一种高活力木本饲料专用复合纤维素酶制备方法.pdf

本发明涉及木本饲料特别是高含量粗纤维生产饲料，具体地说是一种高活力木本饲料复合纤维素酶制备方法。以康氏木霉为产酶菌种通过双温度培养法进行固体产酶发酵，经斜面培养、摇瓶扩大培养及采用新型固体培养基产酶固体发酵阶段，制得高活力的复合纤维素酶成品。所获得的复合酶具有活力高，酶系均衡，成本低廉，原料来源广泛，本发明具有操作简便的特点，符合西部牧区的实际情况，适用于木本饲料或其他高纤维素原料的饲用开发。

1.  一种高活力木本饲料复合纤维素酶制备方法，其特征在于：采用木霉，通过双温度培养法进行固体产酶发酵，经斜面培养、摇瓶扩大培养及采用新型固体培养基产酶固体发酵阶段，制得高活力的复合纤维素酶成品；
具体操作步骤如下：
(1)斜面培养：
在装有PDA培养基的试管中接入木霉微生物，25～32℃静置培养4～9天；
(2)摇瓶扩大培养：
在装有PDY培养基的摇瓶中接入斜面孢子悬浮液，扩大培养，在25～32℃、80～150r/min条件下培养3～10天，得摇瓶孢子悬浮液；
(3)固体发酵：
取固体培养基，经高压灭菌，按以1～10％摇瓶孢子悬浮液的量接种于固体培养基，而后采用双温度培养法，同时将环境湿度控制在30～60％之间，自然通风以补充氧气，即可制得高活力的复合固体酶制剂。

2.  按照权利要求1所述高活力木本饲料复合纤维素酶制备方法，其特征在于：所述木霉微生物为康氏木霉F244。

3.  按照权利要求1所述高活力木本饲料复合纤维素酶制备方法，其特征在于：所述木霉孢子悬浮液的制备是将斜面培养基上的木霉孢子用无菌水洗下制得。

4.  按照权利要求1所述高活力木本饲料复合纤维素酶制备方法，其特征在于：按重量百分比计，所述固体培养基的配方由5～25％稻草粉，15～35％麦麸，1～15％(NH₄)₂SO₄及40～80％水分，经混合均匀制得。

5.  按照权利要求1所述高活力木本饲料复合纤维素酶制备方法，其特征在于：所述双温度培养法指温度培养分两个阶段，前一阶段：20～60小时期间内恒温在30～35℃，后一阶段：50～120小时期间内控制温度在22～27℃之间，共培养70～180小时。

6.  按照权利要求1所述高活力木本饲料复合纤维素酶制备方法，其特征在于：所述双温度培养法指温度培养分两个阶段，前一阶段：24～48小时期间内恒温在30～35℃，后一阶段：60～96小时期间内控制温度在22～27℃之间，共培养84～144小时。

一种高活力木本饲料专用复合纤维素酶制备方法
技术领域
本发明涉及木本饲料特别是高含量粗纤维生产饲料，具体地说是一种高活力木本饲料专用复合纤维素酶制备方法。
背景技术
柠条、沙棘等灌木是内蒙古自治区鄂尔多斯高原常见的绿化树种，具有耐瘠薄、耐低温、抗干旱的优点。目前，仅柠条的种植面积就达数十万公顷。随着当地禁牧政策的实施，牲畜圈养已势在必行，但饲草短缺已成为当地实现牲畜圈养地限制性因素。木本饲料一直是一种潜在的饲草资源，如柠条有“接济草”、“救命草”之称，但其粗纤维和果胶物质含量过高既影响木本饲料的营养价值又影响其适口性，因此并没有得到有效开发。
纤维素酶可以将植物体内的纤维素、半纤维素转化为糖类，同时通过将植物细胞壁分解，使细胞中的可溶性蛋白质、非蛋白氮化物、矿物质等内容物得以释放，在家畜喂养、食品加工、中草药有效成分提取中得到了广泛应用。在植物性饲料中，果胶不仅是植物细胞壁成分，也是细胞间质成分，还是豆科植物种子细胞壁的主要成分，果胶少量溶解后即在动物消化道中形成凝胶物质，从而影响牲畜对多种营养物质的吸收。果胶酶可以将果胶质分解，从而解除其对牲畜消化吸收营养物质的抑制。复合纤维素酶一般以高活力纤维素酶为主要成分，还含有半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等，因此将复合纤维素酶应用于木本饲料进行反刍动物的体内或体外的酶解发酵，可将柠条等木本植物有效地开发为一种饲草来源。
当前，我国的复合纤维素酶的工业化生产技术还不成熟，所生产的酶制剂产品的酶活较低，目前市场上国产的纤维素酶制剂商品经测定，其活力仅在7.5-23U之间(U＝mg葡萄糖/(gDM·h))，而且许多酶制剂产品还存在酶系不均衡的现象，影响其降解作用的发挥；另外，不少相关研究选择豆粕粉、酵母膏、葡萄糖、CMC-Na、淀粉等高价原料作为氮、碳源，因此酶制剂产品的成本高，超出了现阶段农牧民的购买能力，因此也限制了它在实际生产中的应用。
发明内容
为了解决上述酶制剂产品中酶活低、酶系不均衡、成本高的不足，本发明的目的在于提供一种成本低、高活力木本饲料复合纤维素酶制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：采用木霉，通过双温度培养法进行固体产酶发酵，经斜面培养、摇瓶扩大培养及采用新型固体培养基产酶固体发酵阶段，制得高活力的复合纤维素酶成品；具体操作步骤如下：
(1)斜面培养：
在装有PDA培养基的试管中接入木霉微生物，25～32℃静置培养4～9天；
(2)摇瓶扩大培养：
在装有PDY培养基的摇瓶中接入斜面孢子悬浮液，扩大培养，在25～32℃、80～150r/min条件下培养3～10天，得摇瓶孢子悬浮液；
(3)固体发酵：
取固体培养基，经高压灭菌，按以1～10％摇瓶孢子悬浮液的量接种于固体培养基，而后采用双温度培养法，同时将环境湿度控制在30～60％之间，自然通风以补充氧气，即可制得高活力的复合固体酶制剂；
所述木霉微生物为康氏木霉F244；所述木霉孢子悬浮液的制备是将斜面培养基上的木霉孢子用无菌水洗下制得；按重量百分比计，所述固体培养基的配方由5～25％稻草粉，15～35％麦麸，1～15％(NH₄)₂SO₄及40～80％水分，经混合均匀制得；所述双温度培养法指温度培养分两个阶段，前一阶段：20～60小时期间内恒温在30～35℃，后一阶段：50～120小时期间内控制温度在22～27℃之间，共培养70～180小时；所述双温度培养法指温度培养分两个阶段，前一阶段：24～48小时期间内恒温在30～35℃，后一阶段：60～96小时期间内控制温度在22～27℃之间，共培养84～144小时。
本发明具有如下优点：
1.产酶活力高，酶系均衡。利用本发明配方进行固体发酵产生的纤维素复合酶具有很高的纤维素酶和果胶酶活性(其滤纸酶活经实测可达76mg葡萄糖/(gDM·h)，果胶酶活经实测可达102mg葡萄糖/(gDM·h))，而且本发明通过调整原料配比和发酵条件，可使复合酶制剂中的各种酶保持恰当比例(其中C1/Cx，即棉花酶活/羧甲基纤维素酶活，比例达0.45；β-葡萄糖苷酶活力高达94.4mg葡萄糖/(gDM·h)，β-葡萄糖苷酶/FPA高达1.24)，这对于木本植物粗纤维的分解特别有利，同时完全适合其他饲料原料如作物秸杆、木材下脚料等用于饲料生产。另外，采用双温度培养法，前期的高温有利于菌丝体的旺盛生长，后期通过适当降低发酵温度从而控制菌丝体的生长速度，拉长了菌丝生长时间，使产酶过程延长，以促进酶的分泌。
2.成本低。本发明以木本饲料的饲用开发为目标，在复合酶发酵原料的选择上注重其来源广泛和价格低廉。如：以稻草粉为诱导物，(NH₄)₂SO₄为无机N源，麦麸为复合N源、C源，具有来源广、价格低的优点，本发明方法实现了发酵工艺条件的优化，降低了产酶成本，增加了投产后的产品竞争力。
3.强调了对牲畜的安全性。本发明生产复合酶制剂所使用的固体发酵原料对动物无毒无害，具有安全性和营养补充价值，对环境无直接或间接污染作用。由于本发明方法生产的复合纤维素酶具有很高的单项和总体酶活性，可用于木本饲料发酵生产(体外酶解)或直接拌和木本饲料进行饲喂(体内酶解)，效果良好。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
(1)斜面培养
在装有PDA培养基(马铃薯20％，葡萄糖2％，琼脂2％，余为水)的试管中接入康氏木霉F244，28℃静置培养6天；
(2)孢子悬浮液制备
将斜面培养基上的康氏木霉孢子用无菌水洗下，制成孢子悬浮液；
(3)摇瓶扩大培养
在装有100ml的PDY培养基(马铃薯20％，葡萄糖2％，酵母膏1％，余为水)500ml摇瓶中接入一个斜面的斜面孢子悬浮液，扩大培养，在28℃、130r/min条件下培养3天，得摇瓶孢子悬浮液；
(4)产酶固体发酵：
取上述固体培养基50g进行高压灭菌后，接种2ml摇瓶孢子悬浮液，而后采用双温度培养法，发酵96小时；前30小时恒温30℃，后66小时27℃，环境湿度控制在40％，自然通风以补充氧气，即可制得高活力的复合固体酶制剂。其中：固体培养基配方为：稻草粉：16.9％，麦麸：26.5％，(NH₄)₂SO₄：9.5％，水分：47.1％。
经过上述步骤制得的高活力的复合固体酶制剂，其滤纸酶、棉花酶，羧甲基纤维素酶，β-葡萄糖苷酶活力经实测分别达76.6mg葡萄糖/(gDM·h)，93.1mg葡萄糖/(gDM·h)，208.5mg葡萄糖/(gDM·h)，94.4mg葡萄糖/(gDM·h)，101.4mg葡萄糖/(gDM·h)，其中C1/Cx达0.446。
本发明所获得的复合酶具有活力高，酶系均衡，成本低廉，原料来源广泛，本发明具有操作简便的特点，符合西部牧区的实际情况，适用于木本饲料或其他高纤维素原料的饲用开发。
实施例2
与实施例1不同之处在于：
在装有PDA培养基的试管中接入康氏木霉，32℃静置培养9天；在装有PDY培养基中接入斜面孢子悬浮液，扩大培养，在25℃、80r/min条件下培养10天，得摇瓶孢子悬浮液；产酶固体发酵时取上述固体培养基50g进行高压灭菌后，接种4ml摇瓶孢子悬浮液，而后采用双温度培养法，发酵144小时；前48小时恒温35℃，后96小时22℃，环境湿度控制在60％，即可制得高活力的复合固体酶制剂。其中：固体培养基配方为：稻草粉：25％，麦麸：15％，(NH₄)₂SO₄：5％，水分：55％。初始pH值：自然，约6.4。
发酵结束后，滤纸酶活经实测为96mg葡萄糖/(gDM·24h)。