人α2b型干扰素的基因合成、表达质粒构建及产物的制法 本发明涉及一种用基因工程技术实现大量生产人α2b型干扰素的方法
人α2b型干扰素作为重要的生物高科技产品，是治疗乙肝、丙肝等病毒性疾病和恶性肿瘤的重要药物。在我国，干扰素的生产工艺复杂，产量偏低，成本较高，还不能为广大工薪阶层广泛接受和使用，影响了干扰素的产业化进程，因此大幅度降低其生产成本是当前干扰素开发中的一项重要任务。
人α2b型干扰素当前存在生产成本高的问题，其主要原因是：表达水平偏低，干扰素蛋白的表达只占菌体可溶性蛋白的1-2％；干扰素成品的获得需经历多重复杂的纯化工艺流程，纯化损失大，回收率只有10-20％。
对本发明通过全基因分段合成和PCR拼接，构建了全人工合成地人α2b型干扰素基因，利用原核表达载体pBV220和pWT7在大肠杆菌DH5α中以包涵体形式获得高效表达，并建立了一整套简便有效的纯化人α2b型干扰素的工艺流程，提高了干扰素的表达量和最终得率。人α2b型干扰素的表达量达到菌体可溶性蛋白的20％，干扰素α2b的最终产量可提高数十倍，大幅度降低了干扰素制剂的成本。全人工合成高产廉价人α2b型干扰素的研制成功，将带来干扰素产业的更新换代，具有巨大的社会效益和经济效益，造福广大人民。
以下对本发明进行详细描述。1．人α2b型干扰素基因DNA序列的设计
通常的技术改进手段，如上游表达载体的优化、下游工程中表达与纯化工艺的改良等，对干扰素的表达量与最终得率的提高的效果均不明显。本发明从影响异源蛋白在大肠杆菌中表达水平的另一重要影响因素---基因的密码子构成入手，对人α2b型干扰素基因进行了全面的设计与合成。
同一种氨基酸乃至蛋白质多肽分子，根据密码子的简并性，可由不同的DNA序列来编码。不同生物种对蛋白质的编码基因的密码子的喜好性是不同的，现有的人α2b型干扰素基因的DNA序列是自正常人白细胞经新城疫病毒诱导后克隆而来，其密码子构成体现了人对编码蛋白质的密码子喜好性，将这种DNA序列通过载体由大肠杆菌来表达，因此得到很低的表达水平。采用大肠杆菌的喜好密码子来替代天然密码子，是提高干扰素的可行手段。
本发明根据各种密码子的在大肠杆菌中的使用频率，保留人α2b型干扰素的氨基酸序列不变，选用在大肠杆菌的喜用密码子，取代原有人α2b型干扰素基因DNA序列中的非喜用密码子，设计全新的人α2b型干扰素基因DNA序列。人α2b型干扰素的氨基酸序列、天然基因及合成基因的序列见附图k2．人α2b型干扰素基因的全人工合成
根据所设计的DNA序列，采用全基因分段合成和PCR拼接的策略，构建人工合成的人α2b型干扰素基因。2．1 在通用的DNA自动合成仪上采用亚磷酸酰胺法化学合成以下7段长度为90bp左右的DNA片段，编号分别为L1,L2,L3,R1,R2,R3和R4。其中L1的5‘端含EcoR1位点，R4的3’端含BamH1位点，以便向表达载体插入。
序列中的阴影部分，表示该处是两段DNA片段互补搭接之处。2．．2利用PCR反应体系，搭桥法分步延长合成的IFNα2b基因片段。2．2．1 DNA片段L3,R4的链延长反应
根据设计，L3与R4的末端有20个碱基互补，这使两链相连，在PCR反应体系中，两链未互补部分互为模版发生链延长。反应条件：L3 5μL(0.10D/μL),R45μL(0.10D/μL),10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmol/L)16μL,H2O 63μL，反应体系共100μL。94℃恒温5min，55℃恒温加入TaKaRa LATaq酶1μL后，恒温5min,72℃,5min.即可得到由L3和R4拼接而成的两条互补长链，名为L3R4，为下一步PCR反应的模版。2．2．2 DNA片段L2,R3的链延长反应
与前一步同理，依据设计，L2与L3有20bp的互补序列，R3与R4有20bp的互补序列。利用引物L2和R3进行如下的PCR反应，反应条件：L2(0.01 OD/μL)1pL,R3(0.01 0D/μL)1μL,模板L3R4 1μL,10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmol/L)10μL,TaKaRa LA Taq酶1μL,H20 76μL，反应体系共100μL,94℃,30s,55℃30s,72℃,30s，共30循环。产物名为L2L3R4R3，为下一步PCR反应的模版。2．2．3 DNA片段L1,R2和R1的链延长反应
依据设计，L1与L2有20bp的互补序列，R2与R3有20bp的互补序列，R1与R2有20bp的互补序列。利用引物L1,R2和R1进行如下的PCR反应，反应条件：L1(0.01 OD/μL)1μL,R2(0.01 OD/μL)1μL,R1(0.01 OD/μL)1μL，模板L2L3R4R3 1μL,10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmol/L)10μL,TaKaRaLA Taq酶1pL,H2O 75μL，反应体系共100μL,94℃,30s,55℃30s,72℃,30s，共30循环。产物名为L1L2L3R4R3R2R1，即为合成的全长的人IFN α2b基因(命名为sIFNα2b)。3．全人工合成的人α2b型干扰素基因的克隆和表达：3．1全人工合成的人α2b型干扰素的表达载体pSI9903的构建及表达(实例说明)
用EcoR1和BamH1完全酶切全长的人IFNα2b基因，插入经EcoRⅠ,BamHⅡ双切的pBV220原核表达载体中，获得重组质粒pSI9903，转化大肠杆菌DH5α，所选转化克隆经PCR、酶切鉴定和DNA序列测定证明克隆正确。阳性克隆37℃过夜活化后，按1∶100比例转接共5ml含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养至OD=1，转42℃继续培养6小时，离心收集菌体，加入100ul 2X上样缓冲液，100℃煮沸5min,12％SDS-PAGE电泳检测干扰素表达，经凝胶扫描分析，干扰素表达量达到菌体蛋白的30％，比原有菌种的表达水平提高了10倍以上。附图2为pSI9903的质粒构建图。附图3为表达菌体的12％SDS-PAGE电泳图。3．2全人工合成的人α2b型干扰素的表达载体pSI9904的构建及表达
设计一对两端具NdeⅠ与BamHⅠ酶切位点的PCR引物，利用PCR反应自pSI9903中得到人α2b型干扰素基因，用Ndel和BamH1完全酶切PCR产物，插入经NdeⅠ,BamH Ⅰ双切的pWT7原核表达载体中，获得重组质粒pSI9904，转化大肠杆菌BL21，所选转化克隆经PCR、酶切鉴定和DNA序列测定证明克隆正确。阳性克隆37℃过夜活化后，按1∶100比例转接共5ml含Amp的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600=1，加入IPTG至终浓度为4mM 25℃继续培养6小时，离心收集菌体，加入100ul 2X上样缓冲液，100℃煮沸5min,12％SDS-PAGE电泳检测干扰素表达，经凝胶扫描分析，干扰素表达量达到菌体蛋白的30％，比原有菌种的表达水平提高了10倍以上。附图4为pSI9904的质粒构建图。附图5为表达菌体的12％SDS-PAGE电泳图。4 全人工合成的人α2b型干扰素的大量表达及纯化(实例说明)
将工程菌单菌落挑入5mL含50/mL氨苄的LB培养基中，37℃培养过夜，次日转至500mL含50μg/mL氨苄的LB培养基中，37℃培养至其进入对数生长期，转入5升发酵罐中，37℃培养至其OD=1，快速升温至42℃，诱导6小时，离心收菌。菌体湿重可达50g。
离心收集发酵的菌体经TE缓冲液洗涤后，溶菌酶、8M盐酸胍处理后，超声破菌，3500g离心得到包涵体，以7M尿素在4℃悬浮包涵体，继以8M盐酸胍裂解包涵体，PBS复性。透析去除盐酸胍后，离心取上清，过单抗柱，得到电泳纯的半成品，加入稳定剂后分装为成品。5．结果及产物活性测定
由于工程菌种的成功改造，在同样的成本投入条件下，人α2b型干扰素的产量是原有菌种的十倍以上；换而言之，获得同样产量的人α2b型干扰素，由于更换新菌种，其成本降为原来的十分之一以下。
经蛋白质N端测序，结果证实纯化蛋白为人α2b型干扰素。将纯化的人α2b型干扰素半成品经蛋白定量后，以国际上通用的WISH/VSV系统测定比活为1×108IU/mg，与标准的人α2b型干扰素比活一致。