制备免疫刺激性乳类产品的方法和其应用 本发明涉及双歧杆菌在制备尤其适合用作婴儿食品的免疫刺激性乳类食品中的应用：该食品可以以液体或粉末形式存在。
双歧杆菌属(Bifidobacterium)属于放线菌科(Actinomycetaceae)；它将在严格厌氧条件下通过果糖-6-磷酸磷酸转酮酶途径发酵葡萄糖的革兰氏阳性细菌划归一组。它们的最佳生长pH在6-7之间，最佳生长温度在37-40℃之间。
双歧杆菌是正常人肠内微生物区系的一部分，它们被认为对健康具有多种有益作用。特别是已知，具有双歧杆菌占多数的肠内微生物区系的母乳喂养未断奶婴儿比工业乳类制品喂养的未断奶婴儿具有更强的抗感染性，特别是具有较低发生腹泻的危险性。
双歧杆菌在这种感染抗性的增强中所起的作用一直没有获得完全阐明。多项研究显示，它们具有免疫刺激性能力，这种能力可能涉及该细菌壁有关的多糖，或该细菌厌氧发酵过程中分泌的多糖。GOMEZ等[FEMSMicrobiol.Lett.，56，47-52，(1988)]描述了富含青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)所产生多糖的细胞外组分的免疫调节作用；以Laboratoires OM为名义的公开号为2652590的法国申请描述了Bifidobacterium infantis longum产生的多糖性质的免疫强化外聚合物(exopolymer)；HOSONO等[Biosci.Biotech.Biochem.，61，312-316(1997)和Bioscience Microflora，17，97-104，(1998)]描述了各种双歧杆菌属菌种产生地免疫强化剂多糖。双歧杆菌的免疫调节作用还表现在其对肠内微生物区系的调节上，尤其是对致病性菌种发育的破坏。ROMOND等[Anaerobe，3，137-143，(1997)，和J.Dairy Sci.81，1229-1235，(1998)]因此描述了短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)在厌氧发酵条件下产生的、可体内诱导对肠内微生物区系的调节作用的、富含糖蛋白的组分。
市场上现已有多种任选与其它乳酸菌结合的双歧杆菌发酵产品。食用这些产品可以从双歧杆菌和其发酵产品的免疫刺激性作用受益。
然而，就婴儿营养而言，它们的缺点是过酸，而且由于发酵中产生的酸性使乳类蛋白质凝固从而导致尤其是粉末产品在复制后具有不均一性。因此，有时它们难于被孩子或母亲的接受。
然而，现在本发明人发现通过双歧杆菌制备具有免疫刺激性质的物质可以在无需发酵的情况下进行，由此就避免了终产品的酸化。
本发明的主题是制备免疫刺激性乳类产品的方法，其特征在于：在不利于双歧杆菌发酵的条件下，使乳类底物与双歧杆菌培养物接触，以利用所述培养物对所述底物进行生物转化。
词组“不利于双歧杆菌发酵的条件”定义为如下条件，在该条件下按每毫升最初接种1-5×107CFU计，8小时孵育过程中双歧杆菌导致的培养基酸化不超过0.5个pH单位。
借助于简单试验，通过改变尤其是培养基的通气、渗透压和/或培养温度，以及通过测量培养开始和结束时的pH，本领域技术人员可以容易地确定这些条件。
对于大多数双歧杆菌属菌株，这些条件可以按尤其是如下方式获得：
-例如通过搅拌，保持在有氧条件下；
-使培养基的渗透压保持在相应于0.93-0.97水活度(AW)的压力下；
-使温度保持在40-48℃；
以及这些各种条件的组合。
乳类底物和双歧杆菌的接触可以以每毫升乳类底物1×107-1×109CFU双歧杆菌的比率进行。在生物转化反应结束时，最终的双歧杆菌群为每毫升产品1×105-1×109CFU。
在与该细菌接触的过程中乳类底物的pH优选为6.3-7，生物转化反应结束时产品的pH优选为6-7。
依据所用条件，乳类底物和该细菌的接触持续时间可以为6-24小时。
该乳类底物可以是乳、或任何基于乳的基料；这可以是例如乳浓缩物、婴儿乳制品的基料、酸乳酪的基料等。
可以向该基于乳的基质中加入对于制备期望获得的即食食品所必须的成分。例如，如果期望获得用于未断奶婴儿的乳类食品，可以加入乳糖、麦芽糖糊精、矿物质、维生素、脂肪和可以复制母乳组合物的成分。如果需要的话，可以掺入脂肪，然后使之与该溶液均一化以获得稳定的乳浊液。
尤其适合于实施本发明的短双歧杆菌菌株，根据布达佩斯条约于1999年5月31日保藏在巴黎，25 rue du Docteur Roux，Institut Pasteur的CNCM(国立微生物保藏中心)，保藏号为I-2219。
该菌株具有下列特点：
形态：具有稀少的Y和V形的短细菌
代谢：厌氧生活；产生L-(+)-乳酸和乙酸。
糖的发酵：葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、七叶苷、核糖、甘露糖醇、山梨糖醇、D-棉子糖、蜜二糖。
本发明的主题还有其特征在于可以采用根据本发明的方法获得的液体乳类产品。
该产品优选在生物转化反应结束时具有6-7的pH。
比较起来，通过双歧杆菌发酵获得的现有产品在发酵结束时具有4-4.6的pH。
该产品可以就如此食用，或可以经多种处理，该处理的性质根据期望获得的即食产品而改变。例如，可以补加调质剂、增香剂、维生素或矿物质补充物、脂肪等，如果初始基质中未加入这些物质的话。还可以对其进行浓缩或稀释。
根据本发明的乳类产品可以作用制备新鲜乳类食品的基础。
有利的是，还可以通过灭菌和/或脱水，采用它制备具有长货架寿命的食品。实际上，甚至在没有活细菌时，例如在干燥和UHT消毒后，本产品仍能保持其免疫刺激性质。
本发明还包括从根据本发明的乳类产品获得的新鲜、灭菌、或脱水乳类食品。
本发明还包括通过在根据本发明的脱水乳类食品中加水获得的复制乳类食品。
根据本发明的(新鲜、灭菌或脱水的)乳类食品一般具有6-7.5的pH，优选6.5-6.9的pH。
与现有技术中已知的通过双歧杆菌发酵产生的食品不同，根据本发明的乳类食品不是酸性的，并含有可溶性不凝固形式的乳类蛋白质。因此，当在根据本发明的脱水乳类食品中加入水后，可以获得均一产物，无沉淀或相分离。
利用其免疫刺激性作用，根据本发明的乳类食品可以赋予对微生物和病毒感染的抗性，该抗性可与现有技术中已知的通过双歧杆菌发酵产生的食品相比，并且由于本产品在味道和外观上的改变又没有现有产品的缺点。它们尤其适合用作婴儿食品，尤其是用作未断奶婴儿的食品，但它们也可以用作任何年龄对象的食品。
通过以下有关制备本发明乳类产品的实施例的进一步描述，可以更为清楚地理解本发明。实施例1.制备具有免疫刺激活性的用于未断奶婴儿的粉末食用乳制品
制备乳浓缩物，其组成按每100g干物质所含克数计陈述如下：乳蛋白质(80％酪蛋白和20％血清蛋白) 13植物脂肪 25.5乳糖 42.25麦芽糖糊精 16矿物质 3维生素 0.25
在脱脂牛乳中加入植物脂肪，加热至75℃。在相同温度下分2个阶段进行匀浆化，第1个阶段采用200kgs/cm2，第2阶段采用50kgs/cm2。然后加入事先溶解在水中的乳糖和麦芽糖糊精，再加入维生素和矿物质溶液。
最终混合物于115℃进行巴氏消毒，然后通过蒸发浓缩为48％干物质。
将该浓缩物冷却至37℃，然后以5％的比例接种含有109个细菌/ml的短双歧杆菌I-2219培养物。最初pH为6.15，渗透压为0.96。
于罐中每2小时周期性持续搅拌10分钟进行通气的条件下，37℃孵育8小时后，pH为6.1，短双歧杆菌菌群为106个细菌/ml。Dornic酸度为48°D。
喷雾干燥此浓缩物。当按每升水140g的量将获得的粉末加入水中时，可以获得具有以下特点的复制乳：pH6.6、Dornic酸度12°D；液体乳的外观，无凝乳颗粒。实施例2：制备具有免疫刺激活性、用于未断奶婴儿的、UHT消毒并无菌包装的即食性食用乳制品
制备混合物，其组成(按g/升)见下：蛋白质 21脂肪 24糖类 83矿物质 5维生素 0.45
从以下成分制备该混合物(每100升终产品)：
-58升脱脂乳，
-2.4kgs脂肪，
-4.7kgs乳糖，
-0.7kgs麦芽糖糊精，
-0.3kg维生素，
-0.05kg矿物质复合物。
预先采用UHT系统热处理该乳，使温度达到115-120℃。
在冷却至70℃的该乳中加入脂肪，并分2个阶段进行匀浆，第1个阶段采用200kgs，第2个阶段采用50kgs。
将该混合物冷却至37-38℃后，以1.5％的比例接种含有1-5×109个细菌/ml的CNCM I-2219培养物。
在与上述实施例1相同的条件下，37℃孵育8小时，之后冷却至5℃。
产品的pH为6.3，并且短双歧杆菌菌群为3×107个细菌/ml。Dornic酸度为23°D。
将剩余的成分溶解在约50升水中，然后加至孵育结束时获得的产品中。
在无菌包装前，对由此产生的混合物进行UHT处理，140℃处理6-7秒。实施例3：根据本发明的乳类产品的免疫刺激作用
按以下所述对根据本发明的乳类产品的免疫刺激作用进行研究：
-通过在具有人菌群的小鼠上粪便菌群的产生；
-通过对具有产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的单主寄
生小鼠上转移现象的调节。研究具有人类菌群的小鼠中粪便菌群的产生：
该小鼠是具有人类菌群的成年C3H系小鼠。
此为G1代，GO代是在成年期获得人类菌群的无菌小鼠。
-每组小鼠数量：6只
-试验次数：每种产品2次。
将这些小鼠关在同一笼中1周，然后将6只分放在1个笼中。
在试验开始时小鼠的年龄为最小8周，最大11周。
在粪便菌群中对如下项进行监测：
-双歧杆菌
-脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)
-梭菌(Clostridia)的孢子
-任选产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)的孢子微生物技术
临用前收集粪便样品，在无菌条件下称重并稀释在预还原Ringer氏溶液中(稀释四分之一并按0.3g/l补加盐酸半胱氨酸)。
对预还原BEERENS和BBE培养基上直接接种并在厌氧条件下孵育的双歧杆菌和脆弱拟杆菌进行计数。
对于就梭菌孢子进行的试验：
-75℃加热这些悬浮物10分钟，然后接种在补加了葡萄糖(5g/l)和盐酸半胱氨酸(0.3g/l)的Columbia琼脂上，培养5天，
-通过形态和阴性过氧化氢酶反应鉴定梭菌菌落。在革兰氏染色3后确定该细胞的形态。
对于接种了发酵CNCM I-2219并立即施用的对照乳制品，所获结果列于下表I(接触时间＝0)
表I T0 T7天 T15天双歧杆菌 8.2±0.3 9.3±0.1 8.6±0.1脆弱拟杆菌 7.2±0.5 9.3±0.1 9.2±0.1梭菌 4.3±0.1 5.1±0.5 6.7±0.3
结果以log形式表示，数字代表6只小鼠结果的平均值；观察到脆弱拟杆菌和梭菌显著增加，也即感染危险性显著增加。
对于接种了CNCM I-2219并与之37℃接触8小时的根据本发明的乳制品，所获结果列于下表II。
表II T0 T7天 T15天双歧杆菌7.1±0.1 11±0.5 10.3±0.8脆弱拟杆菌8±0.2 7.9±0.3 nd＜4.7log梭菌3.9±0.3 4.4±0.2 4(1只小鼠) 其它5只：不存在产气荚膜杆菌3.7±0.9 nd ndnd：未测
与对照相比，尤其是在施用15天后，观察到双歧杆菌增加2.5log，而拟杆菌和梭菌有极大的降低。对具有产气荚膜梭菌的单主寄生小鼠进行的研究
目的：验证根据本发明的产品对肠道细菌在各种器官中传播的影响。
实验条件：将无菌小鼠(年龄＝8周)关在消毒的隔离单元中，并用辐射消毒的RO3基料饲喂。
测试的产品：
-高压灭菌超纯水
-按每100ml水14g(粉末重量)的比例补加了根据本发明的制品(PII)的高压灭菌超纯水。
这些溶液每日按无菌方式制备，并随意地给予小鼠6天。在这段时间结束时，以每只小鼠3.5-4.5log CFU的比例接种产气荚膜梭菌菌株LAB(人类肠道来源)。接种后24、48小时、4天和7天，每组处死2只小鼠，测量产气荚膜梭菌在淋巴器官中的植入和传播。采用3个管子在LS培养基中(46℃孵育24-48小时)通过最大可能数量法进行计数。
结果列于下表III：
表III D1 D2 D4 D7 PII 水 PII 水 PII 水 PII 水回肠近端 2 2 0 1 0 2 2 2中间 2 D 0 1 0 2 2 2远端 2 0 0 1 0 2 2 2盲肠 2 0 0 2 1 2 2 2结肠 2 2 0 2 2 2 2 2淋巴集结 1 1 0 0 1 2 2 2肠系膜神经节 0 2 0 0 1 2 1 2菌血症 0 0 0 0 0 0 0 0脾 0 1 0 2 0 2 1 2肝 0 0 0 0 1 2 2 2肾 0 1 0 2 1 2 1 2肺 0 0 0 0 0 2 0 0表III符号说明：0＝低植入/传播1＝平均植入/传播2-高植入/传播
观察到下列现象：
-施用根据本发明的产品后，产气荚膜梭菌的植入出现24小时的延迟；
-在食用本发明产品(PII)的小鼠的淋巴器官中为低传播。
这些结果表明，根据本发明的制品调节产气荚膜梭菌在淋巴器官中的传播。