分离病毒颗粒的方法.pdf

分离病毒颗粒的方法
    本发明涉及一种对病毒颗粒进行纯化和定量的新方法。更具体地，本发明涉及一种通过离子交换色谱纯化和定量腺病毒的方法。本发明还涉及一种鉴定不同血清型腺病毒的方法。

    基因治疗现今取得了显著的进步，自从1990年的第一次试验以来在人体中正进行着各种各样的临床研究。在当前使用的基因转移方法中，病毒载体是特别令人鼓舞的，其中腺病毒处于首要地位。

    基因治疗中腺病毒载体的发展必需借助于两种技术(这是现今限制病毒原种生产之所在)：第一种是在来自所用病毒构建和扩增步骤的样品中定量测定病毒颗粒的高选择性高敏感性的快速方法，这一点对病毒原种生产方法的优化特别重要；第二种是纯化病毒颗粒的易于推广至工业规模的简单、可靠、可重复的方法。

    腺病毒临床用料的生产仍是一种冗长的过程，因为有许多转染和扩增的步骤，其产率未经优化。重组腺病毒一般是通过将病毒DNA引入包衣化细胞系中，然后培养2-3天(腺病毒的动力学周期为24-36小时)后机械或化学溶胞而制得。或者按另一方法，将培养进行更长时间(8-12天)，在经包衣化细胞自溶自动释放后直接在上清中收集病毒(WO98/00524)。

    要形成病毒原种一般需要2-7个扩增周期。对病毒原种生产方法优化的重要限制在于病毒颗粒的滴定方法。实际上，生物学方法是相对敏感和精确的方法，但实施起来时间特别长(根据所用的测定方法不同需4-15天，即测定转基因活性(tdu)还是要获得噬菌斑(pfu)。已开发了更快捷的分析方法，但若不预纯化在溶胞物、粗细胞提取物或培养物上清中滴定病毒颗粒时，其精确性和灵敏度不够。这就是为什么要以大概估计的感染复数(MOI)进行连续的扩增循环。由此得出，扩增步骤可重复性差，甚至往往比优化的方法所需地时间更长和/或步骤更多。腺病毒溶液的快速、精确滴定方法可以在每一步调节感染复数，以优化腺病毒原种的总体生产方法。

    病毒颗粒的定量方法应满足几个条件。首先，它应该足够灵敏，以保证测定稀释样品或低滴度(一般＜1×109病毒颗粒/ml(pv/ml))样品中的病毒颗粒，而无需求助于预富集步骤。病毒颗粒的测定应能在溶胞物或粗样本中直接进行，而无需纯化或预处理步骤。另外，该方法应具有高选择性，以克服溶胞液或细胞粗提物中存在的众多化合物的可能干扰，这些化合物的比例可依培养条件而变化。

    文献中已报道了基于阴离子交换色谱的定量分析方法(Huygue等，人类基因治疗(Human Gene Ther.6：1403-1416，1995；P.W.Shabram等，人类基因治疗8：453-465，1997)。该方法的检测限为约1×108 pv/ml，其适用于纯化病毒样品的滴定。但在溶胞液或细胞粗提物中进行分析时该方法的灵敏降低。在这种样品中的检测限估计为2-5×109pv/ml，该方法不能在很稀的未纯化的样品中定量测定腺病毒颗粒，如在病毒转染和扩增步骤时被感染细胞的溶胞液中，其腺病毒滴度典型地为约1×108pv/ml到1×109pv/ml。另外，该方法也不能在获自某些无动物蛋白之生产培养基的样品中定量测定腺病毒颗粒。实际上，在培养结束时这种培养基中含有糖、氨基酸、维生素或酚红等类型的化合物，其中有些可能干扰腺病毒颗粒的定量测定，并导致大大高估样品的滴度。最后，Shabram等报道的色谱方法需要用广谱活性的核酸酶(Benzonase)预处理样品，以消除干扰颗粒检测和测定的核酸。

    关于腺病毒的制备性分离方法，从许多年前就开始使用色谱法纯化腺病毒颗粒[Haruna，I.，Yaosi，H.，Kono，R.和Watanabe，I.，病毒学(Virology)(1961)13，264-267；Klemperer，H.G.和Pereira，H.G.，病毒学(1959)9，536-545；Philipson，L.，病毒学(1960)10，459-465]。近年来又报道了大规模纯化重组腺病毒的方法(国际专利申请WO96/27677、WO97/08298、WO98/00524、WO98/22588)。

    专利申请WO98/00524特别公开了使用强阴离子交换树脂Source 15Q的纯化方法，其在一个色谱步骤中可以获得纯度至少与经氯化铯梯度超速离心纯化的样品相当的腺病毒制品。该纯度很高，达到了人体临床研究要求的标准(WHO生物标准化专家委员会第49号报告，WHO技术报告系列，日内瓦世界卫生组织，待出版)。

    但是，当待纯化样品的病毒滴定小(例如腺病毒产量低时，或当对从早期扩增步骤所获原种进行纯化时)，或当病毒生产培养基导致有与腺病毒共洗脱的成分时(例如无胎牛血清的培养基的情况)，以前报道的色谱技术的有限效力既不能从这种起始材料定量、也不能从此一步纯化腺病毒颗粒。

    因此，问题在于要拥有这样的对粗样品病毒颗粒的滴定方法，它要同时快速、灵敏和有高选择性。问题还在于要拥有一种可靠的可重复的纯化方法，它能够从同样的粗样品优选一步获得药物质量的病毒制品。

    现发现(这也构成本发明的主题)，某些色谱载体出人意料地对于分离病毒颗粒、特别是腺病毒颗粒具有特别优异的性质。这些性质使得能够以很高的灵敏度和选择性从粗样品滴定和/或纯化病毒颗粒，而无需预处理。这些载体的使用另外出人意料地提供了一种色谱分离和鉴别不同血清型腺病毒或在尾丝或六邻体上修饰的腺病毒的快速简便的分析方法。

    本发明涉及一种从生物介质中分离病毒颗粒的方法，其特征在于包含至少一个在含基质和离子交换基团的载体上进行的色谱步骤，所述基团通过一种柔性臂接枝在所述基质上。

    所述基质可以选自琼脂糖、葡聚糖、丙烯酰胺、二氧化硅、聚[苯乙烯-二乙烯苯]，为单一物质或混合物。优选地，基质由琼脂糖构成，更优选由约6％交联的琼脂糖构成。

    已开发了由其上接枝官能化离子交换柔性臂的交联琼脂糖小珠构成的载体，用于生物分子的工业化制备性色谱。这些载体是特别设计用于从简单净化之粗混合物(即去除其悬浮的固体成分)捕获生物分子的步骤。它们的性能已在以下方面得以优化：载体上结合溶质的容量很大，高液体线性流速下反压很小，成本低，以及对再生所用洗涤剂的化学耐性很强。

    有利地，所述柔性臂是亲水性质的，并由合成或天然聚合物构成。在合成聚合物中，可以提到由聚乙烯醇单体组成的聚合物，聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺或聚乙烯醚。作为天然来源的聚合物，特别可以提到选自淀粉、纤维素、葡聚糖和琼脂糖的天然多糖聚合物。优选所述柔性臂的聚合度为约30个单体单元，更优选该柔性臂为平均分子量为约5000Da的葡聚糖。

    优选地，该柔性臂通过接枝能与阴离子分子作用的基因而功能化。最广义地讲，该基因由胺构成，可以是叔胺或季铵。在本发明中，使用强阴离子交换剂特别有利。因此，本发明优选使用由季铵功能化的如上所述的色谱载体。

    作为特别优选用于实施本发明的载体，可提及Q SepharoseXL(Amersham Pharmacia Biotech)。在专利申请WO98/39467的实施例中提到了这种载体的使用。纯化的腺病毒通过用聚乙二醇(PEG)处理而被修饰。反应后，在Q SepharoseXL柱上通过，分离修饰的腺病毒、未修饰的腺病毒和PEG。因此这是一种化学反应的起始物和终产物间的分离。本领域技术人员不能预期该柱能够用于从含各种污染物(宿主DNA、RNA、蛋白、脂类、脂蛋白、内毒素等)的复杂生物介质(如包衣化细胞的溶胞物)成功分离腺病毒。阅读该文件后也看不出，Q SepharoseXL能够用于制备性目的，因为已知在注入大量产物时大部分载体丧失其效力。

    具有基质组成、颗粒大小分布、孔隙率、柔性臂的化学性质、接枝密度方面相似特征的其他强阴离子交换载体也可用于腺病毒颗粒的制备性和分析性分离。有利地，所述基质由6％交联的琼脂糖构成，它用柔性臂接枝，柔性臂由葡聚糖组成并用强阴离子交换基团功能化。该载体具有优选约40-200μm的粒度；与粒度相关的“约”字指所述值位于相对标示值+/-20％误差范围内。优选该误差在+/-10％之内，更优选该误差在标示值的+/-5％之内。

    特别优选地，粒度在45-165μm之间，以90μm为中心。

    同样有利的是，所述基质的分散性为95％颗粒的直径在颗粒平均直径的0.1-10倍之间，优选在颗粒平均直径的0.3-3倍之间。

    在下文实施例中使用的Q SepharoseXL非穷举性地说明了可用于本发明之载体的性能。

    Q SepharoseXL的珠粒大小分布为45-165μm，以90μm为中心。珠粒大小和分布的这些特征使该载体成为制备型的色谱交换剂。色谱理论和实践都提示，这种载体对于分离在离子交换相互作用方面具有相似色谱行为的成分效力非常有限。同样，这种载体产生分辨差的宽色谱峰，特别是因为构成载体的珠粒太大、分布太宽。这些预料的色谱特征在诸如蛋白质的一般性生物分子中得到了验证，它们以分离性差的几个宽峰形式被洗脱(见Data File Pharmacia Biotech No.18-1123-82)。相反，完全出人意外的是，腺病毒颗粒从此类载体以极精细的很对称的峰形式被洗脱。与蛋白质如白蛋白比较，以理论塔板的当量高度(HEPT)或单位柱长的理论塔板数(N/m)测定的Q SepharoseXL填充柱的效率，对腺病毒的(N/m：35000)比对诸如牛血清白蛋白之类蛋白的(N/m：600)高50-100倍。例如见图1。因此，当在优化色谱条件下实施时，这类凝胶、特别是凝胶Q SepharoseXL会对腺病毒给出分离生物分子一般推荐之载体无法匹敌的精细色谱峰。在分离生物分子的推荐载体中，可提及聚苯乙烯二乙烯苯型基质的载体(例如树脂Source 15Q和Source 30Q，或树脂Poros HQ、Poros DE2或Poros D)。还可以提及甲基丙烯酸酯乙二醇共聚物型基质的载体，例如树脂Toyopearl DEAE、QAE和Super Q，或离子交换功能团位于接枝在基质上的聚丙烯酰胺型线性聚合物链上的Fractogel TMAE、TMAE HiCap、DMAE或DEAE型树脂。

    本发明所用载体对分离腺病毒颗粒的效率导致检测这些颗粒的灵敏度很高。当在分析型色谱柱中使用这些载体时，病毒颗粒出人意料的色谱行为使得腺病毒定量的检测限定低于现有技术所述方法的检测限。该检测限至少低10倍，在粗细胞溶胞物类样品中可达到1×108pv/ml水平的检测限，对于纯化的病毒样品可达到1×107pv/ml水平的检测限。

    此类载体还保证相对于待分析样品中所存在污染物如蛋白质和核酸的很高的选择性。蛋白质呈现很宽的峰，并远在病毒峰之前被洗脱。核酸以远高于病毒洗脱所需浓度的盐水浓度从柱中洗脱。该特征与以前报道的色谱方法(Huygue等，人类基因治疗，6：1403-1416，1995)很不相同，它得以克服这类化合物对病毒峰的干扰。最后，甚至在待分析样品中含有与病毒颗粒共洗脱成分时，病毒峰很特异的形式也易于鉴别并进行其定量。

    因此，本发明中所用的载体在分析含大量蛋白质和核酸的样品中之腺病毒时，能以高精确度很容易地鉴别和定量腺病毒峰。也可以从获自各种各样病毒生产培养基、缺乏动物来源成分之介质的样品进行病毒颗粒的定量分析及纯化，所述动物来源成分例如为白蛋白，它可以来自牛、人或其他来源(图2)。同样重要的是证明本发明所述方法适用于分析未采用核酸酶预处理的含核酸的样品，并不影响该方法的灵敏度和选择性。

    因此，本发明的另一主题涉及该类载体，特别是Q SepharoseXL从生物介质中制备性分离或纯化病毒颗粒的应用。这样的方法还可以选择包含在另一载体上的预色谱步骤，例如专利申请WO98/00524的方法中所用的那些载体，尤其是树脂Source 15Q。这种预色谱步骤在一些特别的情形中可能是有利的，例如生物介质中存在太多量的污染物时。

    本发明的另一主题涉及该类载体、尤其是Q SepharoseXL在生物介质中定量分析或滴定病毒颗粒的应用。

    从中进行病毒纯化或滴定的生物介质可以是病毒包衣化生产细胞的上清液或包衣化细胞的溶胞物，或所述病毒的预纯化溶液。当从包衣化生产细胞上清液或溶胞物进行病毒颗粒的制备性分离或纯化时，进行预超滤步骤可能是有利的，优选在截断阈值300-500kDa的膜上进行切线超滤。

    本发明的纯化方法可以从稀释或/和污染物高富集的储液、在完全符合工业化要求和治疗分子生产方面法规的条件下，一步获得纯度方面高质量的病毒制品，且颗粒的收率高(约75-80％)。

    本发明的另一主题涉及一种腺病毒定量方法，其特征在于在QSepharoseXL型载体上色谱分离病毒颗粒，通过测定色谱级分的吸光度确定腺病毒的量。本发明方法使得可以更容易更精确地跟踪生产的动力学过程，即无需预处理直接对上清液的均匀样品测定，这使得病毒颗粒原种的生产工艺更具有可重复性、可得到更好的控制。

    本发明还有一个主题是Q SepharoseXL型色谱载体在鉴别不同血清型腺病毒中的应用。实际上，令人惊奇地发现，通过测定保留时间和色谱峰260nm和280nm吸光度之比，该类载体可以直接从病毒生产介质的样品简单迅速地分离和鉴别大量不同血清型的腺病毒。

    关于色谱载体在本发明中的应用，通过对色谱柱进行盐梯度的洗脱或者进行等梯度洗脱(即盐浓度恒定)可进行各种分析和制备目的的病毒颗粒分离。

    对于制备性方法，色谱载体可用于常规色谱柱中或适于高效色谱系统的柱中(例如使用载体Q SepharoseXL)，或用于所谓“流化床”或膨胀系统中(例如使用载体StreamlineQ XL)。色谱柱的大小根据起始材料中存在的病毒量确定。

    待纯化的病毒样品可以施于缓冲液中的载体上，所述缓冲液的电导率使病毒不能保留在载体上，而核酸被固定。有利地，调节电导率至45mS/cm。因而这种特别的实施方式可以通过简单地滤过载体QSepharoseXL来分离病毒和污染病毒样品的来自宿主细胞的核酸。

    本发明描述的测定和纯化以及不同血清型鉴定的方法可以适用于不同类型的病毒，尤其是腺病毒，无论是野生病毒或带有目的转基因的重组病毒。

    除了上述特征外，本发明还包括源自以下实施例的其他特征和优点，这些实施例是说明性质的而非限制性的。

    【附图说明】

    图1：纯化腺病毒和白蛋白在Q SepharoseXL上的洗脱图。

    图2：无血清培养基上所获病毒培养物上清液在Q SepharoseXL上的洗脱图。

    图3：一种纯化的腺病毒制品在Q SepharoseXL上的洗脱图(注射2×1010pv)。

    图4：一种纯化的腺病毒制品在Q SepharoseFast Flow上的洗脱图(注射2×1010pv)。

    图5：一种纯化腺病毒制品在Q SepharoseXL和Q SepharoseFastFlow上洗脱图的比较。

    图6：一种纯化腺病毒制品在Q SepharoseHP上的洗脱图。

    材料和方法

    1.腺病毒和复制缺陷重组腺病毒的生产

    腺病毒是约36千碱基长的线性双链DNA病毒。它们的基因组中特别含有每个末端的一个反向重复序列(ITR)、包衣化序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要的早期基因包含在E1、E2、E3和E4区中。其中包含于E1区中的基因尤其为病毒繁殖所必需的。主要的晚期基因包含在L1-L5区中。已对腺病毒Ad5的基因组完全测序，并可在数据库中得到(特别见Genebank M73260)。同样，对其他腺病毒基因组的部分、甚至全部(Ad2、Ad7、Ad12等)也已测序。

    为了用于基因治疗，已制备了包含各种治疗基因的衍生自腺病毒的不同载体。每种这些构建体中，腺病毒均被修饰得不能在感染细胞中复制。因此，现有技术中描述的构建体是缺失病毒复制必需的E1区的腺病毒，在缺失处插入了外源DNA序列(Levrero等，基因(Gene)101(1991)195；Gosh-Choudhury等，基因，50(1986)161)。另外，为了改善载体的性质，已提出在腺病毒基因组中制造另外的缺失或修饰。例如，在ts125突变体中引入了热敏感性点突变，使得72kDa的DNA结合蛋白(DBP)失活(Van der Vliet等，1975)。另一些载体含有另一腺病毒复制和/或繁殖必需区(E4区)中的缺失。E4区实际上参与晚期基因表达的调控、晚期核RNA的稳定性、宿主细胞蛋白表达的消除和病毒DNA复制的效率。E1和E4区缺失的腺病毒载体因此具有很低的病毒基因转录和表达基底噪音。这种载体已在例如专利申请WO94/28152、WO95/02697、WO96/22378中报道。另外，带有IVa2基因修饰的载体也已有报道(WO96/10088)。

    文献中报道的重组腺病毒是从各种血清型腺病毒产生的。实际上存在腺病毒的不同血清型，其结构和特性稍有差别，但具有相似的基因组织结构。更具体地讲，这些重组腺病毒可以是人源的或动物来源的。关于人源腺病毒，可优选提及归于C组的那些，尤其是2型(Ad2)，5型(Ad5)腺病毒；B组的7型腺病毒(Ad7)；或A组的12型腺病毒(Ad12)。在动物来源的不同腺病毒中，可优选提及狗来源的腺病毒，尤其是腺病毒CAV2的所有株[例如manhattan株或A26/61株(ATCC VR-800)]。尤其在专利申请WO94/26914(引入本文作为参考)中描述了动物来源的其他腺病毒。

    在本发明的一个优选实施方案中，重组腺病毒是C组人腺病毒，更优选，是腺病毒Ad2或Ad5。

    已报道过多种生产重组腺病毒的方法(C.Chartier等，病毒学杂志(J.Virol.)70：4805-4810，1996；WO96/25506；J.Crouzet等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，94：1414-1419，1997；J-C.He等，美国科学院院刊，95：2509-2514，1998)。这些方法可以在大肠杆菌中构建带有目的腺病毒基因组的质粒，这些质粒随后用限制酶消化以切出质粒的腺病毒基因组。然后腺病毒基因组转染在包衣化细胞系中，然后扩增。

    重组腺病毒一般通过将病毒DNA引入包衣化细胞系中，随后约2-3天后(腺病毒的动力学周期为24-36小时)溶解细胞来生产，在另一方案中，培养持续到8-12天，通过包衣细胞的自溶病毒颗粒自动释放到培养基中。

    以下实施例中所用病毒是含有大肠杆菌lacZ标志基因的腺病毒(AV10CMV.lacZ)。这些腺病毒衍生自Ad5血清型并具有如下结构：

    -包括例如386(HinfI位点)至3446位核苷酸(Sau 3a位点)的E1区中的缺失。

    -插入在所述缺失处的CMV启动子控制下的lacZ基因的表达盒。

    -E3区的缺失。

    文献中已报道了这些病毒的构建(WO94/25073，WO95/14102，WO96/25506，J.Crouzet等，美国科学院院刊94：1414-1419，1997)。应理解，任何其他构建体均可用于本发明的方法，尤其是带有其他外源基因和/或其他缺失(例如E1/E4或E1/E2)的病毒。

    以前已报道过细胞转染、腺病毒扩增和滴定的技术(F.L.Graham等，分子生物学(Molecular Biotechnology)3：207-220，1995；Crouzet等，美国科学院报刊，94：1414-1419，1997；WO96/25506)。

    按P.Yeh等(病毒学杂志，70：559-565，1996)所述实施病毒AV1.0CMV.lacZ所含lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶活性tdu的测定技术。

    -腺病毒AV1.0 CMV.lacZ的生产

    从生产细胞系培养物收集病毒是按以下方法进行的：涉及一系列冻-融循环的常规方法，或在1％Tween-20存在下化学裂解，或按WO98/00524中所述持续培养到自溶。

    培养基可依据所用反式补充细胞系或所用的量而变化。这些培养基可以是MEM，DMEM等，其中加或不加胎牛血清并含有不同浓度的无机盐、糖、氨基酸、维生素、HEPES或酚红。

    反式补充E1区的细胞如293细胞或PER.C6细胞以培养皿中60-80％的汇合度用从带目的腺病毒基因组之质粒消化获得的病毒DNA转染。培养持续8-15天，通过显微镜观察细胞变圆、折射变强而与培养支持物的粘附越来越弱来判断收获时机。然后通过3-6个连续的解冻循环(-70℃乙醇干冰，37℃水溶)从核中释放病毒。如此获得的病毒再以给定的10-500病毒颗粒/细胞之间的感染复数(MOI)感染反式补充细胞，持续培养40-72小时后如前所述获得扩增的病毒。

    根据专利申请WO98/00524中所述另一方案，不在感染后40-72小时收集细胞，而延长培养至8-12天，以获得细胞的完全溶解，而无需进行冻融循环。病毒自动释放到上清液中。通过孔隙度递减的滤膜(10μm/1.0μm/0.8-0.2μm)过滤净化上清液。然后净化的上清液通过截断阈为300kDa的螺旋形膜切线超滤而被浓缩。浓缩倍数为约20-100倍。根据另一方案，净化的上清液直接用于通过Q SepharoseXL柱色谱纯化腺病毒颗粒。

    -腺病毒制品的分析

    以前已报道了(WO98/00524)用于测定所获病毒制品质量的各种分析技术(SDS-PAGE，Western印迹分析，Resource 15Q柱上的IE-HPLC等)。

    2.利用色谱载体Q SepharoseXL的分析方法

    从感染的包衣细胞培养物检测、鉴别及定量腺病毒颗粒的操作条件按如下实施。

    在一个HR5/5型柱(Amersham-Pharmacia Biotech)中装填约1ml QSepharoseXL(45-165μm；Amersham-Pharmacia Biotech)制备色谱柱。将该柱装在Waters 626型HPLC系统上，该系统装有在200-300nm吸光度范围操作的996二极管阵列紫外/可见检测系统。该阴离子交换柱用于分离和定量测定病毒颗粒。

    在每次分析前，将柱子在20mM Tris/HCl，pH7.5中以1.5ml/分钟的流速于30℃平衡。将含有病毒颗粒的待分析样品注射到该柱上。为了获得最大分辨率，注射颗粒的量应小于或等于2×1012颗粒/ml载体。注射的体积对各成分的分离没有敏感的影响，至少小于或等于50ml/ml凝胶的体积是如此。注射后，用5倍体积的相同缓冲液洗柱子，用20mM Tris/HCl，pH7.5缓冲液中的0-1M NaCl线性梯度在30倍柱体积内洗脱结合在柱子上的成分。在梯度结束时，用2倍柱体积的0.5N氢氧化钠洗柱子，然后再平衡用于以下的分析。

    用经CsCl梯度或经色谱纯化的腺病毒颗粒制品建立了260nm处的标准曲线。按1×1010颗粒/260nm吸光度单位的转换倍数，通过其在0.1％SDS溶液中的260nm吸光度预先滴定了该标准制品的病毒颗粒。

    在这些条件下，腺病毒在约18分钟的保留时间处被洗脱，并具有1.30±0.02的260nm与280nm吸光度之比(见图3)。Millennium Waters色谱信号获取和处理工作站的“suitability”软件在每次分析后自动确定峰的N/m值(以半高度计算)和不对称性(以10％高度计算)。腺病毒峰的N/m值典型为35000±3000，峰的不对称因子为1.05±0.05。

    3.用阳离子交换色谱纯化腺病毒的制备性方法

    从293或PER.C6包衣细胞(WO97/00326)的培养物纯化腺病毒。如前所述产生病毒并在自溶后在上清液中回收。然后，在临纯化前通过0.45μm的膜(HT Tuffryn或聚砜)过滤。若无相反说明，纯化步骤与上文所述病毒颗粒分析型分离使用的步骤相同，但使用不同的洗脱梯度。用0.25-1M NaCl梯度在30倍柱体积内洗脱。以每ml色谱载体1×1012颗粒的容量计，按待纯化的病毒的量调节柱的体积。同样，洗脱剂的线性流速设定在300cm/h。

    实施例

    实施例1：Q SepharoseXL型载体与载体Q SepharoseFast Flow的比较

    本实施例说明Q SepharoseXL型载体相对于载体Q SepharoseFast Flow的特异性特性。

    这两种载体由相同基质结构(6％交联的琼脂糖)和相同粒度分布(45-165μm)的小珠组成。它们的区别在于，Q SepharoseXL有带有Q型离子交换基团的葡聚糖柔性臂，而Q SepharoseFF中同样的Q型基团直接固定在琼脂糖基质上。

    将一纯化的腺病毒制品(2×1010pv)注射在一个Q SepharoseXL柱(1ml载体)上，并用如材料和方法第2段中所述NaCl梯度洗脱。洗脱曲线示于图3中。在同样的条件下，在载体Q SepharoseFast Flow(FF)装填的相似柱子上进行相同的分析。洗脱曲线示于图4中。色谱性能的比较示于下表中。

    表1：载体Q SepharoseXL和Q SepharoseFF色谱性能的比较载体    效率(N/m)    不对称性Q SepharoseXL    30000    1.0Q SepharoseFF    5000    1.0

    如图3和4中所示，在两种情况下病毒的保留时间相似(对于QSepharoseXL t＝18分钟，对于Q SepharoseFF，t＝20分钟)，但载体Q SepharoseXL的效率大大高于载体Q SepharoseFF。

    同样，在这两种载体上对含2×109病毒颗粒的细胞粗提物的分析(图5)表明，只有载体Q SepharoseXL给出了确定的可定量的病毒峰。而样品中存在的蛋白质在所研究的两种载体上以相同的效率分离(图5)。

    这些结果表明，存在携离子交换基团的柔性臂是该类载体的必需要素。这些柔性臂的存在对Q SepharoseXL分离腺病毒的有利色谱性能有重要贡献。

    实施例2：Q SepharoseXL型载体与载体Q SepharoseHP的比较

    本实施例证明Q SepharoseXL型载体相对于Q SepharoseHP的特异性特征。

    这两种载体由相同基质结构的小珠组成(6％交联的琼脂糖)。载体QSepharoseXL具有以90μm为中心的从45到165μm的珠粒大小分布。载体Q SepharoseHP的粒度为34±10μm。载体Q SepharoseHP的粒度比载体Q SepharoseXL的更细且分散性小得多。因此载体QSepharoseHP应具有比Q SepharoseXL好得多的色谱性能。

    将一纯化的腺病毒制品(2×1010pv)注射到一个Q SepharoseXL柱上(1ml载体)，并用材料和方法部分第2段中所述NaCl梯度洗脱。洗脱曲线示于图3中。在相同条件下，在载体Q SepharoseHP填充的相似柱子上进行相同的分析。用载体Q SepharoseHP获得的洗脱曲线示于图6中。

    图6中所示结果表明，载体Q SepharoseHP的效率(N/m，15000)明显低于载体Q SepharoseXL。另外，载体Q SepharoseHP上的病毒峰有一个明显的拖后(不对称性，1.6)，而载体Q SepharoseXL上该峰是严格对称的。

    出人意料地，尽管其粒度更细、其粒度分布更少分散，载体QSepharoseHP不能达到载体Q SepharoseXL分离病毒颗粒的性能。而它对于分离蛋白质的性能要好得多，如供应商(Amersham-PharmaciaBiotech)所示，这也在我们的牛白蛋白分离试验的试验条件下得到了证实(下表)。

    表2.载体Q SepharoseXL和Q SepharoseHP的色谱性能比较载体    腺病毒 白蛋白 效率(N/m) 不对称性 效率(N/m)Q SepharoseXL    30000    1.0    600Q SepharoseHP    15000    1.6    4000

    这些结果证实，携强阴离子交换基团之柔性臂的存在是该类载体分离病毒颗粒之色谱性能的必需要素。这些结果还表明在载体选择条件中要考虑的另一重要参数是粒度，尤其是大小分散度。

    实施例3：Q SepharoseXL型载体与载体FractogelTMAE(S)和Source 15Q的比较。

    本实施例证明Q SepharoseXL型载体相对于载体FractogelTMAE(S)和载体Source 15Q的特异性特性。

    这三种载体由不同结构和组成的小珠组成。Q SepharoseXL由6％交联的琼脂糖构成。载体FractogelTMAE是一种交联的聚甲基丙烯酸酯树脂，载体Source 15Q由聚苯乙烯-二乙烯苯型树脂小珠构成。载体FractogelTMAE(S)(20-40μm)和Source 15Q(15μm)的粒度远小于载体Q SepharoseXL的(45-165μm)，且更少分散。另外，三种载体都带有强离子交换基团。这些基团位于FractogelTMAE(S)和QSepharoseXL的基质上固定的柔性臂上，而Source 15Q中的交换基团直接接枝在基质上。

    将一种纯化的腺病毒制品(2×1010pv)注射到一个Q SepharoseXL柱(1ml载体)上，并用材料和方法部分第2段中所述NaCl梯度洗脱。洗脱曲线示于图3中。在相同条件下，在一载体Source 15Q装填的相似柱上进行相同的分析，在载体FractogelTMAE(S)装填的柱上进行另一分析。

    出人意料地，尽管粒度要细得多，但载体FractogelTMAE(S)达不到载体Q SepharoseXL分离腺病毒的性能。而它对分离蛋白质的性能要好得多。同样，虽然其粒度很细且粒度分布近于单一分布，载体Source15Q也不能达到载体Q SepharoseXL分离腺病毒的性能。

    表3：载体Source 15Q、Q SepharoseXL和FractogelTMAE(S)色谱性能的比较载体    效率(N/m)    不对称性Source 15Q    20000    1.2Q SepharoseXL    30000    1.0FractogelTMAE(S)    20000    1.5

    这些结果显示，携交换基团之柔性臂的存在不是负责载体QSepharoseXL分离腺病毒之特异色谱性能的唯一因素。这些臂的化学组成、其接枝密度、接枝柔性臂之基质的性能和孔隙率也是可能影响载体分离病毒颗粒之色谱性能的参数。

    实施例4：不同血清型野生腺病毒颗粒的检测和定量

    本实施例说明基于使用Q SepharoseXL型色谱载体的不同血清型野生腺病毒颗粒的检测和鉴别方法。

    通过感染培养于DMEM培养基的A549细胞生产不同野生型腺病毒，并在将细胞冻融3个循环后收集。然后在分析前通过一Acrodisc膜(HTTuffryn型0.45μm；GelmanSciences)过滤病毒制品。

    然后按材料和方法部分第2段中所述步骤色谱分析这些不同制品。但在本实施例中，用体积稍大于1ml的柱(约1.35ml)进行分析，这解释了为什么腺病毒5的保留时间(25.3分钟)长于材料和方法部分所述参考保留时间(18分钟)。

    表4：不同野生型腺病毒的色谱特征  腺病毒 (血清型) 亚组滴度(pv/ml)    比值 (260/280) Tr(分钟)    18    2.3×109    1.18    15.0    3    B    4.8×1010    1.35    20.1    7    4.4×1010    1.33    18.3    11    3.8×1010    1.30    22.7    14    1.1×1010    1.31    27.0    21    2.7×1010    1.36    22.8    34    4.7×1010    1.30    21.5    1    C    1.2×1010    1.32    26.9    2    2.3×1010    1.33    26.9    5    6.6×1010    1.33    25.3    6    6.6×1010    1.38    22.3    13    D    4.6×1010    1.55    17.0    20    8.5×1010    1.32    22.1    4    E    3.9×1010    1.31    20.1    36    2.9×1010    1.37    22.4

    本实施例表明，不同的腺病毒不但具有依血清型而变化的保留时间，而且具有血清型各自特有的260nm/280nm吸光度比值。这两个标准(其可在同一个色谱分析中同时测定)的组合构成了快速可靠地鉴别色谱制品中腺病毒血清型的方法。

    研究了病毒在柱上的保留时间和7、3、4、5和2型腺病毒尾丝和六邻体特征之间的相关性，所述腺病毒的序列已发布(1998，病毒学杂志(1998)72 p.7909和Arch.Virol(1997)142，p.1307)。从尾丝头的序列一致性数据没有发现任何相关性，甚至从尾丝柄中β片层重复的数目差中也没有发现相关性(见下表)。但令人惊异地，发现了病毒保留时间和六邻体序列一致性之间的相关性(见下表)。这种相关性与六邻体在pH7下的总电荷完全一致；这种相关性表明六邻体在pH7下电荷的提高相应于病毒在柱上的保留增加。根据六邻体暴露的L1部分pH7下的电荷不同可能存在细微的差别，如用3型腺病毒所获数据所显示的。

    表5：病毒的保留时间与六邻体序列一致性之间的相关性尾丝    六邻体 腺病毒 血清型 亚组    Tr  (min)  ％头一   致性  pH7下  电荷 柄部重复   数目  六邻体  一致性       六邻体    PI      pH7下电荷   六邻体L1   pH7下电荷    7    B  18.3    100    6    100    5.31    -16.83    -12.03    3    B  20.1    52  -2.91    6    93.9    5.23    -18.66    -10.03    4    E  20.1    32    12    73.9    5.30    -17.55    -12.06    5    C  25.3    27  -3.61    22    67.8    5.15    -22.57    -20.94    2    C  26.9    33  -2.80    22    67.3    4.96    -26.73    -20.02

    实施例5：在病毒原种生产步骤中重组腺病毒颗粒的检测和定量

    本实施例说明Q SepharoseXL型载体在检测和定量用不同包衣细胞系(293或PER.C6细胞)转染和扩增步骤中产生的重组腺病毒颗粒AV1.0CMV.lacZ的应用。

    该极快速的分析方法从培养上清开始在几分钟内提供每步所得腺病毒溶液的滴度。该快速灵敏的方法可用于优化下步的扩增条件，该步骤从而可以在确定和有控制的MOI条件下进行。

    试验了该方法对293或PER.C6细胞转染和扩增步骤中AV1.0 CMV.lacZ重组腺病毒生产的控制。

    用PacI消化的质粒pXL2822(Crouzet等，美国科学院院刊，94：1414-1419，1997)转染293细胞后产生腺病毒AV1.0 CMV.lacZ，然后以确定的感染复数(MOI)分别感染293或PER.C6细胞。起始的转染用质粒消化获得的5-10微克病毒DNA进行。

    对于细胞溶解，通过细胞的3个冻融循环回收病毒。然后在分析前通过0.45μm的Acrodisc膜(HT Tuffryn型)过滤该病毒制品。

    然后按材料和方法部分第2段中所述步骤色谱分析各种病毒制品。参照在材料和方法部分第2段所述条件下建立的标准曲线确定腺病毒溶液的滴度。

    结果示于下表中。

    表6：在两种反式补充细胞系(293或PER.C6)中生产病毒原种过程中所得重组腺病毒颗粒AV1.0 CMV.lacZ的检测和定量    细胞    病毒    步骤    滴度(pv/ml)    总量(pv)    293    AV1.0CMV.lacZ    转染    3.8×108    7.6×109    扩增I    MOI 50    3.5×1010    1.0×1012    扩增II    MOI 30    4.2×1010    3.1×1013    PER.C6    AV1.0CMV.lacZ    转染    2.4×108    9.6×109    扩增I    MOI 30    2.1×1010    6.3×1011    扩增II    MOI 60    3.2×1010    1.9×1013

    通过测定感染性颗粒的浓度(pfu)和具有转基因活性的颗粒(tdu)确定所获总病毒颗粒。术语pfu(“空斑形成单位”)相应于腺病毒溶液的感染能力，通过感染适当的细胞培养物来测定，一般在15天后测定感染细胞的空斑数。这些定量方法依赖于生物方法，所得数值可能依所用的条件而显示差异(病毒学杂志，(1996)70，p.7498)。实际上，在一种反式补充细胞系中空斑的形成并不一定反映在其他靶细胞中的病毒感染性(生物技术(Biotechniques)p.447)。所得结果示于下表中，所获数值与文献数据完全一致(P.Yeh等，病毒学杂志(1996)，70.p.559)。实际上，P.Yeh等报道的是经氯化铯梯度纯化的病毒AdRSVβGal，其tdu/pfu之比为0.49-0.68，这与以下结果很接近。

    表7：感染性颗粒浓度(pfu)和具有转基因活性之颗粒(tdu)之间的关系    细胞    病毒 滴度 (pv/ml)滴度(pfu/ml) pv/pfu 滴度 (tdu/ml) pv/tdu  tdu/pfu    293    AV1.0CMV.lacZ 4.2×10101.7×109    24 7.6×108    55    0.45    PER.C6    AV1.0CMV.lacZ 3.2×10101.3×109    26 7.4×108    43    0.57

    实施例6：在IGRP2细胞中转染和扩增步骤中所获重组腺病毒颗粒的检测和定量

    本实施例说明Q SepharoseXL型载体在检测和定量在IGRP2细胞中转染和扩增步骤中所获重组腺病毒颗粒AV3.0CMV.lacZ中的应用。

    在用PacI消化的质粒pXL3005转染包衣细胞IGRP2后产生腺病毒AV3.0CMV.lacZ(质粒pXL3005通过用CMV启动替换RSV启动子衍生自Crouzet等，美国科学院院刊，34：1414-1419，1997中所述质粒pXL2811)，然后以确定的感染复数感染IGRP2细胞(WO96/22378)。对于细胞溶解，通过细胞的3个冻融循环收获病毒。然后在分析前通过0.45μm的Acrodisc膜(HT Tuffryn型)过滤这些病毒制品。

    然后按材料和方法中所述色谱分析各种病毒制品。结果示于下表中。

    表8：病毒原种生产中所获重组腺病毒颗粒AV3.0CMV.lacZ的检测和定量    病毒    步骤    滴度(pv/ml)    总量    (pv) AV3.0CMV.lacZ    转染    0.1×1010    2.0×1010    扩增I，MOI 100    1.54×1010    1.4×1012    扩增II，MOI 50    1.39×1010    1.0×1013

    通过具有转基因活性颗粒的浓度(3.2×108tdu/ml)确定所获病毒颗粒总数。pv/tdu之比43与实施例5中所得pv/tdu比值43和55相当，从而得以将病毒颗粒的物理测定值1.39×1010pv/ml与转导单位的生物测定值3.2×108tdu/ml相关联。

    实施例7：通过树脂Q SepharoseXL上的色谱纯化病毒

    起始材料为生产病毒的包衣细胞冻融后获得的培养物溶胞液或细胞自溶后获得的上清液。

    在本实施例报道的试验中，在5.8ml Q SepharoseXL柱上注射153ml含4.9×1012颗粒的AV1.0 CMV.lacZ病毒感染的PER.C6细胞培养物自溶液。如材料和方法部分第2段对病毒分析性分离所述，进行柱平衡和用0.25-1M NaCl梯度以300cm/h的流速在30柱体积内洗脱病毒。收集病毒峰(7.1ml)，然后用如上文所述的各种技术分析(EI-HPLC，SDS-PAGE)。对所收集的级分在Resource Q(1ml)柱上以下述色谱系统进行高效液相色谱分析：将10ml如上所述色谱纯化的级分注射到在含0.5mM MgCl2之缓冲液Tris/HCl 100mM pH8.0(缓冲液B)中平衡的Resource Q15柱(1ml凝胶，Pharmacia)上。用5ml缓冲液B洗涤后，吸附的成分用30ml NaCl(0-1M)在缓冲液B中的线性梯度以1ml/分的流速洗脱。在260hm处测检被洗脱的成分。在Q SepharoseXL柱上纯化步骤后，所收集的级分有≥99％的病毒颗粒纯度(260nm处紫外检测)。病毒颗粒的纯化收率为82％。

    该HPLC分析还显示，起始溶胞液中残存的牛血白蛋白在制备性色谱过程中被完全消除。

    色谱纯化的腺病毒级分的电泳分析在聚丙烯酰胺凝胶(4-20％)上在变性条件(SDS)下进行。然后用硝酸银显示蛋白条带。该分析显示色谱获得的腺病毒制品具有至少等同于超速离心常规获得制品的纯度，它不显示额外的蛋白条带，这种蛋白带表明制品中有非腺病毒的蛋白污染。

    色谱所得腺病毒制品具有1.30±0.05的A260nm/A280nm吸光度之比。该值与超速离心所获最好制品的值相同，显示该制品没有污染的蛋白和污染的核酸。

    病毒滴定显示确实存在感染性病毒颗粒，pv/pfu比很满意(见下表)，纯化的病毒颗粒具有所期望的有效感染活性。

    表9：在Q SepharoseXL载体上纯化腺病毒AV1.0CMV.lacZ步骤滴度(pv/ml) 滴度 (pfu/ml) pv/pfu  病毒颗粒 累积收率(％)纯化前3.2×1010 0.13×1010    25    -色谱级分56×1010 1.6×1010    34    81终产品93×1010 3.7×1010    25    74

    因此，本实施例中描述的方法可以直接从包衣细胞溶胞液而无需待纯化材料的预处理(如超滤或核酸酶处理)纯化腺病毒颗粒，而不影响其感染能力。