聚胸腺素－ΑSUB1/SUB、其组合物、其制备方法和应用.pdf

本发明公开了聚胸腺素－α1、其组合物、制备方法和应用，所述聚胸腺素－α1包括胸腺素－α1二聚体活性片断、胸腺素－α1三聚体活性片断；可通过基因工程和化学合成方法制备，所述聚胸腺素－α1可应用于制备治疗肝炎病毒感染性疾病、肿瘤免疫功能低下疾病的药物。本发明聚胸腺素－α1具有可大量制备、成本低、活性高、半衰期长、疗效显著的优点。

1、  一种聚胸腺素-α₁，包括胸腺素-α₁二聚体活性片断或胸腺素-α₁三聚体活性片断；所述胸腺素-α₁二聚体活性片断的结构式为：
Met-His-Lys-Cys-Asp-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn；
所述胸腺素-α₁三聚体活性片断的结构式为：
Met-His-Lys-Cys-Asp-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。

2、  一种聚胸腺素-α₁，包括胸腺素-α₁二聚体活性片断和胸腺素-α₁三聚体活性片断；所述胸腺素-α₁二聚体活性片断的结构式为：
Met-His-Lys-Cys-Asp-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn；
所述胸腺素-α₁三聚体活性片断的结构式为：
Met-His-Lys-Cys-Asp-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。

3、  一种聚胸腺素-α₁的制备方法，包括以下步骤：
根据Genebank公布的胸腺素-α1的DNA序列合成聚胸腺素-α₁基因，序列如下：
5′-ATGCACAAGAGCGACATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCAGCTCCGA
AATCACCACCAAGGACTTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTGGAAGAAGC
GGAAAAT-3′；以氨基酸片断Met-His-Lys-Cys-Asp为引物或保护基因，进行扩增合成；
将上述合成的胸腺素-α₁基因片断通过已知的基因融合方法进行拼接、融合，获得“聚胸腺素-α₁”重组表达产物；
将融合后的聚胸腺素-α₁基因与载体DNA相连接，进行体外DNA的重组；将DNA重组体导入到宿主细胞，进行DNA重组体转化：
所述融合后的基因通过重组整合到宿主细胞中；
可利用已知的蛋白表达方式进行聚胸腺素-α₁基因的表达，所述表达系统可为已知的表达系统。

4、  根据权利要求3所述的聚胸腺素-α₁的制备方法，所述连接后融合的基因形式包括：胸腺素-α₁基因—胸腺素-α₁基因、胸腺素-α₁基因—胸腺素-α₁基因—胸腺素-α₁基因；
所述载体DNA可以是质粒、噬菌体和病毒；所述连接的方式可以为粘性末端连接法、平端连接法和人工接头连接法；
所述宿主细胞可为大肠杆菌、细菌、酵母菌、或真核细胞；
所述已知的蛋白表达方式包括非融合蛋白表达方式、融合蛋白表达方式和分泌型表达方式进行；所述表达系统包括原核表达系统、酵母表达系统、真核系统。

5、  一种治疗免疫功能疾病的药物组合物，包括聚胸腺素-α₁；所述聚胸腺素-α₁选自胸腺素-α₁二聚体、胸腺素-α₁三聚体、或其生理变异体组分之一或其组合，以及进一步还包括可药用的载体。

6、  根据权利要求5所述的治疗免疫功能疾病的药物组合物，包括以下重量份组分：胸腺素-α₁二聚体1-99和可药用的载体适量；以及进一步还可包括胸腺素-α₁三聚体1-99。

7、  根据权利要求5所述的治疗免疫功能疾病的药物组合物，包括以下重量份组分：胸腺素-α₁二聚体3-20和可药用的载体、以及进一步包括胸腺素-α₁三聚体3-20。

8、  根据权利要求5所述的治疗免疫功能疾病的药物组合物，包括以下重量份组分：胸腺素-α₁二聚体15和可药用的载体、以及进一步包括胸腺素-α₁三聚体15；所述胸腺素-α₁二聚体、胸腺素-α₁三聚体还可由其生理变异体代替；

9、  根据权利要求5所述的治疗免疫功能疾病的药物组合物，所述组合物可制成冻干针剂、胶囊、片剂、膏剂、口服水剂、糖浆剂。

10、  聚胸腺素-α₁在制备治疗肝炎、肿瘤、抗病毒治疗、感冒预防与治疗、细菌感染性疾病、提高免疫功能药物方面的应用；所述聚胸腺素-α₁选自胸腺素-α₁二聚体、胸腺素-α₁三聚体、其生理变异体组分之一或其组合。

聚胸腺素-α₁、其组合物、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种免疫增强聚合物，尤其涉及一种聚胸腺素-α₁、其组合物、其制备方法和应用。
背景技术
20世纪60年代以前，人类对胸腺的功能了解甚少。1961年，在Miller等人发现了胸腺与抗体的免疫功能及淋巴细胞的发育有密切关系以后，对胸腺中的物质成分进行了大量的探讨。1966年Goldstein首先从小牛胸腺组织中提取出一种具有生物活性的物质，命名为胸腺素(Thymosin)，随之进行了临床应用。1974年美国开始把小牛胸腺素应用于临床，主要用于治疗原发性细胞免疫缺陷病和某些肿瘤等。我国生产的猪胸腺素，主要用于治疗自身免疫病症，以及重症肝炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、复发性口疮等，疗效显著。
胸腺素是一类由多种多肽组成的混合物，相对分子量在1000-15000之间，PI值在3.5-9.5之间，对于这些多肽的鉴别和比较，根据它们的PI值等电聚焦电泳分离时顺序而命名，共分三个区域：α-区包括PI值小于5.0的组分；β-区包括pI值在5.0-7.0之间的组分；γ-区指pI值大于7.0以上的组分。对分离出的多肽进行免疫活性测定，有活性的称为胸腺素，如胸腺素-α₁，无活性的称多肽，如多肽β₁。现在已研究明白，胸腺素组分5含有胸腺素-α₁、胸腺素-α₅、胸腺素-α₇、胸腺素-β₃和胸腺素-β₄等具有调节胸腺依赖性淋巴细胞分化和体内外免疫反应的活性组分，其中主要成分为胸腺素-α₁。一般研究表明，胸腺素-α₁单一组分的活性为胸腺素组分5的10-1000倍。
胸腺素-α₁组分在1977年被确定，其分子结构为含有28个氨基酸残基的小分子多肽。根据广泛而又深入的研究表明，胸腺素-α₁无论是在体内还是在体外，对机体免疫系统具有强烈刺激作用，可以促进T细胞的成熟，是T淋巴细胞的免疫增强因子；现代研究表明，胸腺素-α₁的生物学作用很广泛，如能刺激机体产生干扰素、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3及其受体的表达；增加NK细胞的杀伤活性。此外，它还与细胞周期调控、血管生长、细胞迁移、组织修复、以及精子的活力有关。因此，在临床上可以应用于与许多与免疫系统相关疾病的辅助治疗，如乙型、丙型肝炎，肿瘤，免疫缺陷、免疫低下，以及AIDS等。
虽然胸腺素-α₁有着较高的临床应用价值，但由于胸腺素-α₁是由28个氨基酸组成的小分子多肽药物，目前利用基因工程方法生产的胸腺素-α₁都是先利用大肠杆菌表达多聚体的胸腺素-α₁，然后用化学裂解方法(如利用溴化氢或羟胺)获得单体。但是这种用基因工程的常规方法很难在大肠杆菌中直接表达并大量制备单分子的胸腺素-α₁；而胸腺素-α₁采用化学合成方法制备成本较高，价格昂贵。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫增强聚合物，尤其提供一种聚胸腺素-α₁、其组合物、其制备方法和应用，克服了小分子多肽胸腺素-α₁单体用基因工程的常规方法很难在大肠杆菌中直接表达大量制备、而且化学合成成本高、价格昂贵、活性不高、半衰期不长、疗效不显著的缺点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
聚胸腺素-α₁，属于一种生物活性多肽，包括胸腺素-α₁二聚体活性片断或胸腺素-α₁三聚体活性片断；以及胸腺素-α₁二聚体活性片断和胸腺素-α₁三聚体活性片断；
所述胸腺素-α₁二聚体活性片断的结构式为：
Met-His-Lys-Cys-Asp-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lts-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn；
所述胸腺素-α₁三聚体活性片断的结构式为：
Met-His-Lys-Cys-Asp-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn；
所述聚胸腺素-α₁，其中胸腺素-α₁分子间可通过氨基酸相连接，尤其聚胸腺素单体间通过蛋氨酸以肽键相联接；所述聚胸腺素单体结构式为
Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn；并连接片断Met-His-Lys-Cys-Asp保护基因。
本发明所述聚胸腺素-α₁的制备方法，包括通过基因工程方法、化学合成方法来获得；
所述聚胸腺素-α₁基因工程的制备方法，包括以下步骤：
具体包括以下步骤：
获得聚胸腺素-α₁基因：利用DNA自动合成仪，根据Genebank公布的胸腺素-α₁的DNA序列合成聚胸腺素-α₁基因，序列如下：
5′-ATGCACAAGAGCGACATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAGGACTTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTGGAAGAAGCGGAAAAT-3′。以所述氨基酸片断Met-His-Lys-Cys-Asp为引物或保护基因，进行所述单体的扩增合成。
利用基因工程手段获得“聚胸腺素-α₁”重组表达产物：
将上述合成的胸腺素-α₁基因片断通过已知的基因操作方法进行拼接、融合，连接后融合的基因形式有：
a、胸腺素-α₁基因—胸腺素-α₁基因
b、胸腺素-α₁基因—胸腺素-α₁基因—胸腺素-α₁基因
体外DNA的重组：
将融合后的聚胸腺素-α₁基因与载体DNA相连接，载体DNA可以是质粒、噬菌体和病毒；连接方式可以为粘性末端连接法、平端连接法和人工接头连接法。
DNA重组体的转化，将DNA重组体导入到宿主细胞：
将上述融合后的基因通过重组整合到合适的大肠杆菌中表达，获得表达蛋白，宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母菌和动物细胞，尤其将胸腺素-α₁基因导入大肠杆菌DH5α，在大肠杆菌中合成聚胸腺素-α₁。具体的导入方法包括：大肠杆菌转化用氯化钙处理制备感受态细胞和用电激法导入；酵母菌用原生质体或乙酸锂法转化；动物细胞用磷酸钙、DEAE-葡萄糖、电穿孔及显微注射法导入外源DNA。
聚胸腺素-α₁基因的表达：
聚胸腺素α₁基因的表达可以利用非融合蛋白表达方式、融合蛋白表达方式和分泌型表达方式进行；表达系统可为已知的表达系统，如原核表达系统、酵母表达系统、真核系统表达等。
聚胸腺素-α₁的纯化：
聚胸腺素-α₁的分离：将表达到一定时间的工程菌株，利用已知的超声波、高浓度的尿素等多种细胞裂解方法将细胞裂解，然后进行蛋白质分级盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析、如亲和层析、超滤、高压液相层析等蛋白质纯化方法，纯化表达蛋白。
聚胸腺素-α₁纯度的鉴定：将分离得到的聚胸腺素-α₁利用已知的蛋白质纯化方法，纯化表达蛋白，如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析、超滤等。尤其用SDS-PAGE电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳、高压液相层析等方法鉴定，通过纯化方法获得纯度达96％以上的聚胸腺素-α₁。
所述聚胸腺素-α₁化学合成的制备方法，可采用已知的化学合成方法合成聚胸腺素-α₁，尤其选用自动固相合成法来合成聚胸腺素-α₁，具体步骤如下：
氨基酸氨基的保护：
将各种氨基酸的氨基用叔丁酸进行保护，得到Boc-氨基酸，即叔丁羰酰氨基酸。
C末端氨基酸地连接：
先将上述Boc-天冬氨酸与氯甲基化的树脂反应，通过苄酯键连接在树脂上，得到Boc-天冬氨酸苄酯树脂，然后用盐酸-乙酸脱去Boc-保护基，并用水和乙醇洗涤。
肽链的延长：
所述天冬氨酸苄酯树脂在DCCI缩合剂的作用下，与C-末端的第二个氨基酸Boc-谷氨酸缩合，得到Boc-谷氨酸-天冬氨酸二肽，并用水和乙醇交替洗涤，除去未反应的Boc-谷氨酸，然后用盐酸-乙酸脱去Boc-保护基，然后按照聚胸腺素-α₁的从C末端到N末端的氨基酸顺序依次连接Boc氨基酸。
聚胸腺素-α₁的回收：
当肽链合成完毕后，将连接有肽链的树脂悬浮在无水三氟乙酸中，通入干燥的溴化氢，使肽链从树脂上解离下来，同时除去保护基，得到合成的多肽。
纯度检测和鉴定同前述基因工程法。
本发明聚胸腺素-α₁，与单体胸腺素-α₁相比，可更大规模地制备，制备成本更低。
本发明还提供了一种治疗免疫功能疾病的药物，包括聚胸腺素-α₁；所述聚胸腺素-α₁选自胸腺素-α₁二聚体、胸腺素-α₁三聚体、或其生理变异体之一或其组合；
所述药物组合物，还可进一步包括可药用的载体；
所述治疗免疫功能疾病的药物组合物，包括以下重量份组分：胸腺素-α₁二聚体1-99、可药用的载体适量、还可进一步包括胸腺素-α₁三聚体1-99；优选为以下重量份组分：胸腺素-α₁二聚体3-20和可药用的载体、还可进一步包括胸腺素-α₁三聚体3-20；
最好为以下重量份组分：胸腺素-α₁二聚体15和可药用的载体、还可进一步包括胸腺素-α₁三聚体15；所述胸腺素-α₁二聚体、胸腺素-α₁三聚体还可由其生理变异体代替；
所述可药用的载体是指药学上所说的载体，尤其是根据《中国生物制品主要原辅材料质控标准》所添加的各种添加剂、赋型剂，如：甘露糖、阿拉伯胶、蔗糖等；
所述药物的生理变异体为结构变化产生的变异体，主要有三个方面，一种是单体间的连接氨基酸由蛋氨酸变为其它氨基酸；另一种是在N末端进行修饰，如乙酰化修饰；第三种变异体主要是药物N末端前六个氨基酸序列和长短的变化，即这段氨基酸序列可以由各种氨基酸组成的2-10肽所取代产生的变化。
所述药物可制成药学上可用剂型，尤其为冻干针剂、胶囊、片剂、膏剂、口服水剂、糖浆剂等；
所述药物制剂可通过以下途径给药：鼻腔、口腔、直肠、阴道、静脉、肌肉注射等。
本发明还提供了所述聚胸腺素-α₁在制备治疗肝炎、肿瘤、抗病毒治疗、感冒预防与治疗、细菌感染性疾病、提高免疫功能药物方面的应用；所述聚胸腺素-α₁选自胸腺素-α₁二聚体、胸腺素-α₁三聚体、其生理变异体之一或其组合。
发明人还发现，由两分子或三分子胸腺素-α₁聚合形成的聚胸腺素-α₁不但与胸腺素-α₁单体具有相同的生物学功能，而且活性更高、生物半衰期更长；实验药代动力学半衰期研究证明如下：
由11个20-30岁的健康志愿者参加的研究试验表明，以900μg/m²的剂量聚胸腺素-α₁单次给药，体内浓度在1.4个小时后达到浓度最大值，最大浓度为48.30μg/L，半衰期为2.5小时，肾排泄量为30％。
以同样的剂量连续给药5天，发现体内浓度在1.42小时内达到最大值，最大浓度为49.52μg/L，半衰期是2.1小时，肾排泄为60％。
与胸腺素α1单体相比较，聚胸腺素-α₁半衰期分别为2.1小时，胸腺素α1为1.7小时，半衰期明显延长。
为证明本发明聚胸腺素-α₁的治疗效果，进行了以下实验：
一、体外聚胸腺素-α₁的活性测定
(1)E-玫瑰花试验：采集新鲜猪胸腺，制备淋巴细胞悬液，45℃温浴1小时脱E-受体，洗涤细胞调整细胞浓度至10⁶个/ml，分置于小试管中，每管0.2ml，加入0.1ml稀释成不同浓度的纯化聚胸腺素-α₁溶液，37℃培养1小时，将绵羊红细胞洗涤后调整细胞浓度至10⁷个/ml，500g离心2分钟，4℃放置过液。次日计数玫瑰花结形成率。结果如下表1：
                  表1：玫瑰花环实验结果(n＝6)
聚胸腺素-α₁的浓度(mg/L)                   玫瑰花环率(％)
0                                          12.0±0.3
0.006                                      12.5±0.1
0.060                                      16.0±0.4^a
0.600                                      21.0±0.3^b
6.000                                      24.0±0.1^b
60.00                                      20.0±0.2^b
600.0                                      15.0±0.5^a
ap＜0.01                               ^bp＜0.001
结论：聚胸腺素-α₁可以明显提高E-玫瑰花的结花率。
(2)体外淋巴细胞增值试验
a、脾细胞悬液的制备：颈椎脱臼处死Bal B/C小鼠，置入75％酒精中浸泡消毒1分钟，无菌取小鼠的脾脏，100目铁丝网研磨，试管收集细胞悬液，离心1500/min，10分钟，去上清，细胞团块用3ml Tris缓冲氯化铵溶红细胞液溶解红细胞，混合作用5分钟用培养液或PBS液迅速洗去NH4Cl，调细胞浓度为2×10⁶，进行淋巴细胞增殖试验(采用³H胸腺嘧啶掺入法及MTT法进行)
b、取上述细胞铺入96孔板，每孔0.1ml，继而加入等量的对照及不同浓度的聚胸腺素进行细胞培养，相应孔中加入10ul ConA，聚胸腺素培养终浓度为100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625，0.78125，0.390625，0.1953125，0.0976ug/ml，均设3复孔。
³H胸腺嘧啶掺入法测定时，于培养56小时后，加入10ul ³H胸腺嘧啶工作液，继续培养16小时，多头细胞收集器收集细胞，液体闪烁计数仪测射线强度。结果见表2及图1。
           表2  MTT法测定聚胸腺素体外细胞增殖结果1
                组别                   OD值
                无conA对照             0.103±0.015
                conA对照               0.244±0.034
                97.6                   0.280±0.027
                195.3                  0.276±0.022
                390.6                  0.288±0.041
                781.3                  0.256±0.025
                1562.5                 0.243±0.029
                3125                   0.268±0.020
                6250                   0.253±0.032
                12500                  0.247±0.038
                25000                  0.274±0.014
                50000                  0.305±0.027^*
                100000                 0.406±0.058^***
          与ConA对照组比较，^*P＜0.05，^***P＜0.001
MTT法测定时，于培养68小时后，每孔加入5mg/ml的MTT无菌溶液20μl，继续培养4小时后，终止培养。小心吸弃培养上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10分钟，使结晶充分溶解。用酶标仪检测490nm波长下各孔吸光度值。此试验重复2次，结果见表3、表4及图2、图3。
结论：当聚胸腺素-α₁达到一定浓度后可以刺激淋巴细胞大量增值。
        表3  MTT法测定聚胸腺素体外细胞增殖结果2
            组别                   OD值
            无conA对照             0.114±0.003
            conA对照               0.315±0.049
            97.6                   0.268±0.035
            195.3                  0.273±0.030
               390.6               0.324±0.010
               781.3               0.380±0.020
               1562.5              0.431±0.028^*
               3125                0.405±0.035
               6250                0.407±0.023
               12500               0.417±0.009^*
               25000               0.470±0.018^*
               50000               0.505±0.010^**
               100000              0.499±0.035^*
          表4  ³H掺入法测定聚胸腺素体外细胞增殖结果
               组别                cpm值
               无conA对照          991±595.4
               conA对照            13176±2021.6
               97.6(ng/ml)         17326±3308.7
               195.3               11648±551.98
               390.6               13319±4018.6
               781.3               15537±4285.2
               1562.5              12845±4344.4
               3125                15229±1934.9
               6250                12881±6794.8
               12500               13495±3781.9
               25000               14813±1113.6
               50000               17115±2320.8^*
               100000              24509±1877.4^***
           与ConA对照组比较，^*P＜0.05，^***P＜0.001
(3)体外淋巴细胞激活试验—细胞因子IL-2测定
采用ELISA法进行测定，试剂盒由北京晶美生物工程有限公司购得。加样及细胞培养方法同上(2)体外淋巴细胞增值试验。72小时后收集培养上清，按试剂盒提供的操作步骤进行IL-2测定，取双复孔测定平均值进行统计分析。结果见图4、图5。
结论：聚胸腺素-α₁可以刺激IL-2的分泌，但与药的浓度无对应关系。
结果表明：体外的E-玫瑰花试验，可以观察到聚胸腺素-α₁能明显提高淋巴细胞形成E-玫瑰花的能力；体外的淋巴细胞增值试验，从人全血分离得到淋巴细胞，加入³H-TdR和聚胸腺素-α₁，可以检测到聚胸腺素-α₁能明显提高淋巴细胞的DNA合成能力；体外的淋巴细胞激活试验，从人全血分离得到淋巴细胞，加入聚胸腺素-α₁，可以检测到淋巴细胞表面白介素-2受体的表达明显增加。
二、体内实验
(1)乙型肝炎临床在体试验的治疗观察
接受聚胸腺素-α₁治疗的患者，每周两次皮下注射1.6mg，持续6个月，有37.2％患者在停药12个月后，其血清中的谷丙转氨酶、乙肝抗原及乙肝病毒DNA转阴，远高于使用安慰剂的对照组19％的转阴率。如下表5、表6、表7：
 表5 聚胸腺素-α1和安慰剂对乙型肝炎的疗效比较