转基因胡萝卜生产的霍乱疫苗及其方法 本发明涉及植物基因工程领域。具体地说是通过转基因胡萝卜生产霍乱疫苗，利用转化的胡萝卜下胚轴分化为完整植株，转基因胡萝卜生产霍乱毒素B亚单位(CTB)，制备具有生物活性和实用的霍乱口服疫苗。
随着植物基因工程技术的发展，转基因植物能够表达多种蛋白质，包括来源于动物、人类、病毒和细菌等的蛋白质。而利用植物表达口服疫苗更有利于疫苗的分装和服用；在植物的果实或疏菜中表达多肽疫苗，这只需将种子运输到各地，再繁殖出植物的可食部分即可直接应用，从而可大大简化疫苗的贮藏和分装。因此利用植物表达系统生产安全、廉价、实用的口服疫苗，更有利于口服疫苗的推广和肠道传染病的预防[6]。
目前大多使用模式植物表达多肽疫苗，如烟草、马铃薯等，这些植物表达的多肽疫苗不能直接口服，需经纯化后才能使用；而选用能够生吃地植物的组织或果实(如水果和蔬菜)生产口服疫苗，这样才能发挥植物表达系统的作用[6]。在许多可以生吃的植物中，胡萝卜具有重要的经济价值和实用价值，它的种植范围比较广，能够满足大量生产外源蛋白的需要；胡萝卜还含有丰富的维生素，在预防疾病的同时又可增加营养。因此，胡萝卜生产口服疫苗具有重要的意义。在植物生产霍乱疫苗方面，Hein等只获得了表达CTB的转基因烟草，对CTB活性未作分析[5]。Arakawa等用马铃薯表达的CTB不能生吃，而加热煮熟后CTB的活性大大降低[1，2]；这些研究都未能获得有实用价值的CTB植物生产系统。
在改进作物品质或生产异源蛋白方面，转基因方法已成为重要的手段。在已有的胡萝卜转化方法中，大多采用培养细胞作为转化的受体材料，如愈伤组织、悬浮细胞等[3，7，9]。由于这些材料不易被根癌农杆菌侵染，转化效率较低，并且悬浮细胞培养需要较严格的无菌培养条件，不利于操作。也有用胡萝卜下胚轴作为转化的受体材料[4，8]，但转化的胡萝卜下胚轴再生的愈伤组织须经过悬浮细胞培养才能再生植株，转化方法复杂并且周期长。在已报道的这些胡萝卜转化方法中，转化的胡萝卜细胞再生成植株都要通过体细胞胚胎发生过程。因此，这些胡萝卜转化方法还不够完善，制约了胡萝卜在基因操作方面的研究进展。
本发明的目的在于提供一种口服疫苗的生产方法。即利用转基因胡萝卜生产CTB，通过表达载体的构建、胡萝卜的转化、CTB的表达分析生产具有生物活性的CTB。本发明的另一目的在于提供一种简便的胡萝卜转化方法，即根癌农杆菌与胡萝卜下胚轴共培养后，转化的胡萝卜下胚轴直接分化形成再生植株。本发明克服了现有技术的缺陷，选择能够直接生吃的胡萝卜生产霍乱疫苗，即将霍乱疫苗基因表达在胡萝卜的可食部位，通过口服胡萝卜的直根，可达到预防和治疗疾病的目的。
本发明的具体实施步骤如下：
以pUC-CTB质粒为模板，根据已报导的CTB编码区5’端和3’端序列设计并合成一对引物，通过PCR扩增CTB基因。纯化PCR产物连接到pGEM-T载体并转化大肠杆菌XL1-Blue，获得含CTB基因的重组质粒pGEB。测序表明CTB基因与霍乱弧菌569B株的CTB原始序列相同。将CTB基因的5’端与烟草病程相关蛋白PR1b信号肽序列同框融合，获得pRBC重组质粒。
从重组质粒pRBC分离出含PR1b-CTB融合基因的DNA片段连接到植物组成型表达载体pBin438，连接物转化大肠杆菌XL1-Blue获得能在植物中组成型表达的重组质粒pBirc38及重组大肠杆菌XL1-Blue-pBirc38。
从上述重组大肠杆菌中提取重组质粒pBirc38，转化农杆菌LBA4404，获得重组农杆菌LBA4404-CTB。用重组农杆菌介导法转化胡萝卜下胚轴，通过选择培养，获得了抗卡那霉素植株。植株叶片总DNA的PCR分析表明得到了含CTB基因的植株。Western blot分析表明转基因胡萝卜能够表达CTB蛋白。ELISA分析证明CTB能够在转基因胡萝卜根部和叶片中有效表达。GM1结合的阻断试验表明胡萝卜中表达的CTB形成五聚体，CTB能够有效地与GM1神经节苷酯结合。结合附图对本发明作进一步详细描述：图1：携带CTB基因的植物表达载体pBirc38结构示意图。图2：B5培养途径的胡萝卜下胚轴转化。A．转化的胡萝卜下胚轴长出的分化芽。B．经生根培养形成的转基因胡萝卜植株。图3：MS培养途径的胡萝卜下胚轴转化。A．转化的胡萝卜下胚轴长出的愈伤组织极其分化芽。B．转基因胡萝卜植株。图4：转基因胡萝卜的PCR分析。1-3．转基因胡萝卜。4．未转基因胡萝卜。5．DNA lkb ladder。图5：转基因胡萝卜表达CTB的Western blot分析。1．未转基因胡萝卜。2．天然CTB样品3-4．转基因胡萝卜。图6：胡萝卜中CTB与GM1神经节苷酯的结合分析。1．未经加热的天然CTB。2．加热的天然CTB。3．未经加热的转基因胡萝卜生产的CTB。4．加热的转基因胡萝卜生产的CTB。图7：转基因胡萝卜中CTB蛋白的含量。实施例：转基因胡萝卜生产霍乱毒素B亚单位1．植物表达载体的构建
以携带CTB基因的pUC-CTB质粒为模板，用引物2(5’-AAGTACTCCTCAAAATATTAC-3’)和引物3(5’-AGTCGACTTAATTTGCCATAC-3’)进行PCR扩增，将得到的大约300bp的片段克隆到pGEM-T载体中，得到携带有CTB基因的pGEB，经序列测定证实CTB基因与原始序列相同。在pGEB载体中，CTB基因5’端经PCR引入了ScaⅠ酶切位点。在pBIPR1b载体中，含有烟草病程相关蛋白PR1b信号肽序列，为将PR1b信号肽序列与CTB基因同框融合，用MluⅠ酶切pBIPR1B质粒后，Klenow补平M1uⅠ切点，再用SalⅠ酶切该载体。用ScaⅠ和SalⅠ将pGEB中的CTB基因切出后，插入到上述处理过的pBIPR1b载体中，得到pRBC载体。经序列分析证明PR1b信号肽序列与基因连接正确。用BamHⅠ和SalⅠ将PRlb-CTB基因从pRBC载体切出后，插入到pBin438相同的酶切位点中，得到携带有PR1b信号肽序列和CTB基因同框融合的双元表达载体pBirc38(图1)。2．胡萝卜元菌苗的培养
胡萝卜种子在37℃浸泡4-5小时，然后在1％ AgNO3溶液中浸泡15分钟；用无菌水洗4-6次，每次3分钟，洗涤过程中不断搅动。将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，置于1/2MSO固体培养基上暗培养，24℃暗培养7-9天。3．胡萝卜下胚轴的转化和植株再生
将根癌农杆菌培养液用1/2MSO培养液稀释15倍，至每毫升约1×106至1×107个细菌。选取生长至4-6cm的胡萝卜无菌苗，将无菌苗下胚轴切成约1cm长的小段，然后将下胚轴置于稀释的根癌农杆菌菌液中浸泡40分钟。取出下胚轴，用无菌滤纸吸干其表面菌液，置于B5共培养培养基(B5无机盐+B5维生素+1mg/L NAA+0.5mg/L BAP+20g/L蔗糖+8g/L琼脂)或MS共培养培养基(MS无机盐+1.5mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+8g/L琼脂)上培养，使切口处与培养基充分接触，28℃暗培养2-3天。
A：将胡萝卜下胚轴在B5共培养培养基上2-3天后，转入B5抑制培养基(B5无机盐+B5维生素+1mg/L NAA+0.5mg/LBAP+20g/L蔗糖+400mg/L羧苄青霉素+8g/琼脂)暗培养2周，以加快下胚轴伤口细胞的扩增。再将下胚轴转入B5筛选培养基(B5无机盐+B5维生素+1mg/L NAA+0.5mg/LBAP+20g/L蔗糖+400mg/L羧苄青霉素+50mg/L卡那霉素+8g/L琼脂)上培养，2周继代一次。两周后，可观察到下胚轴两端有明显膨大，并长出愈伤组织小块。转化的下胚轴在筛选培养基上培养4-6周，下胚轴两端的愈伤组织开始分化长出小绿点，并逐步长成分化芽(图2-1)。当分化芽长至1cm左右时，将生长状态较好的小芽转移到B5生根培养基(B5无机盐+B5维生素0.1mg/L IBA+20g/L蔗糖+400mg/L羧苄青霉素+50mg/L卡那霉素+8g/L琼脂)上进行生根培养，分化芽在B5生根培养基上培养3-4周后，能够长出正常根，形成完整的植株(图2-2)。在这种条件下，转化的下胚轴细胞可直接分化形成分化芽，但分化芽要经过生根培养才能形成完整的植株。
B：胡萝卜下胚轴在MS共培养培养基上2-3天后，转入MS抑制培养基(MS无机盐+1.5mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+400mg/L羧苄青霉素+8g/L琼脂)上暗培养2周，可见下胚轴的两端有明显膨大。再将下胚轴转入MS筛选培养基(MS无机盐+1.5mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+400mg/L羧苄青霉素+50mg/L卡那霉素+8g/L琼脂)上培养，2周继代一次。在MS筛选培养基上培养4-6周，端部膨大的下胚轴可诱导生长出愈伤组织。将生长较快的愈伤组织分成小块转移到MS分化培养基(MS无机盐+30g/L蔗糖+400mg/L羧苄青霉素+50mg/L卡那霉素+8g/L琼脂)上培养，两周继代一次。经3-4周培养后，愈伤组织能够分化，并同时长出芽和根(图3-1)。当分化芽生长至1cm左右时，选择生长状态较好的分化芽，转移到新的MS分化培养基上进行培养。培养4-5周后，分化芽可形成4-5cm的完整植株(图3-2)。4．转基因胡萝卜的PCR检测
取胡萝卜叶片50-100mg，液氮冷冻研磨后，加入500μL提取缓冲液(2％CTAB，100mmol/L Tris pH8.0，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，14mmol/L巯基乙醇)，65℃温育1小时，每隔15分钟轻轻混匀一下。加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀；10,000rpm离心5分钟，吸出上清。再用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次；取出上清，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀1小时。13,000rpm离心15分钟，弃上清，用75％酒精洗一次。凉干，加入适量的去离子水溶解DNA。PCR方法为：取1μL(约200ng-1μg)总DNA，用PR1b SP 5’端引物和CTB基因3’端引物，按标准反应程序进行扩增。反应条件为：94℃5分钟；94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟；循环30次。72℃10分钟。取8μL PCR反应混合物，在1％琼脂糖胶上电泳。结果表明：包括PR1b-CTB融合基因5’和3’端序列在内，从转基因胡萝卜基因组DNA扩增出一个400bp的片段(图4)。5．转基因胡萝卜表达CTB的Western blot检测
取100mg新鲜叶片，液氮冷冻后，用研杆研成粉末。将粉末加入200μL提取缓冲液(200mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L NaCl，14mmol/L巯基乙醇，400mmol/L蔗糖，1mmol/L PMSF，0.05％Tween-20)中，待样品充分溶解后，于4℃、13,000rpm离心20分钟。取上清用Bradford法测定蛋白质浓度。取50μL上清加入等体积的样品缓冲液，100℃煮5分钟。离心去沉淀后，样品用于电泳分析。蛋白质电泳时采用Tris-甘5系统。电泳结束后，用Bio-Rad半干电泳转移仪将蛋白转移至甲醇预处理的PVDF膜上。恒压9伏，转移30分钟。将膜置于封闭缓冲液(20mmol/L Tris-HClpH7.5，5 00mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％ tween-20，3％BSA)中，室温轻摇1小时。将膜置于兔抗CT血清中(1∶5000，20mmol/L Tris-HClpH7.5，500mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％ Tween-20，1％BSA稀释)室温轻摇1小时；用洗涤缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH7.5，500mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％ tween-20)洗膜三次，每次10分钟。将膜置于碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG中(1∶5000，20mmol/L Tris-HCl pH7.5，500mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％ Tween-20，1％BSA稀释)室温轻摇1小时。用洗涤缓冲液洗膜三次，每次10分钟。用BCIP和NBT显色。选取PCR阳性植株进行Western blot分析，结果表明转基因植株可表达分子量与预期的CTB相当，并可与抗CT血清起特异免疫反应的蛋白5(图5)。6．胡萝卜中CTB与GM1神经节苷酯的结合分析
取50mg胡萝卜叶片，加入500μL PBST(pH7.4，0.1％ Tween-20)研碎，10,000rpm离心5分钟，取上清用于ELISA检测。用100μL含2μg神经节苷脂GM1的碳酸盐缓冲液(50mmol/L，pH9.6)包被96孔酶联板，用2％的BSA封闭后，加入不同稀释倍数的样品，4℃过夜。经PBST洗涤后，加100μL的兔抗CT血清(1∶5,000)，37℃保温1小时。PBST洗涤三次，加100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶7,500)，37℃保温2小时。TMB显色，2M H2SO4终止后，405nm测紫外吸收值。在GM1-ELISA结合分析中，将胡萝卜产CTB与天然CTB直接加样或加热变性后做ELISA，结果表明，与天然CTB蛋白一样，胡萝卜产CTB与GM1神经节苷脂有较强的亲和性，而加热变性的天然CTB和胡萝卜产CTB与GM1神经节苷脂的结合能力较弱(图6)，这表明胡萝卜产CTB具有结合GM1神经节苷脂的能力，这种结合性表明，在CTB形成GM1结合位点的氨基酸和GM1神经节苷脂的多糖分子之间，保持了特异的蛋白质-神经节苷脂的相互结合作用。7．转基因胡萝卜中CTB蛋白的含量
叶片总蛋白的提取和测定方法同5。ELISA方法同6。选取CTB表达量较高的转基因植株，分析CTB在转基因胡萝卜中的含量。分别6萝卜的叶片和根部，用PBS缓冲液提取叶片和根部总蛋白，以Bradford法测定总蛋白的含量。同时，将提取蛋白以不同的稀释度做ELISA测定，以天然CTB为标准浓度梯度作为对照。将ELISA测出的CTB绝对量与植物总蛋白量相比，即可得出CTB在总可溶蛋白中的含量。在表达载体pBirc38转基因胡萝卜的叶片和根部，CTB蛋白积累的水平都比较高，分别占总可溶蛋白的0.120％和0.103％，这表明CTB在转基因胡萝卜叶片和根部中的积累水平相近(图7)。主要参考文献1． Arakawa T,Chong DKX,Langridge WHR.Efficacy of a food plant-based oral cholera toxin
B subunit vaccine.Nature Biotech.1998,16:292-297.2． Arakawa T,Chong DKX,Merritt JL,Langridge WHR. Expression of cholera toxin B subunit
oligomers in transgenic potato plants.Transgenic Res.1997,6:403-413.3． Guivarc'h A,Caissard JC,Brown S,Marie D,et al. Localization of target cells and
improvement of Agrobacterium-mediated transformation efficiency by direct
acetosyringone pretreatment of carrot root discs.Protoplasma.1993,174:10-18.4. Hardegger M,Sturm A.Transformation and regeneration of carrot (Daucus carota L.).
Molecular Breeding.1998,4:119-127.5． Hein MB,Yeo TC,Wang F,Sturtevant A.Expression of cholera toxin subunits in plants.
Annals New York Academy of Sciences.1996,794:50-56.6． Mason HS & Arntzen C.Transgenic plants as vaccine production systems.Trends in
Biotechnology.1995,13:388-392.7． Pawlicki N,Sangwan RS,Sangwan-Norreel BS. Factors influencing the Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of carrot (Daucus carota L.). 1992,
31:129-139.8． Thomas JC,Guiltinan MJ,Bustos S,Thomas T,Nessler C.Carrot (Daucus Carota) hypocotyl
transformation using Agrobacterium tumefaciens.Plant Cell Reports.1989,8:354-357.9． Wurtele ES,Bulka K.A simple,efficient method for the agrobacterium-mediated
transformation of carrot callus cells.Plant Science.1989,61:253-262.