抗HIV-1外膜蛋白的单链抗体及重组免疫毒素 技术领域：
本发明提供抗人I型免疫缺陷病毒(HIV-1)外膜蛋白gp120的单链抗体基因以及两种针对HIV-1感染细胞的重组免疫毒素，属于生物技术领域。
背景技术：
单克隆抗体在艾滋病的诊断及治疗中发挥重要作用，但是鼠源性单克隆抗体作为药物在实际应用中存在两个难题：一是鼠源抗体对人是异源性蛋白，反复应用人体会产生抗鼠抗体即HAMA(human anti-mouse antibody)；二是单抗分子量大，组织穿透力差。另外，由于单克隆抗体的杂交瘤细胞株在长期保存过程中会造成遗传变异，使其分泌单克隆抗体的能力下降，人—人杂交瘤又存在不能随意免疫、建株难、产量低、不稳定等困难，因此限制了单克隆抗体作为药物在临床上的应用。为了使抗体人源化及小型化，基因工种抗体应运而生，其发展过程大致经历了人—鼠嵌合抗体(human-mouse chimeric antibody)、改形抗体(reshaped antibody)、小分子抗体(如Fv、Fab、scFv)、重组噬菌体抗体库技术(recombinant bacteriophage antibody repertoire)几个阶段。
目前基因工程抗体研究的熟点是小分子抗体，尤其是单链抗体(single chainFvfragment，scFv)受到青睐。单链抗体是利用基因工程手段制备的小分子抗体，它是通过一段人工合成的连接肽Linker将天然抗体的轻重链可变区基因连接起来，具有分子量小，穿透性强，抗原性低，利于进行基因工程操作及大量表达等优点。ScFv具有以下优点：基因结构简单，构建表达方便，它由轻链可变区基因VL与重链可变区基因VH通过一个15肽接头(Gly4Ser)3的短肽连接而成。ScFv可以在大肠杆菌及真核细胞中表达，被认为是具有高亲和力的最小抗体片段；(1)只有V区，比相应鼠源单抗免疫原性小得多；(2)分子量约为27kDA，组织穿透力强，适合导向治疗；(3)没有恒定区Fc片段，因而不能与非靶细胞上的Fc受体结合，特异性增强；
单链抗体的应用范围较广，利用基因治疗的手段，将制备的抗HIV-1 gp120地ScFv于细胞内进行表达，可产生具有重要治疗意义的胞内抗体，由于HIV-1gp120蛋白在病毒的复制，侵入过程中，起着十分重要的作用。因此针对HIV-1 gp120的胞内抗体可产生对HIV-1感染较强的抵抗力，从而使病毒滴度降低。对于其产生的抗病毒效力，要依赖于其亲和活性的高低和胞内表达的位置。因此可在单链抗上加入细胞核定位信号(NLS)或内质网保留信号(KDEL)等。或在ScFv的轻重链的可变区适当位置各引入一个半胱氨酸形成的二硫键固定的FV段，构建成具有更高亲和力的DsFv抗体。另外，在单链抗体的VL末端加上相关一些毒素基因；如PE40，DT等，可构建成具有杀伤功能的重组毒素类“自杀分子”，完成对携带有HIV-1病毒蛋白标记的靶细胞的杀伤破坏，从而减少病毒在体内的潜伏。在HIV-1感染的诊断方面。可通过进一步偶联不同的标记基因，通过间接ELISA或竟争阻断ELISA法完成对HIV-1抗原或抗体的诊断。
利用抗HIV-1外膜蛋白单链抗体制备的重组免疫毒素，可用于作为艾滋病病毒感染的治疗药物，目前国内外用于HIV-1治疗的药物主要是化学药物，1987年首先开始的核苷类药物，如齐多夫定(ADV)、去羟肌苷(ddI)、扎西他淇滨(ddC)、拉杰夫定(3TC)等，但临床应用来看，核苷类药物对HIV-1的疗效不尽人意；1994年，经过4-5年的研究，非核苷类反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂开始被用于临床，主要包括奈韦拉平、沙奎那韦、Ritonavir和Indinavir，这些药物可减少病毒量，增加CD4细胞计数，但单药疗效不佳，1995年开始使用多种药物的联合治疗，即高效抗病毒疗法(Highly active anti-retroviraltherapy HAART)，目前研究发现，高效抗病毒疗法可以取得较好的治疗效果，可有效抑制病毒复制，对于HIV-1感染的治疗起到了十分重要的作用，它可以基本上的完全清除血液中的游离HIV-1病毒粒子。但尽管如此，这种方法仍不能完全治愈艾滋病，其根本原因在于，在静止的CD4+记忆T淋巴细胞中存在HIV-1的潜伏感染，因此当停止使用高效抗病毒疗法的治疗性药物时，这种潜伏感染的HIV-1可随着原本处于静止状态的CD4+记忆T淋巴细胞的激活而再次复制，造成体内HIV-1病毒数量的反弹，对于这种状况，人们提出了两种可行的辅助治疗途径，第一种途径就是利用IL2激活原本处于静止状态的HIV-1感染CD4+记忆T淋巴细胞，激活的CD4+记忆T淋巴细胞可被机体的CTL反应所识别杀伤，另外感染的HIV-1本身也可对激活的CD4+记忆T淋巴细胞造成一定的破坏，从而使这些细胞崩解散并释放出HIV-1病毒粒子，这些病毒粒子则被机体的中和抗体及HAART药物的所杀灭；另外一种治疗策略是利用重组毒素对HIV-1感染的靶细胞进行特异性杀伤破坏，这种重组毒素一方面可以直接破坏被HIV-1感染的静止CD4+记忆T淋巴细胞，另外也可以使之激活，并可加速激活的HIV-1感染T淋巴细胞的崩解。
目前重组毒素的构建原是利用有一定特异性的载体，把药物或其他可杀伤HIV-1感染靶细胞的活性物质选择性地运送到HIV-1感染的靶细胞部位，以杀伤被病毒寄生的细胞，清除病毒的潜伏，从而达到提高疗效的一种治疗途径与方法。目前研制的抗HIV-1的导向药物大多数可以利用人CD4表面抗原或抗HIV-1结构蛋白的标致性单抗作为导向载体。这些单抗所针对的靶标通常为HIV-1感染靶细胞表面的病毒相关抗原或特定的受体。用作＂弹头＂的物质主要有三类，即放射性核素、药物和毒素。目前体外实验证明，重组毒素可特异性地杀伤被HIV-1感染的靶细胞，抑制病毒复制。
发明内容：
本发明的目的在于提供抗HIV-1外膜蛋白的单链抗体基因及相关序列，提供针对HIV-1外膜蛋白，可有效识别并杀伤HIV-1感染靶细胞的两种重组免疫毒素，用于艾滋病的治疗的新型生物工程药物。
本发明方案的实现方法：将抗HIV-1的单链抗体基因，克隆入相关载体之中，用于进行艾滋病病毒感染的基因治疗；将抗HIV-1的单链抗体基因，在原核及真核系统进行表达，得到的重组单链抗体可用于作为艾滋病病毒感染的被动免疫制剂；抗HIV-1的重组免疫毒素，可直接用于作为艾滋病病毒感染者的辅助治疗药物。
以下叙述本发明的主要内容：
一种抗HIV-1外膜蛋白gp120的单链抗体，其特征在于该单链抗体的基因序列是本发明说明书附图1所指的基因序列。利用这种抗HIV-1外膜蛋白gp120的单链抗体可作为艾滋病的诊断、治疗的方法和手段。
一种抗HIV-1的重组免疫毒素，其特征在于该重组免疫毒素由抗HIV-1外膜蛋白gp120的单链抗体和绿脓杆菌外毒素A构成，其中，绿脓杆菌外毒素A的受体结合区被抗HIV-1外膜蛋白gp120的单链抗体所取代。去除受体结合区的绿脓杆菌外毒素PE40核苷酸序列见图3，该重组毒素scFv-PE的构建过程如图6所示。本发明所述的这种重组免疫毒素可作为艾滋病的治疗药物。
一种抗HIV-1的重组免疫毒素，其特征在于该重组免疫毒素由抗HIV-1外膜蛋白gp120的单链抗体和白喉毒素构成，其中，白喉毒素的受体结合区被抗HIV-1外膜蛋白gp120的单链抗体所取代。去除受体结合区的白喉毒素DT的核苷酸序列见图4，该重组毒素DT-scFv的构建过程如图5所示。本发明所述的这种重组免疫毒素可作为艾滋病的治疗药物。
实验证明，本发明具有下述优点：
1、本发明得到的抗HIV-1单链抗体基因，在表达后证明不但具有很强的抗原结合特性，而且可以有效识别不同分离株的HIV-1外膜蛋白。
2、本发明所涉及的重组免疫毒素，体外实验证明，可直接杀伤被HIV-1感染的靶细胞，而对健康细胞及组织无破坏作用。
3、本发明所涉及的重组免疫毒素，对实验动物无明显毒副作用，不产生特异性病理变化。
附图说明：
图1为本发明抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体scFv的基因序列
图2为本发明抗HIV-1重组毒素的制备原理图
图3为本发明绿脓杆菌外毒素PE40核苷酸序列
图4为本发明白喉毒素DT的核苷酸序列
图5为本发明重组毒素DT-scFv的构建过程示意图
图6为本发明重组毒素scFv-PE的构建过程示意图
图7为不同浓度重组毒素对HIV-1感染MT4淋巴细胞的细胞毒性作用
具体实施方式：
下面通过抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因分离及重组毒素的制备与鉴定叙述本发明的实施方法。1.单克隆抗体杂交瘤细胞株的培养、保存及复苏
杂交瘤细胞株的培养、保存及复苏采用常规方法，具体步骤参照沈关心、同汝麟等编著的《现代免疫学实验技术》湖北科学技术出版社，第24-25页。杂交瘤细胞株培养所用的培养基为M-1640完全培养基。2.分子生物学常规的基因操作
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、线性DNA的片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白印迹实验参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1992)相关章节进行。3.鼠源单链抗体基因的分离与序列测定
(1)杂交瘤细胞总RNA的提取
培养分泌抗HIV-1外膜蛋白gp120的单克隆抗体杂交瘤细胞株102(本室制备保存细胞株)至最佳生长状态，计算细胞总量大约为2～3×107。用细胞刮子刮取细胞，离心收集，利用利用总RNA提取试剂盒提取分离出总RNA，用500ul无RNase水溶解，20℃放置备用。
(2)杂交瘤细胞mRNA的分离
将上步提取的总RNA利用生物素多聚体-磁珠mRNA纯化试剂盒分离纯化mRNA，用100ul水重悬，-70℃冻存。
(3)cDNA第一条链的合成
将提取到的mRNA按Mouse ScFv Module Recombinant Phage Autibodysystem提供的方法，在反转录酶的作用下合成cDNA。
(4)鼠免疫球蛋白VH和VL基因的PCR扩增及其产物纯化
分别取上述合成的cDNA产物分别使用VL、VH基因引物(由pharmacia公司生产的Mouse ScFv Module Recombinant phage Antibody System提供)，以94℃ 1min，55℃2min；72℃ 2min的PCR术式，作用30个循环扩增抗体的轻、重链可变区基因片段。
(5)ScFv的组装
回收的VII和VL基因片段与Lirker-primer Mix以等摩尔浓度混合，使用RS primer Mix，并加入dNTPs，Tag DNA聚合酶5单位，进行7次循环，反应条件为(94℃ 1min，63℃ 4min)，以此反应将VII，VL基因拼接为ScFv基因。此反应可将ScFv基因两端分别加上Sfi I和Not I酶切位点。采用Wizard PCR prepsDNA Purification system回收ScFv基因产物。
(6)ScFv基因的克隆及测序
将上述纯化的加端PCR产物，在T4 DNA连接酶的作用下，与pGEM-T载体系统(Promega公司产品)进行连接，转化至受体菌DH5a中，提取并纯化含ScFv的重组质粒用ABI377全自动荧光DNA序列分析仪进行测序。4.鼠源单链抗体基因的人源化改造
利用计算机进行辅助设计，找出单链抗体的鼠源枢架区，利用人源抗体枢架区基因对其进行替换。5、单链抗体及重组免疫毒素的制备
(1)单链抗体及重组免疫毒素在大肠杆菌中的表达(除利用本发明pET28原核表达载体外，还可应用其它载体系统表达重组免疫毒素，包涵体的变性、复性及纯化方法，除本文中所陈述的方法外，还可用其它方法)
利用人工设计的一对引物，对人源化单链抗体基因进行加端PCR扩增，将得到的单链抗体基因分别代替绿脓杆菌外毒素PE及白喉毒素DT基因的受体结合区，得到重组毒素基因，将单链抗体及重组毒素基因克隆入大肠杆菌原核表达载体pET28(Novagen公司产品)中，得到重组表达质粒，重组质粒转染受体大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司产品)中，进行IPTG诱导表达，表达产物利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定单链抗体及重组免疫毒素的表达量，其中表达的单链抗体N’端融合有His-Tag的纯化标志，这种表达方式可便于对单链抗体进行活性测定。
下面结合附图5叙述本发明重组毒素DT-ScFv的制备过程。
DT重组毒素使用的引物序列：
引物A：
5’---AGA TAT ACC ATG GGC GCT GAT GAT GTT GTT GAT---3’
NcoI
引物B：
5’---A GTG CCT GAA TTC GGA TCC GGA AGC AAA TGG CGT T---3’
BamHI
引物C：
5’—CCA TTT GCT TCC GGA GGT CCT GAG CCA GGT CAA GCT GCA GGA G---3’
引物D：
5’---CCC AAG CTT CTA CTA TAT TTC CAG CTT GGT CC---3’
HindIII
重组毒素DT-ScFv的制备为将ScFv基因取代DT基因的受体结合区，其具体的构建过程为，利用PCR方法扩增DT基因，使用引物(A和B)，引物A中，在DT基因上游加入了NcoI位点和ATG序列，引物B在DT基因(389位氨基酸)下游加入了编码A、S、G三个氨基酸的核苷酸序列和BamHI位点，扩增出的DT基因使用NcoI和BamHI酶切消化后，克隆入pET28载体中，构建重组质粒pET28-DT；利用PCR方法扩增ScFv基因，使用的引物(C和D)，引物C中含有388、389位氨基酸序列以及编码A、S、G、G、P、E的核苷酸序列和ScFv的上游序列，引物D在ScFv基因下游引入了Hind III酶切位点和终止密码子；
将DT和ScFv基因经PCR扩增后，回收纯化，作为模板，经链重叠PCR扩增PCR反应(Overlap extension SOE)，扩增DT-ScFv嵌合基因，将得到的嵌合基因使用ClaI和HindIII进行酶切消化，克隆入pET28-DT的ClaI和HindIII位点，得到重组质粒pET28-DT-ScFv。
下面结合附图6叙述本发明重组毒素ScFv-PE的制备过程。
ScFv-PE重组毒素使用的引物序列：
引物I：
5’—AGA TAT ACC ATG AGG TCA AGC TGC AGG AG—3’
NcoI
引物II：5’—G GAA TTC CAT ATG TCC GGA AGC TAT TTC CAG CTT GGT CCC CCC TC—3’
NdeI
重组毒素ScFv-PE的制备为将ScFv基因取代PE基因的受体结合区，其具体的构建过程为，利用PCR方法扩增ScFv基因，使用引物(I和II)，引物I中在ScFv基因中引入了Nco I位点，引物II中在ScFv基因下游引入了编码A、S、G三个氨基酸的核苷酸序列和NdeI位点。经PCR扩增ScFv基因后，用NcoI和NdeI酶切回收，克隆入pET28-PE的NcoI和NdeI位点，得到重组质粒pET28-ScFv-PE。
(2)单链抗体及重组毒素的制备
用1/10培养基体积50mmol/L Tris—Cl(pH8.0)、2mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重悬表达菌体，加溶菌酶(10mg/ml)至终浓度100μg/ml，加1/10体积的1％Triton X-100，振荡混匀，30℃水浴15min；置冰浴中超声波处理或加DNA酶I(1mg/ml)至终浓度20μg/ml室温放置至不再粘稠；
分别利用5％TritonX100约30ml洗涤包涵体两次，再利用2％DOC(脱氧胆酸盐)按每克菌/6ml洗涤包涵体一次，用含1M Nacl的Tris-Cl(pH8.0)缓冲液洗洗涤包涵体，按每克菌/6ml脲溶解包涵体，4℃12000rpm离心20分钟后，对变性包涵体进行复性，建产以下复性体系：蛋白的初始浓度为30-50ug/ml，50mMTris-Hcl PH8.5，1M脲，lmMGSH，0.1MGSSG，2mM-MT，放于10-20℃冷室中复性20小时，用2000ml 50mM Tris-Hcl(pH8.0)缓冲液于4℃透析，每12小时换液一次，共48小时，超滤浓缩，利用离子交换树脂进行复性产物进行纯化，纯化产物-20℃冻存备用。6.单链抗体的抗原结合活性测定
利用HIV-1血清抗体标准检测膜条，采用蛋白印迹法对单链抗体进行活性测定，所用二抗为抗His-Tag单克隆抗体，具体操作如下：利用封闭液(10mmol/LTris-Cl pH7.5、150mmol/L NaCl、2％Tween20、3％BSA)浸泡HIV-1血清抗体标准检测膜条，室温封闭2小时，以封闭无关蛋白质结合位点，回收封闭液；用洗涤缓冲液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5、0.15mol/L NaCl、0.05％Tween20)漂洗膜条3次，每次5分钟；用含0.4％BSA的洗涤缓冲液1∶10稀释待检单链抗体，与HIV-1血清抗体标准检测膜条进行反应；室温反应2小时：回收抗体，用洗涤缓冲液洗涤HIV-1血清抗体标准检测膜条膜3次，每次5分钟；后与第二抗体(抗His-Tag单克隆抗体)反应，室温作用2小时，用含O.4％BSA的洗涤缓冲液l：300稀释碱性磷酸酶标记兔抗鼠抗体，与HIV-1血清抗体标准检测膜条膜进行反应，室温作用2小时；回收抗体，用洗涤缓冲液漂洗硝酸纤维素膜3次，每次分钟。取O.5gNBT溶于10ml 70％二甲基甲酰胺溶液中配制NBT液；取0.59BCIP溶于10ml 100％二甲基甲酰胺溶液中配制BCIP液。将33μl NBT液和16.5μl BCIP液依次加入碱性磷酸酶缓冲液(100mmol／LNaCl、5mmol/L MgCl2、100mmol／L Tris·Cl pH9.5)混匀，配制NBT／BCIP显色液。用碱性磷酸酶缓冲液漂洗硝酸纤维素膜后，加入显色液进行显色。显色完成后，将硝酸纤维素膜移至馏水中终止显色。实验结果证明，制备的单链抗体可以与HIV-1gpl20标准抗原发生特异性免疫反应，可在HIV-1血清抗体标准检测膜条膜的gpl20位置出现特异性显色条带。7.重组毒素的生物学活性测定
为了验证所得到的产物是安全有效的生物活性物质，本发明对目的蛋白进行了一般性药理、药效、及急性和亚急性动物毒性试验。(1)细胞杀伤作用首先制备HIV感染的靶细胞模型，(H1V-1强毒操作需在P3级实验室进行)，将传代的淋巴肿瘤细胞MT4，调整细胞密度为106/ml，接入B亚型HIV-1，感作2小时后，去除病毒，更换健康M-1640完全细胞培养基，于37℃、5％CO2下培养过夜，用于测定重组毒素对HIV-1感染细胞的杀伤破坏作用。将纯化复性后的重组毒素进行超滤除菌，进行浓度测定后分别作用于HIV-1感染细胞，通过形态学观察和细胞计数，测定重组毒素对这两种细胞的细胞毒性作用。测定结果证明，制备的重组毒素具有良好的细胞杀伤活性，可以特异性杀伤HIV-1感染的靶细胞。具体结果见图7。图7为使用不同浓度的重组毒素对HIV-1感染细胞的细胞毒性作用，当重组毒素ScFv-PE和DT-ScFv的浓度小于0.4以下时，HIV-1感染细胞的生长不受影响，而当重组毒素的浓度达到4ng/m时，HIV-1感染细胞的生长减慢并出现细胞的死亡，当重组毒素的浓度达40ng/ml时，90％以上的细胞出现死亡。(重组毒素的作用效果以重组毒素加入细胞24小时中，通过形态学观察和细胞计数进行统计)(2)抗原亲和力测定
利用间接ElISA法，具体步骤参照沈关心、同汝麟等编著的《现代免疫学实验技术》湖北科学技术出版社，第121-123页。比较抗HIV-1重组毒素与原始HIV-1gp120单克隆抗体的抗原亲和力，分别对重组毒素及抗HIV-1gp120单克隆抗体进行测定，所用的抗原为重组HIV-1gp120蛋白，测定结果证明重组毒素具有与亲本抗体相同的抗原亲和活性。(3)毒理学检查
动物静脉注射相当与人用剂量100倍的抗HIV-1重组毒素，通过动物的生长状况及病理学检查测定重组毒素对实验动物的毒副作用，结果表明，抗HIV-1重组毒素没显示出明显的毒副作用(主要脏器未出现明显的病理变化)。
研究结果证明，抗HIV-1重组毒素是一种安全、有效的新型融合蛋白，具有开发利用成为新的艾滋病治疗药物的良好前景。