抗变形链球菌粘附的多肽混合物 本发明涉及抗细菌粘附的多肽，尤其是关于抗变形链球菌粘附的多肽混合物及其在制造防龋产品中的应用。
实验表明，变形链球菌(streptococcus mutans)是主要的致龋细菌，主要有三个原因：1.其产酸力强，产酸迅速，且耐酸。2.能合成细胞外多糖和细胞内多糖，从而介导变形链球菌在牙面的粘附，参与菌斑基质的形成，促进菌斑成熟。3.对牙面有很高的亲和力，并具有致光滑面龋的能力。变形链球菌表面蛋白SAI/II是目前研究最多且被认为是变形链球菌较肯定的粘结素，研究显示SAI/II可与牙面获得性膜中的不同受体结合，如与粘蛋白，酸性蛋白等结合，这是致龋重要的步骤(刘天佳，《口腔疾病的微生物学基础》PP.53-55，人民卫生出版社，1999年)。
Kelly等在1990年(C.Kelly等，Archives of Oral Biology，35Suppl.，PP.33-38，1990)对变形链球菌表面蛋白SAI/II(185000分子量)的蛋白基因SpaP进行了DNA测序。Kelly等又在1999年(C.Kelly等，NatureBiotechnology，17(1)，PP.42-47，1999)证实SAI/II155KD蛋白中对应于1025-1044氨基酸残基的多肽片段(称作P1025，分子量3001道尔顿)有较强的抗粘附功能，并通过丙氨酸取代的方法证明Q1025，E1037及FVLV1041-1043是主要的结合位点，并用表面胞质团共振(Surface Plasmon Resouance)测定的方法证实，粘附抑制随P1025多肽浓度的增加而增加，在浓度为100μmd时有最强的抑制。但Kelly等没有给出最低的有效抑制浓度。
Kelly等用的P1025多肽是人工合成的19肽产物，纯化后纯度为97％。但实际应用时，这样高纯度的产物作为防龋产品中的原料应用，显然会使生产成本过高，而使实际防龋产品的开发无法实现。
为此，本发明地目的是提供一种抗变形链球菌粘附的P1025多肽混合物，其中19肽占75-96.99重量％，18肽及18肽以下的多肽占3.01-25重量％，该多肽混合物在极低的浓度下也具有抗变形链球菌粘附的功能，能大规模大范围应用于预防蛀牙的防龋产品的开发。
本发明提供一种P1025多肽混合物，该多肽混合物含有由20个氨基酸残基组成的19肽的P1025多肽及由19个或19个以下的氨基酸残基组成的18肽及18肽以下的P1025不完全多肽。其中19肽占75-96.99重量％，18肽及18肽以下的多肽占3.01-25重量％。P1025多肽混合物为白色或微灰黄色粉末或细颗粒，分子量为230-3001道尔顿，能溶于水，呈无色或微白色透明或轻微乳白状溶液。
19肽的P1025多肽的氨基酸顺序是：
Glu-Leu-Lys-Thr-Ala-Asp-Leu-Pro-Ala-Gly-Arg-Asp-Glu-Thr-Thr-Ser-Phe-Val-Leu-Val
本发明P1025多肽混合物的合成工艺
P1025多肽混合物的合成工艺采用常用的固相合成法(参见黄惟德等，多肽合成，科学出版社，1985年)。肽键的逐步延长是在不溶性的树脂小圆珠上进行，合成多肽的羟基一端以共价键先结合到树脂上，第二个氨基酸的氨基用叔丁基氧甲酰基保护后，以二异丙基碳二亚胺为缩合剂，接在第一个氨基酸的氨基上，重复这个步骤，使肽链按照上述P1025顺序延长合成多肽。多肽合成到最后一步时，把树脂悬浮在无水三氟乙酸中，通入干燥HBr，使多肽从树脂上解离下来，同时一些保护基也被除去，得到的产物即为本发明P1025多肽混合物不作提纯，直接冷冻干燥备用。
P1025多肽混合物合成工艺流程图参见图1。
为了表明本发明P1025多肽混合物对变形链球菌在牙面上粘附有抑制作用，采用H3标记细菌羟磷灰石法对P1025多肽混合物进行了体外抗粘附试验。试验结果表明，P1025多肽混合物在浓度为1pmol-1μmol时，对变形链球菌(S.mutans Ingbritt)及远缘链球菌(S.sobrinus 6715)均有抑制作用，抑制作用随多肽浓度增加而增加，多肽浓度在1μmol时有较强的抑制作用，但1pmol仍有有效抑制作用。
本发明P1025多肽混合物的抗粘附试验证明，它具有抗变形链球菌在牙面上粘附的生物功能，而且给出了最低的有效浓度为1pmol，因此P1025多肽混合物可以应用来制成有利于预防蛀牙的各种防龋产品，如防龋漱口水，防龋牙膏，防龋口香糖、奶糖等糖果，防龋牛奶、酸奶、果奶等乳制品以及防龋饮料等有很大的开发应用市场。
本发明优点：
本发明提供一种P1025多肽混合物，其中19肽占75-96.99重量％，19肽纯度要低于Kelly的报道值，但经实验证实也具有抗变形链球菌在牙面上粘附的生物功能。本发明P1025多肽混合物具有低浓度范围的抑制作用，并给出了最低有效浓度1pmol，对变形链球菌和远缘链球菌都有抑制作用。此外，由于本发明是一种多肽混合物，在合成工艺最后一步不要求作提纯，直接冷冻干燥即可得产物冻干粉，因此得率高，生产成本低。而且由于作用浓度低，在制造防龋产品时仅需要加入极微量多肽混合物即可。本发明P1025多肽混合物适用于大规模大范围的防龋产品的开发。
通过下列附图和实施例对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明范围。
附图说明：
图1是P1025多肽混合物合成工艺流程图。
图2是不同浓度的P1025多肽混合物对S.mutans Ingbritt细菌粘附于羟磷灰石的抑制作用试验结果图。
图3是不同浓度的P1025多肽混合物对S.sobrinus 6715细菌粘附于羟磷灰石的抑制作用试验结果图。
实施例1 P1025多肽混合物体外抗粘附试验
参见梁景平等，现代口腔医学杂志，2000年14卷第1期PP.1-3进行以下试验。将P1025多肽混合物溶液(浓度为1pmol，10pmol，100pmol，1μmol)分别加入含有包被测试唾液的羟磷灰石颗粒40mg的Eppendorf管中，37℃，6rmp旋转1小时，然后加入7ml含10uCi/ml 3H-胸腺嘧啶(3H-TDR)的细菌悬液(变形链球菌S.mutans Ingbritt或远缘链球菌S.sobrinus 6715)37℃，6rmp旋转1小时，用KCl缓冲溶液(含有0.05mol KCl，1mmolKH2PO4，1mmol CaCl2，1mmol MgCl2，PH6.0)洗三次，60℃烘干过夜。将Eppendorf管中加入1ml闪烁液(0.4％PPO(2，2’-对-苯撑-2，2(5-苯恶唑))液体闪烁测量仪(LS6500，Beckman公司)计数测量同位素放射量CPM。以同量标记菌悬液60℃烘干过夜后，直接加入1ml闪烁液，作细菌总量对照；以KCL缓冲液代替多肽，与上述试验相同进行相同实验步骤作为粘附阳性对照；以KCL缓冲液代替菌悬液，有多肽和无多肽的羟磷灰石颗粒与实验组进行相同实验步骤，作为阴性对照。实验重复两次，取均值。结果见图2和图3。实验结果显示P1025多肽混合物对S.mutans Ingbritt和S.sobrinus 6715细菌粘附于羟磷灰石有抑制作用，浓度在1μmol时为最强，但1pmol仍有有效抑制作用。
实施例2 P1025多肽混合物的合成
称取对甲基二苯甲胺树脂(0.5-0.7meg)100mg，放入尼龙滤布袋中封口，一起放入50ml三角烧杯中，用5ml二氯甲烷洗涤树脂，再用5％浓度的二异丙基乙胺每次5ml活化树脂，处理二次。再用二氯甲烷每次5ml洗涤树脂，洗涤二次。P1025多肽的氨基酸顺序C末端是Val(缬氨酸)，用BOC-缬氨酸(叔丁氧羰基-缬氨酸)的二氯甲烷溶液(0.26mol/l)，2.2ml和偶联缩合剂二异丙基碳二亚胺的二氯甲烷溶液(0.26mol/l)2.2ml在常温下反应4小时，接着用二氯甲烷洗涤树脂及二甲基甲酰胺洗涤树脂，用无水三氟醋酸5ml在常温下反应30分钟，以解离氨基酸保护基团，再用二氯甲烷5ml洗涤树脂及异丙醇5ml洗涤树脂，以去除残余的三氟醋酸。按P1025C末端第二个氨基酸为亮氨酸，按上述步骤循环重复合成，这样依次反复进行，肽链就可按P1025多肽的顺序延长，直到20个氨基酸全部接上去。多肽合成到最后一步时，把树脂悬浮在无水三氟醋酸中，通入干燥HBr气体，使多肽混合物与树脂解离，同时一些保护基也被除去，该多肽混合物产物不作提纯，直接于-20℃冷冻干燥，得P1025多肽混合物冻干粉(备用)。分子量是3001，多肽混合物中19肽占85重量％，18肽及18肽以下的多肽占15重量％。
实施例3 防龋牙膏的制备
将实施例2制得的P1025多肽混合物冻干粉500mg溶于蒸馏水中，配制成浓度为1pmol的多肽溶液，并将它浓缩200倍制成用于制备防龋牙膏的浓缩液，然后按每1000g牙膏中加入600μg浓缩液的比例加入任何一种市售牙膏原料中混匀，即成防龋牙膏。
实施例4 防龋口香糖的制备
将实施例2制得的P1025多肽混合物冻干粉500mg溶于蒸馏水中，配制成浓度为1pmol的多肽溶液，并将它浓缩50倍制成用于制备防龋口香糖的浓缩液，然后按每1000g口香糖中加入150μg浓缩液的比例加入任何一种市售口香糖原料中混匀，即成防龋口香糖。
实施例5 防龋牛奶的制备
将实施例2制得的P1025多肽混合物冻干粉按3μg加入1000ml牛奶中的比例加入牛奶半成品中搅拌混匀，即成防龋牛奶。