一种胚胎营养素的生产工艺 本发明涉及的是鸡胚营养素(chicken embryonin，CENIN)的技术领域。
本发明的目的在于提供一种采用生化提取和中空纤维超滤制备高浓度，高产量，低成本和活性高的鸡胚营养素(CENIN)的制备方法，原材料选用健康禽类动物如鸡、鸭、鸽、鹅等的孵化蛋胚胎组织，可以制成口服液，也可制备注射药。
本发明的目的可通过以下的技术措施来达到：选用健康禽类动物如鸡、鸭、鸽、鹅等的孵化蛋胚胎组织，用任何机械方法捣碎→-20℃深冻→加热70-90℃，15-30min→恢复至室温，冻存→融化后，离心，取上清液→过正压截留柱→取滤液→除菌→分装，包装→制备注射药/或加调味剂制作抗衰老口服液/或胶囊/或加赋型剂制造美容护肤品。。
本发明的目的也可通过以下的技术措施来达到：
在上述方案中，健康禽类动物可选自鸡、鸭、鸽、鹅等
在上述方案中，加热温度可从40-95℃优选70-90℃和时间从10-100min，优选15-30min。
在上述方案中，截留柱的截止分子量为1000-100,000道尔顿。正压0.1-1.0×104Pa，其组合方式为单柱或多柱组合使用。
在上述方案中，所制备的鸡胚营养素(CENIN)，截止分子量≤1,000,000道尔顿时，在制备过程到除菌一步时加入调味剂分装成品可制成抗衰老口服液和截止分子量≤20,000道尔顿时可制成注射液，或与其它药物配伍静脉滴入给药。
本发明方法进一步地优选方案如下：
选用健康禽类动物如鸡、鸭、鸽、鹅等的孵化蛋胚胎组织，用任何机械方法捣碎→-20℃深冻→加热70-90℃，15-30min→恢复至室温，-10℃冻存→融化后，离心，取上清液→过0.1-1.0×104Pa正压截留柱，截止分子量为1000-100,000道尔顿→取滤液→除菌→分装，包装→制备注射药/或加调味剂制作抗衰老口服液/或胶囊/或加赋型剂制造美容护肤品。。
实施例1
鸡胚提取物的制造：禽类胚胎组织，匀浆，-20℃深冻→融解后加热→恢复至室温，-10℃冻存→融解后，离心→取上清液→过正压截留柱→取滤液→除菌→分装→制成注射液/口服液，每毫升含蛋白5.0mg(蛋白含量测定采用改良Lowry′s法)。
本发明的目的是采用生化提取利用中空纤维超滤技术制备鸡胚营养素(CENIN)；同目前最先进的方法相比，具有浓度高，产量高，活性高和成本低的特点。
实施例2
鸡胚提取物的生物学活性鉴定：
1、鸡胚成纤维细胞的分离：取10龄鸡胚，去头及内脏，剪碎，加入0.25％的胰酶，室温下消化30-60min；分离悬浮的单个细胞，离心，去胰酶，用含10％小牛血清的DMEM培养基调细胞浓度为5-10×108/L；用培养瓶培育2小时，倒去上清，加含10％小牛血清的DMEM培养基继续培养，等细胞长满后，用胰酶消化贴壁细胞做活性测定试验。
2、生物学活性测定：调细胞浓度为4.0-8.0×108/L接种于96孔培养板，0.1ml/孔。置37℃5％CO2，24小时后换液，加入添加0.5、1.25、2.5、5、10、20％的鸡胚提取物，以1.0×106μ/L FGF为阳性对照，以生理盐水为阴性对照孔。72小时后，弃上清。96孔板加含0.15g/LMTT和2mci/L3H-Tdr F12培养液0.05ml。培养4小时，分别做MTT比色和3H-Tdr掺入的技术操作。
3、结果：
3.1鸡胚提取物对培养72小时鸡成纤维细胞增殖的影响。
在普通培养基的基础上分别添加0.5、1.25、2.5、5、10、20％的鸡胚提取物，观察它们对鸡成纤维细胞DNA合成的影响(表1)。表1鸡胚提取物对成纤维细胞3H-TdR掺入的影响(X±SD，n=8) 浓度(％) cpm
20 1194±152
10 1805±280
5 2755±431* 2.5 3506±1302** 1.25 3019±1381** 0.5 2713±834* bFGF 3135±727** 对照组 1641±334
注：*，P＜0.05，**，P＜0.01，同对照组比较。
结果显示鸡胚提取物能明显促进鸡成纤维细胞的DNA合成。3.2鸡胚提取物对培养72小时鸡成纤维细胞活力的影响。在普通培养基的基础上分别添加0.5、1.25、2.5、5、10、20％的鸡胚提取物，观察它们对鸡成纤维细胞增殖的影响(表2)。表2鸡胚提取物对鸡成纤维细胞脱氢酶活力的影响(x±s，n＝5)浓度(％) 0D值
20 0.180±0.036
10 0.199±0.048
5 0.219±0.048
2.5 0.250±0.092
1.25 0.248±0.083
0.5 0.184±0.029
bFGF 0.248±0.047对照组(0) 0.185±0.046注：*，P＜0.05，**，P＜0.01，同对照组比较。
实施例3
鸡胚提取物对鸡胚胎干细胞生长的影响
1、材料
1.1新鲜美国海南白鸡种蛋(由广东力康农工商集团公司提供)，按Eyal-Giladi和Kochav方法[3]分期为IX～XI期，分离鸡胚盘细胞限产蛋后5hr以内。
1.2进口特级胎牛血清(FBS，Gibco)、国产FBS和国产新生小牛血清(NCS；由杭州四季青生物工程材料研究所提供)。DMEM(高糖，无丙酮酸钠，sigma)，非必需氨基酸(×100，Gibco)，鼠白血病抑制因子(mouse leukiemia inhibitory factor，mLIF，106M，Gibco)和人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，10ug，Gibco)，β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME；Nacalai Tesoue INC Kyota，Japan)，伴白蛋白(Conalbumin，Sigma)。快蓝BB盐(Fast blue BB salt，Sigma)和萘酚-AS-MX(Naphthol ASMXphosphate，Sigma)。
1.3 ES细胞培养基：10％国产NCS，40ng.ml-1伴白蛋白，1％非必需氨基酸，1000u.ml-1mLIF，10ng.ml-1的人bFGF，5％FBS(国产或进口)和0.14mM的β-ME的高糖DMEM培养基。
2.鸡胚成纤维细胞(chicken embryonic fibroblast，CEF)饲养层的制备取鸡胚(8～12日龄)，去除内脏及头，剪碎，胰酶分步消化。按1×105～2×105.ml-1分板或分瓶培养，12hr换液。细胞长满后应及时用胰酶传代。用做ES细胞培养的饲养层细胞，大约应为80％～90％满瓶生长。用前用含10ug.ml-1丝裂霉素-C培养基处理2～3hr，PBS洗涤三次后用基础培养基培养直至用于分离或传代ES细胞。
3.鸡胚盘细胞分离 分离的胚盘用0.25％的胰酶消化成小细胞团，用含5.6nM的D-葡萄糖(PBS-G)洗涤三次后用基础培养基培养，24小时后换液，3～5d后传代至丝裂霉素-C处理过的饲养层细胞上培养。改换完全ES细胞培养基。
4.鸡胚胎干细胞培养 鸡胚盘细胞于37℃、5％CO2、湿度99％中常规培养，每24hr换液一半。3～5d传代一次，传代时先用PBS-G洗涤三次，0.25％胰酶37℃消化5～10min。分离的ES细胞团重新接种于丝裂霉素-C处理过的饲养层细胞，用完全ES细胞培养基常规培养。于细胞传代时用倒置显微镜计数ES细胞集落数。
5.碱性磷酸酶反应取传代胚盘细胞分别于第一代，第三代，第九代终止培养，培养细胞用PBS洗涤三次，用冷的4％多聚甲醛于4℃固定15min。PBS洗涤，于AKP液(配方：①5mg快蓝BB盐+50μlHCl+200μl双蒸水。②2.5mg萘酚-AS-MX+100μl DMSO+5ml 0.1M TrisHCl(pH8.2-9.2)+100μl 10％MgCl2。将①+②混合，调pH至8.4)中37℃孵化5～30min，用10nM EDTA终止反应，PBS冲洗，用倒置显微镜计数ES细胞阳性集落。
6、结果
6.1鸡胚盘细胞初次传代时的表现从新鲜海南白鸡种蛋的胚盘细胞中分离培养鸡ES细胞，从细胞的生长方式、形态学特征和AKP染色观察识别，可见以下4种集落：ES细胞集落，细胞小，排列紧密，界限不清，集落呈团状、山丘状或鸟巢状生长。此外还可见滋养层细胞集落，上皮样细胞集落，内皮样细胞集落。ES细胞集落在最初几代的传代过程中很容易分化，需多次传代才能得到稳定的ES细胞系。
6.2条件培养基对ES细胞建系的影响(表3)
6.2.1.血清对ES细胞增殖的影响 实验时选用进口FBS，国产FBS和国产NCS。结果发现：采用10％国产NBS+5％进口FBS时，ES细胞传至第3代即消失，而10％国产NBS+5％国产FBS时，ES细胞可传至第9代并呈增多趋势，单纯10％国产NBS也可见细胞传至4代。因此，分离ES细胞时，筛选血清对成功克隆ES细胞是非常重要的。
表3各种血清条件培养基对ES细胞集落数的影响传代数 0 1 2 3 4 5 6ES细胞培养基 - 24 15 8 3 0 0ES细胞培养基 - 19 3 0 0 0 0 +5％进口FBSES细胞培养基 - 28 19 14 12 16 21 +5％国产FBS
6.2.2. 鸡胚提取物对ES细胞集落数的影响在饲养层细胞存在的条件下，鸡胚提取物对ES细胞集落数的影响见表4。
表4鸡胚提取物对鸡ES细胞集落数的影响传代数 0 1 2 3 4 5 6ES细胞培养基 - 36 28 15 8 1 0ES细胞培养基 - 31 19 14 18 21 41+鸡胚提取物
结果显示：在其它条件一致的情况下，加用鸡胚提取物的培养液中，鸡ES细胞集落数于5代后呈上升趋势。