发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的核苷酸序列，该核苷酸被命名为人
LYC7。
本发明的另一个目的是提供一种用上述核苷酸序列生产人溶菌酶蛋
白的方法。
本发明的再一个目的是提供一种重组载体，该载体含有人LYC7核酸
序列并可以通过转化宿主细胞，如大肠杆菌、酵母细胞，表达出溶菌酶蛋
白。
本发明的再一个目的是提供一种宿主细胞，该含有人LYC7核苷酸序
列的重组质粒并可表达具有溶菌酶活性的蛋白。
本发明还提供了这种生产方法以及用该方法生产出的溶菌酶蛋白的
应用。
在本发明的一个方面，提供了一种用LYC7核苷酸序列生产具有人溶
菌酶活性蛋白的方法，该方法包括：
(1).将分离纯化的编码具有人溶菌酶蛋白活性多肽的核苷酸序列可操
作地连于表达调控序列，形成人溶菌酶蛋白表达载体；
(2).将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，筛选出表达人溶菌酶蛋
白的重组细胞；
(3).高密度培养步骤(b)中的重组细胞；
(4).分离出具有人溶菌酶活性的蛋白，并将其制成冻干粉。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”溶菌酶蛋白(或
多肽)编码序列是指，该序列或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中
分离出来，还指该序列或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而
且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有溶菌
酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中核苷酸序列及其简并
序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框核苷酸中，有一
个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。
由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中核苷酸序列同源性低至约
92％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在
中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列，更佳地
能在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此
外，该术语还包括与SEQ ID NO.1中核苷酸序列的同源性至少92％的核苷
酸序列。
该术语还包括能编码具有与人溶菌酶相同功能的蛋白的、SEQ ID
NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为
1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插
入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30
个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
获得上述溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列，可以通过人工化学合成、从
现存的DNA库扩增、从含有该序列的细胞、组织、器官中分离纯化得到。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原
核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括
酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。
在本发明中，人LYC7的表达载体是如此获得的：首先，根据SEQ ID
NO 1所述核苷酸序列及表达蛋白所使用的载体pPIC9序列，合成如SEQ
ID NO 3所述核苷酸序列；将合成后的序列与pUCml9 T载体(上海
SHANGON生物工程公司)连接形成Lyc7-pUCml9重组质粒。分别用限
制性内切酶Xho I和EcoR I酶切Lyc7-pUCml9质粒和pPIC9质粒并分
别进行胶回收。随后用T4 DNA连接酶连接经过处理的目的片段和pPIC9
质粒。最后将连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，涂布LB-Amp平板，酶
切鉴定转化子，抽提质粒，测序验证序列的正确性。
本发明中，表达人溶菌酶的甲醇酵母菌株是按如下方法获得的：抽提
37℃培养18小时的Lyc7-pPIC9质粒，然后，用3-6ul限制性内切酶SacI
切割100-200ug抽提的Lyc7-pPIC9质粒3-6小时，完全酶切后用与酶切体
积相等的氯仿/异戊醇溶液(两者体积之比为24∶1)纯化酶切产物，之后
用100％乙醇沉淀酶切的质粒，用10-30ul去离子水溶解沉淀并通过核酸
电泳测定质粒浓度。制备酵母GS115菌株的感受态。取经限制性内切酶
SacI切割后回收并定量的Lyc7-pPIC9质粒5～20ug(溶于5-10ul去离子
水中)，加入80ul酵母GS115感受态细胞，转至电转化杯，电击转化。
转化参数为；电压1500伏，电阻200欧姆，电容25微法。电击后迅速加
入800ul的1M山梨糖醇。取电击液200-600ul涂MD(极限无水葡萄糖培
养基)板，30℃培养至克隆长出。用50ml酵母培养基BMMY培养长出的
克隆，30℃，取培养上清走SDS-PAGE电泳，筛选表达目的蛋白的克隆。
本发明中“MD培养基”按如下方法配制：称15g琼脂粉溶于800ml
水中，115℃灭菌20分钟。待溶液凉至60℃，加入下列成份：100ml 10×YNB
(酵母基本氮)，2ml 500×B(生物素)，100ml 10×D(无水葡萄糖).每20ml
倒一块板。各成份的配制如下：10×YNB：称34g YNB，100g(NH4)2SO4
用水配成1升溶液，用0.22微米的膜过滤灭菌。500×B：称20mg生物素
溶于100ml水中，用0.22微米的膜过滤灭菌。10×D：溶解200g无水葡
萄糖于1000ml水中，用0.22微的膜过滤灭菌。
本发明中“BMMY培养基”按如下方法配制：溶解10g酵母提取物，
20g peptone，于700ml水中115℃灭菌20分钟，冷至室温，加入100ml 1M
磷酸缓冲液pH6.0，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×M(甲醇)。各成
份的配制如下：1M pH6.0磷酸缓冲液：混合132ml 1M K2HPO4和868ml
1M，KH2PO4，用KOH调pH＝6，121℃灭菌20分钟。10×M：量取5ml甲
醇溶于95ml水中，用0.22微米的膜过滤灭菌。
本发明中“BMGY培养基”按如下方法配制：溶解10g酵母提取物，
20g peptone，于700ml水中115℃灭菌20分钟，冷至室温，加入100
ml 1M磷酸缓冲液pH6.0，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×GY(甘
油)。各成份的配制如下：1M pH6.0磷酸缓冲液：混合132ml 1M K2HPO4
和868ml 1MKH2PO4，用KOH调pH＝6，121℃灭菌20分钟。10×GY：
量取100ml甘油溶于900ml水中，121℃灭菌20分钟。
本发明中“酵母GS115菌株感受态的制备”包括如下过程，将酵母
GS115单克隆菌株接种于1ml YPD培养基，放于摇床上30℃，250转/
分钟培养20-30小时。取100ul培养的上述细胞转接于100ml YPD培养
基中，在摇床上30℃，250转/分钟培养12-18小时，OD600＝1.3-1.5.将
OD600＝1.3-1.5的细胞培养液平均分至两个50ml离心管，在4℃下，5000
转/分钟，离心8分钟。弃上清，加40ml4℃无菌去离子水溶解沉淀，之后
在4℃下，5000转/分钟，离心8分钟。重复上一步操作一次。弃上清，
一管加1M山梨糖醇2ml，另一管加3ml，震荡，将两管合并为一管，离心，
4℃下，5000转/分钟，离心8分钟。弃上清，加1M山梨糖醇200ul悬浮
细胞一旦得到了含有目的蛋白编码序列的人LYC7克隆，就可以进行高密
度培养。该过程包括接种、上罐、发酵、饲喂甘油、饲喂甲醇等过程。
本发明中YPD按如下方法配置(1升)：1％yeast extract(酵母提取
物)；2％peptone(蛋白胨)；2％dextrose(无水葡萄糖)。称10g yeast extract，20g
peptone，20g dextrose，溶于1000ml水中，115℃灭菌20分钟。
本发明中的“接种”包括一级接种和二级接种。“一级接种”是指将
筛选到的高表达酵母菌株接种于YPD培养基，30℃，250转/分摇床培养
36小时。本发明中的“二级接种”即将培养36小时的酵母菌转至BMGY
培养基(初始发酵体积的5～10％)，30℃，250转/分培养至OD600＝2～6，
离心，弃上清，用25～50％培养体积的水重新悬浮细胞。
本发明中的“上罐发酵”即将配制好的基本盐培养基(50％发酵罐体
积)倒入罐中，通热蒸气121℃灭菌20分钟，冷至29℃，用氨水调PH
至5-6，加入PTM 4-5ml/L基本盐培养基。倒入上述的悬浮细胞，在29
℃、400转/分、0.2-0.4氧气体积/升(起始发酵液体积)分钟条件下培养。
本发明中的“饲喂甘油”是指在上述培养24小时后，以18-20ml/小时
/升(起始发酵液体积)的速度泵入50％甘油，时间是4-6小时。搅拌速
度提高到600转/分。须注意检测发酵液中的溶解氧气浓度，当溶解氧气
浓度低于20％时，停止加入甘油。当溶解氧气浓度回升到20％以上时，恢
复甘油供给。
本发明中的“饲喂甲醇”是指停止泵入甘油后，当溶解氧气浓度升高
到40％时，开始泵入甲醇溶液，速度为2-3ml/升(起始发酵液体积)/
小时。当溶解氧气浓度下降到30％后，提高甲醇速度至5-8ml/升(起始
发酵液体积)/小时。当溶解氧气浓度下降到20％以上时，提高甲醇速度
至10ml/升(起始发酵液体积)/小时。维持此甲醇速度至发酵结束。加入
甲醇的时间为3-6天。搅拌速度提高到800-1500转/分，通气量提高到
甲醇的时间为3-6天。搅拌速度提高到800-1500转/分，通气量提高到
0.6--2氧气体积/升(起始发酵液体积)分钟。注意检测发酵液中的溶解氧
气浓度，当溶解氧气浓度低于20％时，停止加入甲醇。当溶解氧气浓度回
升到20％以上时，恢复甲醇供给。
本发明中人溶菌酶蛋白分离纯化包括以下步骤：首先，发酵结束后，
4000转/分离心发酵液，收集上清。然后将发酵上清装入透析袋中，对去
离子水透析去盐，4℃下24小时。过滤将透析过的发酵上清用0.45微米
的膜过滤，然后用NaOH溶液调pH至8.0。随后进行纯化过程。
本发明中的纯化过程包括(1)装柱：以每升发酵液10毫升
CM-Sephrose FF装柱，用0.05M Tris-HCl pH8.0平衡柱子5-8个柱床体
积；(2)上样：将发酵液以10-100毫升/分钟的流速上柱；(3)清洗：上
样结束后，用0.05M Tris-HCl pH8.0洗脱未结合的蛋白，共洗脱4个柱床
体积；(4)洗脱：用含有0.15-0.20M NaCl的0.05M Tris-HCl pH8.0溶
液洗脱；(5)透析：将洗脱液对去离子水4℃透析24小时；(6)冻干：将透
析过的洗脱液在冻干机上冻干，得到基本纯的人溶菌酶的白色干粉。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的
至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方
法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多
肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“溶菌酶蛋白多肽”指具有溶菌酶蛋白活性的SEQ
ID NO.4序列的多肽。该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO 2中的氨基酸序列
相比缺少氨基端18个氨基酸残基，即1-18位的氨基酸。这18个氨基酸是
SEQ ID NO 2所编码蛋白的分泌肽序列，在蛋白的生物合成过程中被自行
切除。该术语还包括具有与人溶菌酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变
异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地
1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，
以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10
个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相
似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端
和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语
还包括溶菌酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导
蛋白、以及利用抗溶菌酶多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供
了其他多肽，如包含溶菌酶多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多
肽外，本发明还包括了溶菌酶多肽的可溶性片段。通常，该片段具有溶菌
酶多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳
地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约
100个连续氨基酸。
发明还提供溶菌酶蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然溶菌酶多
肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上
的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变
异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱
变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具
有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存
在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽
并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生
形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工
中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过
将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而
完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨
酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或
优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括溶菌酶多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可与
SEQ ID NO 1中核苷酸序列结合，从而用于抑制细胞内溶菌酶的表达。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有溶菌酶多肽编码序列的
8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在
LYC7核苷酸分子。
本发明还包括检测LYC7核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与
样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩
增后的产物，其中PCR扩增引物对应于溶菌酶多肽的编码序列，可位于该
编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
另一方面，本发明还包括对LYC7 DNA或是其片段编码的多肽具有特
异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”
是指抗体能结合于LYC7基因产物或片段。较佳地，指那些能与LYC7基因
产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中
抗体包括那些能够结合并抑制溶菌酶蛋白的分子，也包括那些并不影响溶
菌酶蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的
LYC7基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活
性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改
造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如
具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
例如，纯化的LYC7基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物
以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达溶菌酶或其具有抗原性的片
段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗
体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature
256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，
Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies
and T Cell Hvbridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断溶
菌酶功能的抗体以及不影响溶菌酶功能的抗体。本发明的各类抗体可以利
用LYC7基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或
功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与LYC7基因产物
的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物
来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的
蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来
免疫动物而获得。
本发明的溶菌酶生产工艺还可用于生产溶菌酶家族的其他成员。
本发明的人溶菌酶蛋白属于溶菌酶家族一员。溶菌酶是分解粘多糖的
多肽类免疫抗菌分子。它具有耐热、耐酸的理化特性，可溶于水、乙醇、
油脂类溶剂，通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。对溶菌
酶杀菌能力研究表明：极微量的溶菌酶即可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、
巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、细球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自
然界常见细菌。
人溶菌酶技术可用于眼药水、隐型眼镜冲洗液、鼻腔冲洗液、除臭漱
口液、痔疮护理剂、直肠灌洗剂、胃肠道术后康复剂、肿瘤术后辅助治疗
剂、抗艾滋病辅助治疗剂、沐浴液、护肤化桩品、仿人乳、流质食品添加
剂、食品保鲜剂、各种保健食品添加剂、胃药、餐巾纸和防菌湿纸巾、牙
膏等二十多种产品的改良与升级换代。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。