新型测定方法 【技术领域】
本发明涉及一种测定方法，该方法由利用酶反应的测定反应体系测定生物样品中待测物质时，避免了因样品中所含溶血成分引起的测定误差。背景技术
临床检验领域中，经常采用将吸光度变化作为辅酶(NAD、NADP、NADH、NADPH、Thio-NAD Thio-NADP、Thio-NADH、Thio-NADPH)变化量的指标，对目的成分进行定量的方法。一般应用血清作为检测样品，但获得血清的取血过程中有时会图施加物理冲击或因人为操作失误而使血细胞破裂，进而产生溶血。另外，由患有溶血性疾病的患者采血时，有时会看到因这种疾病而造成的溶血。再者，最近有为了缩短检测时间而以全血作为检测对象进行测定的尝试，有时这样的检测样品中也有溶血。
血细胞破裂形成溶血状态时，肌激酶(腺苷酸激酶(以下略作MK))、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(以下略作G6PDH)等红细胞成分中的酶可混入到血清中。由于这些酶对临床检验项目的测定值会产生影响，所以有必要寻求针对各种酶的策略。例如以下两个报道，测定葡萄糖成分时为了避免因溶血造成的测定误差，应用由NaF、MgCl2、NaH2PO4和抗凝剂的混合物构成的临床检验用糖降解防止剂(特开平5-126834公报)；另外针对MK活性地AP5A。
但是，利用酶反应的临床检验测定中，因样品中所含红细胞中的成分而产生的测定误差，即溶血干涉问题还未得到充分解决。发明内容
本发明的课题是提供由可生成6-磷酸葡糖酸的反应体系测定生物样品中待测物质时，可得到正确测定值的测定方法。
本发明人等为了解决上述课题进行了悉心研究，着眼于用辅酶测定葡萄糖的反应体系中最终生成物为6-磷酸葡糖酸(以下略作6PG)，本发明人等发现血细胞中的6PG脱氢酶(以下略作6PGDH)以NADP为辅酶进行反应，并给葡萄糖测定体系的结果6PG的测定值带来正误差。
于是，本发明人等发现了用辅酶测定葡萄糖的反应体系中，通过将6PGDH置于反应体系外得到正确的葡萄糖测定值的方法。对于溶血时6PGDH活性的影响以往没有报道，该影响是本发明者们首次发现。而以往把MK活性和血细胞中葡萄糖、磷酸作为溶血时的影响因素来考虑并不十分合适。
也就是说，本发明包括，1.一种待测物质测定方法，其特征在于，通过可生成6PG的反应体系测定生物样品中待测物质时，将6PGDH置于反应体系外；2.上述1中所述的待测物质测定方法，其特征在于，将6PGDH置于反应体系外的方法是在反应体系中应用不与6PGDH反应的辅酶；3.上述2中所述的待测物质测定方法，其特征在于，应用NAD或Thio-NAD作为不与6PGDH反应的辅酶；4.上述1中所述的待测物质测定方法，其特征在于，应用6PGDH活性抑制剂作为将6PGDH置于反应体系外的方法；5.上述1中所述的待测物质测定方法，其特征在于，应用抗6PGDH抗体作为将6PGDH置于反应体系外的方法；6.上述1～5中任一项所述的待测物质测定方法，其特征在于，还将乳酸脱氢酶置于反应体系外；7.上述6中所述的待测物质测定方法，其特征在于，以含有草酸、草氨酸、或它们的盐作为将乳酸脱氢酶置于反应体系外的方法；8.上述1～7中任一项所述的待测物质测定方法，其特征在于，待测物质是可由生成葡萄糖的反应体系进行测定的物质；9.上述1～8中任一项所述的待测物质测定方法，其特征在于，待测物质至少是选自己糖、中性脂肪、无机磷、肌酸激酶或其同功酶、淀粉酶或其同功酶的1或2种以上物质；10.一种避免溶血干涉的方法，其特征在于，将由溶血产生的6PGDH置于反应体系外；11.一种试剂，它由试剂盒化的或单独的上述1～9任一项所述的方法中所必要的试剂构成。发明的实施方案
本发明中通过可生成6PG的反应体系测定生物样品中的待测物质时，例如采用通过酶反应，用辅酶测定己糖或磷酸化己糖的反应体系。这里的己糖是指六碳糖，代表性的是葡萄糖。通过这样的测定体系所测定的临床检验项目，例如葡萄糖(GLU)、中性脂肪(TG)、无机磷(IP)、肌酸激酶(CPK)等。
例如，如式1和式2所示，测定葡萄糖和中性脂肪时，通过生成葡萄糖的反应体系的最终产物是6PG。
用辅酶测定己糖或磷酸化己糖的反应体系中，样品发生溶血时，会产生给测定值带来正误差的现象，这种现象叫做溶血干涉。
这被认为是由于溶血，血细胞中的6PGDH以测定体系中的NADP为辅酶并与6PG反应，其结果得不到6PG的正确测定值，进而起到干涉作用。本发明注意到因溶血产生的6PGDH而引起的干涉作用，进而将上述测定体系中的6PGDH置于测定反应体系外，由此避免了溶血引起的干涉作用。
将6PGDH置于测定反应体系外的方法有，例如在反应体系中应用不与6PGDH反应的辅酶、应用6PGDH的活性抑制剂、添加6PGDH的抗体、或免疫去除6PGDH等。再者，本发明者发现6PGDF可以NADP为辅酶进行反应，但不能将NAD作为辅酶加以识别；进而，通过将NAD组合到反应体系中，达到了将6PGDH置于反应体系外的目的，并发明了避免溶血影响的新型测定方法。
NAD或NADH受样品中脱氢酶，尤其是乳酸脱氢酶(以下略作LDH；NAD依赖性)的影响，而含有草酸、草氨酸或它们的盐类则可完全避免LDH的影响，因此可与该测定方法组合应用。
通过本发明的辅酶测定己糖或磷酸化己糖的反应体系中，除辅酶以外，可组合应用选自HK、G6PDH、己糖、G6P中的一种或两种以上酶或糖。通过这些酶方法测定葡萄糖的方法已众所周知。式1式2实施例
以下用实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。实施例1
用采血管采血后，将血液在3000rpm离心，获得人血红细胞。将该血红细胞在-20℃冻结，再在室温融解。由此血细胞破裂，得到溶血成分。用生理盐水将之稀释，得到500mg/dL的血红蛋白。配制以下所示试剂。
将2.0mM NADP、1.0mM 6PG溶解到0.1M三乙醇胺缓冲液(pH7.5)中，配成试剂A；将2.0mM NAD、1.0mM 6PG溶解到0.1M三乙醇胺缓冲液(pH7.5)中，配成试剂B。
将试剂A和试剂B在37℃加热5分钟后，添加溶血了的样品15μL，每隔1分钟在波长340～750nm处测定吸光度。测定该溶血溶液时，如图1所示，应用NAD时未发现吸光度的上升。另一方面，如图2所示，以NADP为辅酶进行反应时，NADPH在340nm的吸光度上升。该结果表明，通过应用NAD可避免溶血干涉。实施例2
配备以下所示试剂，用于葡萄糖(GLU)测定。
(试剂1)
Tris 100mM
HK 3.5U/mL
G6PDH 5.0U/mL
β-NAD 3mM
醋酸镁 10mM
PH6.0
(试剂2)
Tris 200mM
ATP 6mM
PH9.0
另外，还配制试剂组成中用β-NADP替代β-NAD的上述试剂。(操作方法)
向5μL样品中添加210μL试剂1、70μL试剂2，在主波长340nm的条件下，用日立7170型自动分析装置进行终点检测，用预先制作的标准曲线算出葡萄糖浓度。
将溶血液配制成血红蛋白浓为0、100、200、300、400、500mg/dL，人血清成分浓度恒定的样品。如图3所示，以NADP为辅酶的试剂A，其葡萄糖测定值对血红蛋白浓度依赖性上升；而用NAD时未发现测定值上升，也没有因溶血产生正误差。血红蛋白浓度为0mg/dL时，葡萄糖为80mg/dL。实施例3
配备以下所示试剂，用于测定中性脂肪(TG)。
(1)试剂1的组成
N-[二羟乙基]甘氨酸 50mM
(Bicine)
氯化钾 100mM
氯化镁 10mM
非离子去污剂A-10R 0.5％
(ノニォン A-10R)
Triton X-100 0.2％
叠氮钠 0.1％
PEP 4.0mM
ATP 3.0mM
G6PDH 4.5U/mL
PK 3.0U/mL
GK 3.0U/mL
PH8.5
(2)试剂2的组成
MES 50mM
草酸 100mM
葡萄糖 80mM
Triton X-100 0.25％
β-NAD 7.0mM
叠氮钠 0.1％
ADP-HK 10.0U/mL
脂肪酶 1500U/mL
pH6.5
另外，还配制试剂组成中用β-NADP替代β-NAD的上述试剂。
用与葡萄糖测定同样的测定操作测定中性脂肪。
将溶血液配制成血红蛋白浓度为0、100、200、300、400、500mg/dL，人血清成分浓度恒定的样品。如图4所示，NADP为辅酶的试剂B，其中性脂肪测定值对血红蛋白浓度依赖性上升；而用NAD时未发现测定值上升，也没有因溶血产生正误差。血红蛋白浓度为0mg/dL时，中性脂肪的浓度为95mg/dL。发明的效果
如上所述，由可生成6-磷酸葡糖酸的反应体系测定生物样品中的待测物质时，通过将6-磷酸葡糖酸脱氢酶置于反应体系外，可防止溶血干涉，也可得到待测物质的正确测定值。附图的简单说明
图1表示NAD反应体系中溶血液吸光度的变化。(实施例1)
图2表示NADP反应体系中溶血液吸光度的变化。(实施例1)
图3表示葡萄糖测定值的变化。(实施例2)
图4表示中性脂肪测定值的变化。(实施例3)