ALLM几乎没有作用。这些结果证实HepG2细胞内的大多数FLF降解是因为蛋白酶体所导致的。
检测完整细胞内胰岛素对蛋白酶体活性的作用。正如附图7中所示，胰岛素以抑制剂量依赖性方式抑制FLF降解，这与肝癌细胞内对总蛋白质降解的胰岛素浓度依赖性作用相一致。所计算的EC50(10-13M)在药理上是相关的。最大抑制作用为19％，这与其它研究中胰岛素对蛋白水解的抑制作用相一致。使用钙蛋白酶抑制剂的另外的对照组显示了所观察的胰岛素对多催化蛋白酶活性的作用。
结论
本研究致力于检测胰岛素对完整细胞内蛋白酶体活性的潜在影响。胰岛素通过分离的蛋白酶体和完整细胞抑制FLF降解。细胞的抑制作用是有浓度依赖性的，该浓度是与使用转化的肝细胞进行的上述研究相比而得出的所需浓度，该转化的肝细胞对胰岛素高度敏感。大量的抑制作用与胰岛素对蛋白质降解的抑制作用的公知功能相一致。本研究支持了胰岛素控制完整细胞内的蛋白酶体活性的作用的结论。
实施例6-在完整细胞内，活性IDE是胰岛素介导的胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的抑制作用所需要的
本研究测定了活性胰岛素降解酶对于使用抑制酶的抗体使完整细胞内蛋白质降解的胰岛素抑制作用来说是否需要。
材料和方法
除下述外方法和试剂如实施例1、2和5中所述。蛋白酶体抑制剂lactacystin来自E．J．Corey(Harvard University)。
细胞蛋白质降解：使雄性Sprague-Dawley大鼠禁食过夜并通过改变Terris和Steiner的方法来分离肝细胞。以106细胞／ml的近似密度将细胞重新悬浮于细胞缓冲液中并在37℃下培养30分钟。细胞的生存力约为90％。通过用含有3H-亮氨酸和5X正常血清浓度的未标记的氨基酸(不包括亮氨酸)的缓冲液标记细胞60分钟、然后用2mM未标记的亮氨酸洗涤并追踪来测定细胞蛋白质的降解。将细胞分成3部分，并加入30μg／ml抗-IDE抗体C20-3．1a(3)、非特异性鼠IgG(30μg／ml)或PBS缓冲液。随后向这些系统中的每一种中加入或不添加下列物质：5X氨基酸、10nM猪胰岛素或不加。将5次正常血清浓度的氨基酸用作阳性对照以便证明通过质量作用抑制蛋白质降解而与胰岛素的调节系统无关。在37℃下培养细胞并在0和120分钟时取0．5ml的等分试样并计数。通过0时和120分钟时的溶解度(在12．5％TCA中)差异来测定细胞降解情况。
体外蛋白酶体活性：通过本领域公知的方法从大鼠骨骼肌中获得与多催化蛋白酶复合的部分纯化的胰岛素降解酶。用增加量的抗-IDE抗体C20-3．1A将IDE-蛋白酶复合物预培养5分钟。通过生产的可溶性三氯乙酸计数来测定A14位上125I标记的胰岛素的降解。使用用于分别测定胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样活性的LLVY和LSTR来测定蛋白酶体的活性。
抗体研究：将HepG2细胞的分会合培养物除血清过夜，然后通过Okada和Rechsteiner的方法以等渗方式填入抑制性抗-IDE单克隆抗体C20-3．1A(50μg／ml)。使细胞恢复1小时。加入荧光蛋白酶体底物FLF并将细胞培养1小时。如上文所述测定因FLF降解产生的荧光。
结果
表6中所报导的结果表明了胞内胰岛素-IDE对总细胞蛋白质降解的影响。通过用胰岛素或过量的氨基酸培养可减少蛋白质降解。还用可抑制胰岛素降解酶活性的单克隆抗体培养预先标记的细胞。抗体处理的细胞不再通过减少的蛋白质降解对胰岛素有反应而对添加的通过质量起作用的5倍过量的氨基酸有反应，与胰岛素无关。这些数据表明了细胞内胰岛素降解酶对抑制蛋白质降解的胰岛素反应的选择性作用。
表6抗-IDE抗体消除了分离的大鼠肝细胞中的蛋白质降解的抑制作用无抗体抗-IDE非特异性IgG对照组1001001005X氨基酸78．8±4．685．0±2．478．4±6．5胰岛素83．5±6．499．7±2．578．2±6．2
通过释放放射性标记的氨基酸所测定的细胞蛋白质降解受到缓冲液中胰岛素和过量的氨基酸或非特异性IgG的抑制。然而，在有抗-IDE抗体存在的情况下，胰岛素不再抑制蛋白质降解。将该数据表示释放的标准化的可溶性标记物与不用胰岛素或过量氨基酸培养的细胞内的标记物之比的百分比。
表6中的数据没有表明胰岛素-IDE作用的特异性位点。因为我们已经证实了胰岛素-IDE-蛋白酶体的相互作用，所以用含有或不含胰岛素的不同量的抗-IDE抗体培养所分离的蛋白酶体(表7)。使用人工底物检测蛋白酶体中两个不同的催化位点-胰蛋白酶样和胰凝乳蛋白酶样。如上所示，胰岛素抑制了LLVY(胰凝乳蛋白酶样)和LSTR(胰蛋白酶样)的降解。抗-IDE抗体以一种剂量依赖性方式阻断了胰岛素对LLVY和LSTR的降解的作用。
表7用单克隆抗体抑制IDE降低了胰岛素体外抑制蛋白酶体的作用
在有增加量的抗-IDE抗体存在的情况下测定胰岛素降解情况。将数据表示为每15分钟酸溶性计数的百分比。在有或没有1μM胰岛素存在的相同条件下测定蛋白酶体的活性。将数据表示为与没有胰岛素存在情况相比蛋白酶体活性抑制作用的百分比。数据为3次独立实验的平均值±SEM。
我们还证明胰岛素的体内作用还包括通过监测在培养的肝癌细胞内经多催化蛋白酶的荧光底物(FLF)的降解而由胰岛素降解酶的介导作用。将这些细胞以等渗方式掺入胰岛素降解酶抑制性单克隆抗体或仅掺入载体。在培养过夜以便回收后，将胰岛素加入到细胞中并检测FLF的降解。在仅掺有载体的细胞中，胰岛素如预计的那样以一种剂量依赖性方式抑制了蛋白酶体的活性。含有抑制性抗体的细胞对激素有显著减弱的反应。
结论
在本实施例中，将抑制胰岛素降解酶活性的抗体用于证明胰岛素降解酶对于完整细胞内蛋白质降解的胰岛素抑制作用来说是需要的。抗-IDE抗体阻断了胰岛素对预先用放射活性氨基酸标记的蛋白质的细胞降解的作用。抗-IDE抗体还降低了完整细胞内特异性底物的蛋白酶体降解的胰岛素抑制作用。这些数据表明胰岛素通过胰岛素降解酶在胞内起作用以便通过所述蛋白酶体抑制蛋白质降解。
实施例7-在完整细胞内，胰岛素衍生的肽类抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物
研究胰岛素衍生的肽类HLVEALY和LVEALY以测定它们对完整分离的大鼠肝细胞初级培养物内和肝培养物细胞系HepG2内的胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物活性的影响。
材料和方法
方法和试剂如实施例1、2、5和6中所述。
结果
胰岛素和胰岛素衍生的肽类HLVEALY和LVEALY可在HepG2细胞内抑制胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的FLF降解(附图8A和8B)。在细胞与该蛋白质接触后至少120分钟时观察到了胰岛素的抑制作用。在添加肽后的60分钟时而不是在添加肽后的120分钟时观察到了抑制作用。还在分离的肝细胞中检测了胰岛素对肽类的作用(附图9)。胰岛素的抑制作用显然持续达约90分钟。肽LVEALY在10-10摩尔的抑制作用是暂时的，在添加肽后120分钟时消失(附图10B)。
结论
胰岛素衍生的肽类HLVEALY和LVEALY抑制了胰岛素降解酶与多催化蛋白酶的复合物在完整细胞内的蛋白酶活性。
实施例8-在完整细胞内，胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素衍生的肽类抑制总细胞蛋白质降解
在有胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素衍生的肽类存在的情况下测定总细胞蛋白质降解情况以便确定这些胰岛素降解酶与多催化蛋白酶复合物的多肽类是否在细胞内具有蛋白质更新的作用。
实验1
材料和方法
除下述外，方法和试剂如实施例1、2、5和6中所述。肝细胞细胞系是H4，将它用于如上文对细胞系HepG2所述的实验研究。
结果
在附图11所解释的带有结果的实验中，将细胞标记过夜、洗涤且然后使蛋白质降解在有不同浓度的胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生的肽存在的情况下进行3小时。胰岛素在生理浓度10-11-10-9摩尔时抑制蛋白质降解。带有B-链10位氨基酸改变的突变体胰岛素比胰岛素的抑制程度低。肽LVEALY没有表现出蛋白质降解的显著抑制作用。肽HLVEALY在10-9-10-7摩尔的浓度时产生了显著的蛋白质降解抑制作用。
在附图12所解释的另一个实验结果中，将细胞标记过夜并洗涤，且预培养3小时。然后将抑制剂加入并在4小时结束时评估蛋白质降解情况。胰岛素和胰岛素类似物B10和EQF抑制了蛋白质降解。肽LVEALY没有表现出显著抑制作用。肽HLVEALY在10-10和10-9时表现出抑制作用。
结论
胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素衍生的肽有效地抑制了完整肝细胞内的蛋白质降解。
实验2
在不同标记和与肽类接触的条件下在有胰岛素和胰岛素衍生的肽类存在的情况下测定总细胞蛋白质降解情况以便确定这些条件是否影响细胞内蛋白质转换的这些多肽的抑制作用。
材料和方法
在本实验中培养的肝细胞(H4细胞)用[3H]亮氨酸培养不同时间。然后洗涤掉未结合的标记并将细胞用过量未标记的亮氨酸培养。用不同浓度的胰岛素和胰岛素衍生的肽处理细胞。通过产生的如上文所示的酸溶性放射活性来检测蛋白质降解情况。否则，方法和试剂如实施例1、2、5和6中所述；肝细胞细胞系是H4，将它用于如上文对细胞系HepG2所述的实验研究。
结果
在两种不同标记条件下胰岛素和肽类对蛋白质降解的作用如附图31和32中所示。附图31表明了在标准条件下(18小时标记、3小时洗涤和4小时培养)胰岛素减少蛋白质降解的剂量依赖性。HLVEALY具有非常类似于用分离的蛋白酶体观察到的三阶段影响(参见上述实施例4和附图5A和5B)。LVEALY具有类似而几乎不明显的作用。附图32表明在不同标记和处理条件下(不洗涤、培养基不含Ca++而含有氨基酸)胰岛素和肽的作用。在这些条件下两种肽在相对于胰岛素的较低浓度时减少了蛋白质降解，而总的影响很小。
结论
两种肽在两组条件下在培养的肝细胞中减少了蛋白质降解。
实施例9-动物体内胰岛素衍生的肽类抑制总细胞蛋白质降解
评估了胰岛素衍生的肽类影响大鼠中绝对或相对胰岛素缺乏或严重胰岛素抗性和蛋白质分解代谢症状的能力。
材料和方法
将糖尿病型Sprague-Dawley大鼠分成治疗组和对照组。通过从植入的渗透泵对大鼠连续输注载体或胰岛素衍生的肽。以μg／小时计的肽的剂量如附图13-16中所示。通过本领域公知的方法对动物评估尿的排泄量和机体的成分。
结果
在第一个实验中，将未治疗的糖尿病大鼠(n=1)与胰岛素治疗的(n=2)和HLVEALY肽治疗的(n=1)大鼠进行比较。结果报导在附图13和14中。HLVEALY肽在0．5μg／小时和1μg／小时剂量下对尿的排出量、体重和各种肌肉和器官的重量有显著和持续的作用。这些数据证明了缓解大鼠中绝对或相对胰岛素缺乏或严重胰岛素抗性和蛋白质分解代谢疾病症状的明显的生物作用。在这些研究中，所述的肽实际上降低了脂肪垫和骨骼肌的大小。该肽对葡萄糖水平没有影响。
在第二个实验中，将胰岛素治疗的糖尿病大鼠(n=1)与用胰岛素和HLVEALY肽治疗的大鼠(n=1)进行比较。结果报导在附图15和16中。此外，HLVEALY对尿的体积和身体与器官的重量有显著作用。在5μg／小时和8μg／小时的剂量下HLVEALY增加的脂肪垫和骨骼肌的重量超过了未治疗的和胰岛素治疗的糖尿病对照组。所述的肽对葡萄糖水平没有影响。
结论
这些数据证明了HLVEALY肽对相关动物模型中绝对或相对胰岛素缺乏或严重胰岛素抗性和蛋白质分解代谢疾病症状的明显的生物作用。
实施例10-在糖尿病型动物中，胰岛素衍生的肽类通过消耗储存的脂肪来维持肌肉实体
评估了胰岛素衍生的肽类影响大鼠中绝对或相对胰岛素缺乏或严重胰岛素抗性和蛋白质分解代谢疾病症状的能力。
材料和方法
通过用链脲佐菌素处理来制备糖尿病型大鼠并植入皮下微型渗透泵。所述微型泵给予了缓冲液、每小时0．1-0．8μg的HLVEALY、每小时0．05-5．0μg的LVEALY或每小时0．1-2．5μg的这两种肽的组合物。通过微型泵(定时胰岛素，2．4U／7天)或通过皮下注射(每天1．5-3．5单位的PZI胰岛素)给予胰岛素。
每天测定血糖水平和尿3-甲基组氨酸水平。在6天后处死动物并测定器官的重量。将获得的血液用于各种代谢产物的检测试验。
结果
附图17和18分别表示初始和最终的血糖水平。胰岛素治疗显著降低了葡萄糖水平。所述肽类产生了轻度而不显著的降低葡萄糖的作用。
附图19表示尿N-甲基组氨酸的排泄量。在本领域中N-甲基组氨酸水平与肌肉衰竭的水平相关。附图19的这种测定结果表明在糖尿病中肌肉衰竭的程度增加而被胰岛素降低。HLVEALY在减少肌肉分解代谢方面与胰岛素同样有效。LVEALY没有显著的作用。
附图20、21和22分别表示甘油三酯类、β-羟基丁酸酯和非酯化脂肪酸类的血清水平。所有这些成分都因糖尿病而增加而被胰岛素的治疗所降低。HLVEALY可将甘油三酯类储存至对β-羟基丁酸酯和非酯化脂肪酸类没有显著性作用的非糖尿病水平。LVEALY对任何这些物质的水平没有显著性作用。
在这些短期实验中观察到了对机体或器官重量没有显著性作用。在5次实验中的4次中(不包括非糖尿病型动物的一次实验)HLVEALY表现出某种维持肌肉重量和减少身体脂肪的作用(附图23-30)。附图23表示对照组动物和用胰岛素、HLVEALY和LVEALY治疗的大鼠中绝对肱骨内上髁(epitrocharis)的肌肉重量。附图24说明将对照组和实验动物中对肱骨内上髁的肌肉重量的作用表示为总体重的％。附图23和24中的结果证明LVEALY实际上降低了这种代谢活性肌肉的重量而LVEALY倾向重量增加。然而，付睾脂肪垫倾向于在HLVEALY治疗的动物中甚至比在未治疗的的糖尿病动物中低(附图25和26)。在脂肪垫与完整腿、比目鱼肌(solus)和肱骨内上髁之比中观察到了类似的倾向(附图27-29)。HLVEALY治疗动物的总体重倾向于较低(附图30)。
结论
HLVEALY治疗可减少糖尿病大鼠中的肌肉衰竭。这种治疗倾向于以消耗脂肪储存为代价维持肌肉。对脂肪更新的作用得到HLVEALY治疗大鼠中血清甘油三酯类的降低这一结果的支持。
这些数据证明了HLVEALY肽对相关动物模型中绝对或相对胰岛素缺乏或严重胰岛素抗性和蛋白质分解代谢的疾病症状的显著生物作用。
实施例11-在完整细胞内，胰岛素和胰岛素衍生的肽类减少蛋白质降解和脂类合成；并增加葡萄糖的转运、葡萄糖的氧化和IL-8的分泌；而胰岛素衍生的肽类不影响DNA的合成
在有胰岛素和胰岛素衍生的肽类存在的情况下测定几种细胞胰岛素反应的特性以便确定这些多肽类是否对完整细胞内蛋白质降解、脂类合成、葡萄糖转运或氧化、IL-8分泌和DNA合成有作用。
实验1
如上文所述的那些可接受模型的胰岛素功能包括对脂肪沉积和代谢中的胰岛素加工和降解以及蛋白质更新的作用。这种研究检测了胰岛素和肽对分离的脂肪细胞代谢的作用。
材料和方法
通过下文所述的方法和通过本领域常用的方法获得和培养脂肪细胞。此外，试剂和方法一般如实施例1、2、5和6中所述。通过本领域技术人员公知的方法测定葡萄糖代谢。
结果和讨论
肽类对脂肪细胞内的胞内葡萄糖代谢的作用如附图33和34中所示。
胰岛素可增加脂肪细胞内葡萄糖的转运是已知的。这是一种在迅速与胰岛素接触时发生、不会通过胰岛素的加工而改变的胰岛素作用，且因此，本研究中不涉及它。随后可以将葡萄糖储存为脂肪(一种中间体作用)或将其氧化。
在完整的脂肪细胞中，HLVEALY减少了引入脂类的葡萄糖的量(附图33)并增加了葡萄糖的氧化(附图34)。
结论
以本文所报导的糖尿病大鼠研究为基础预计胰岛素衍生的肽减少葡萄糖进入脂类和增加葡萄糖氧化的作用。这些作用与现存的胰岛素作用知识相一致。
这种作用表明胰岛素衍生的肽类可以对过度肥胖(脂肪储存是首要问题的胰岛素抗性2型糖尿病)有显著的临床效果。
实验2
胰岛素即使在非典型胰岛素敏感性的细胞内也可调节许多生理途径。例如，如上文所述许多这些途径对胰岛素具有中间体反应。内皮细胞可改变对胰岛素有反应的细胞因子分泌，该胰岛素作为主要刺激剂的调制剂。
材料和方法
通过本领域常用的方法获得和培养内皮细胞。此外，试剂和方法一般如实施例1、2、5和6中所述。通过本领域技术人员公知的方法进行IL-8的刺激并测定其水平。
结果
地塞米松、胰岛素和TNF中的相互作用及其对来自呼吸内皮细胞的IL8分泌的作用如附图35中所示。胰岛素可增加TNF刺激的细胞内的IL8分泌。LVEALY(肽D)对TNF刺激的IL-8分泌没有显著作用。HLVEALY(肽B)对TNF刺激的IL-8分泌的作用比胰岛素更大。类似地，在用TNF加地塞米松处理细胞时，LVEALY没有显著作用，而HLVEALY表现出比胰岛素更大的作用。
结论
此外，模拟胰岛素细胞作用的胰岛素衍生的肽的选择性作用是明显的。
实验3
在不涉及胰岛素加工和降解的胰岛素这些作用中，有一个作用是胰岛素可刺激DNA的合成。对胰岛素衍生的肽类评估其对DNA合成的作用。
材料和方法
除下述外，方法和试剂如实施例1、2、5和6中所述。肝细胞细胞系是H4，将它用于如上文对细胞系HepG2所述的实验研究。
结果
附图36表明胰岛素衍生的肽类不会刺激肝细胞内DNA合成，但是胰岛素可以做到。
结论
以本文所报导的这些肽类的活性为基础预计胰岛素衍生的肽类对DNA合成缺乏作用。这些作用与目前的胰岛素作用的知识相一致。胰岛素的这一功用不取决于胰岛素的降解，且模拟降解胰岛素的肽类不应刺激DNA合成。
实施例12-过度肥胖的2型糖尿病大鼠中胰岛素衍生的肽减少高血糖症和肌肉衰竭
对胰岛素衍生的肽评估其影响大鼠中绝对或相对胰岛素缺乏或严重胰岛素抗性和蛋白质分解代谢的疾病症状的影响能力。特别是，来自糖尿病大鼠的体内数据和体外脂肪细胞研究显示了胰岛素衍生的肽在缓解过度肥胖者2型糖尿病症状中的价值。
实验1
材料和方法
一般来说，材料和方法如上述实施例1、2、5、6、9和10中所述。所用的大鼠是Zucker脂肪糖尿病动物。其它程序和试剂是本领域中常用的。
结果
在实验过程中仅两只实验动物开始发生高血糖症。
通过测定3-甲基组氨酸排泄量的水平来监测肌肉的衰竭情况。结果如附图37中所示。在缓冲液处理的大鼠中3-甲基组氨酸水平逐渐增加，而在HLVEALY处理的动物中3-甲基组氨酸水平在前3天内得到降低。当HLVEALY作用于胰岛素缺乏大鼠时它可减少2型动物模型中的肌肉衰竭。
使用HLVEALY给药得到的图形即早期3-甲基组氨酸的降低和晚期的衰退可能是因为该肽的降解所导致。
结论
胰岛素衍生的肽可减少过度肥胖2型糖尿病动物中的肌肉衰竭和高血糖症。
实验2
材料和方法
一般来说，材料和方法如上述实施例1、2、5、6、9和10中所述。所用的大鼠是Zucker脂肪糖尿病型动物。其它程序和试剂是本领域中常用的。
脂肪细胞的制备：使用Aizet Model 2001微型渗透泵将Zucker糖尿病脂肪大鼠(ZDF／Gmitm-fa／fa)用(n=2)或不用(n=2)胰岛素衍生的肽HLVEALY以2μg／小时治疗7天。除去付睾脂肪垫并通过胶原酶消化来制备脂肪细胞。在分离和培养步骤中使用含有4％牛血清清蛋白和0．55mM葡萄糖的Krebs-Ringer／HEPES缓冲液(pH7．4)。在该步骤中，在37℃和缓慢动摇下将1g脂肪组织糜用2ml含有5mg胶原酶的缓冲液培养45分钟。然后将细胞在缓冲液中洗涤2次并通过聚酯丝绸过滤。接着将细胞等分入微量离心管而用于检测试验。
脂肪酸氧化的检测试验：通过将[9，10-3H]棕榈酸酯转化成3H2O来评估脂肪酸的氧化。在37℃下，使用和不用1mM KCN，将新鲜分离的脂肪细胞(2×106／ml)在含有2％BSA和0．1mM棕榈酸酯(1μCi／μmol)的MEM中培养5小时。将在有KCN(线粒体抑制剂)存在的情况下发生的氧化引入初始状态的过氧化物酶体。通过用5％三氯乙酸沉淀(2x)来除去培养基中过量的[9，10-3H]棕榈酸酯。将上清液转入微量离心管、放入含有0．5ml未标记的水的闪烁管、密封并在50℃下培养18小时。然后将微量离心管外部的水加入到闪烁流体中并在β-计数器上计数。通过将10μl的3H2O加入到微量离心管内的490μl水中来单独测定3H2O的平衡系数并如上所述进行培养。接着将平衡系数用于计算由细胞产生的3H2O的总量。
结果
附图38和39证明了这一研究结果。正如附图38所示，总脂肪酸的氧化作用在来自受治疗动物的细胞中得到增加。附图39表明这种大量增加是由于刺激过氧化物酶体脂肪酸的氧化。
结论
这些结果表明HLVEALY的治疗可通过脂肪细胞增加脂肪酸的氧化。因此，胰岛素衍生的肽缓解了过度肥胖2型糖尿病动物的另一种症状。这些结果与Sprague-Dawley大鼠中的研究相一致(如上文所述)，这表明治疗动物中付睾脂肪垫的重量降低。
已经参照各种不同的特定和优选实施方案和技术已经对本发明作了描述。然而，应当理解的是可以进行许多改变和修改而保留本发明的实质和范围。
本说明书中所有的本发明涉及的出版物和专利文献均体现了本领域技术人员的水平。本发明中引用全部出版物和专利申请的范围与各出版物和专利申请特定和分别地引用相同。序列表>Duckworth，William CliffordHamel，Frederick G．>用于治疗和诊断与胰岛素相关疾病的方法和组合物򘒵．13WO01>PCT／US99／00471򗶯-01-08ᡴ／070，821򗶮-01-08ɮ>PatentIn 2．0版ɭɳ>PRT>哺乳动物ɭHis Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5ɮɲ>PRT>哺乳动物ɮLeu Val Glu Ala Leu Tyr 15