丝状蓝藻水溶性多糖及胞外多糖的提取分离方法 本发明涉及微藻多糖的提取分离，特别涉及丝状蓝藻水溶性多糖及胞外多糖的提取分离方法。
蓝藻或称蓝细菌是自然界分布最广的光合原核生物，可以生活在海水和淡水中，也可以生活在亚气生的潮湿土壤和岩石上，还可以出现在各种非常恶劣的环境中。有些丝状蓝藻长期以来被用作食品来源，如螺旋藻被用作有价值的食品添加剂；在我国，发菜、葛仙米和地木耳等念珠藻是传统的珍奇佳肴，营养丰富，具有良好的食用和药用价值，在《本草纲目》和《本草纲目拾遗》等书上有详细记载。藻类多糖是迄今藻类产品中应用最多的产品且极具应用开发前景，但至今对藻类多糖的研究主要集中在大型海藻，对蓝藻和其它微藻多糖的研究极少，国内对蓝藻多糖的研究几乎仅局限于螺旋藻的多糖。
中国专利文献：1、螺旋藻水溶性多糖的提取方法，分类号：C08B 37/04，申请日：94.05.16，公告日：95.11.22，申请号：94105389，申请人：华南师范大学。该发明是一种螺旋藻水溶性多糖的提取方法，具体是采用碱溶液抽提，用有机酸中和。2、从螺旋藻中提取蛋白质和多糖的方法及其应用，分类号：C07K 1/14，申请日：94.08.24，公告日：95.08.09，申请号：94112454，申请人：沈阳医药工业研究所。该发明涉及从螺旋藻中提取蛋白质和多糖地方法，具体是在5-15℃时浸泡提取5-20小时，重复三次，经进一步提取、沉淀等方法制得蛋白质和多糖。以上二项专利只是针对螺旋藻水溶性多糖而言，未对胞外多糖进行提取分离。
中国非专利文献：1、螺旋藻抗辐射多糖的提纯和分析，庞启深、郭宝江、阮继红，生物化学与生物物理学报，1989.21:445-449。该文献报道了从螺旋藻中提取具有抗辐射活性的水溶性多糖的方法。2、极大螺旋藻多糖的分离、纯化及其抗氧化特性的研究，周志刚、刘志礼、刘雪娴，植物学报，1997,39:77-81。该文献报道螺旋藻多糖具有显著的清除羟自由基的作用。以上2篇文献只是针对螺旋藻的水溶性多糖进行了提取和纯化，未对胞外多糖进行研究。3、蓝细菌多糖及其应用研究概况，黄泽波、刘永定，生物技术通报，1997，第4期：26-32。该文献介绍了蓝细菌(蓝藻)多糖的研究进展并分析了它们潜在的应用价值，但对蓝藻多糖的提取分离方法未进行系统综述。
国外非专利文献：1.Polysaccharides from cyanobacteria.Bertocchi,C.,Navarini,L.,Ces*ro,A.&Anastasio,M.,Carbohydrate Polymers,1990,12:127-153，该文献对蓝细菌(蓝藻)多糖的研究进行了综述，着重阐述了蓝藻多糖的组分，但对蓝藻多糖的提取分离方法未进行阐释。2．Polysaccharides in desert reclamation:compositions of exocellularproteoglycan complexes produced by filamentous blue-green andunicellular green edaphic algae.Flaibani,A.,Olsen,Y.&Painter.T.J.,Carbohydrate Research,1989,190:235-238。该文献对一种念珠藻(和一种单细胞绿藻)分泌的胞外多糖的组分进行了分析。3．Extraction,purification and identification of polysaccharides of Spirulina(Arthrospira)platensis(Cyanophyceae).Tseng,C.T.&Zhao.Y.Algological Studies,1994,75:303-312。该文献针对螺旋藻的水溶性多糖进行了提取和分析。
本发明的目的在于提供一种适用于常见丝状蓝藻水溶性多糖及其分泌到培养基中的胞外多糖的高效通用提取分离技术，为充分利用丝状蓝藻的多糖提供一种方便实用的方法。
为了实现该目的，其主要技术方案是：通过脱色去杂、热水提取、乙醇沉淀、真空干燥等步骤提取水溶性多糖；通过离心抽滤、减压浓缩、透析脱盐、真空干燥等步骤提取胞外多糖；酸性胞外多糖也可在脱细胞培养液中直接用季铵盐沉淀制得；通过脱蛋白、阴离子交换层析、真空干燥等步骤分离纯化水溶性多糖与胞外多糖。
应用本技术方案，对常见的19种丝状蓝藻：普通念珠藻(Nostoc commune,地木耳)、发状念珠藻(N.flagelliforme，发菜)、拟球状念珠藻(N.sphaeroides，葛仙米)、念珠藻(Nostoc sp.)HB856、稻田鱼腥藻(Anabaenaoryzae)HB13、固氮鱼腥藻(A.azotica)HB686、球孢鱼腥藻(A.sphaerica)HB1017、多变鱼腥藻(A.variabilis)HB1058、鱼腥藻(Anabaena sp.)HB1042、鱼腥藻(Anabaeua sp.)HB1105、繁育管链藻(Aulosirafertilissima)、微囊藻(Microcystis spp.)、裂须藻(Schizothrix sp.)、微鞘藻(Microcoleus sp.)、席藻(Phormidium sp.)、单歧藻(Tolypothrix sp.)、伪枝藻Scytonema sp.)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)和极大螺旋藻(S.maxima)等水溶性多糖及胞外多糖进行提取分离试验比较，表明有如下效果：
1、本提取分离方法适用于丝状蓝藻；
2、可同时从丝状蓝藻藻体和培养液中分别提取分离水溶性多糖和胞外多糖，充分利用其资源；
3、酸性胞外多糖可在制得脱细胞培养液后直接用季铵盐沉淀制得；
4、数种念珠藻多糖具有很强的补体激活活性和很高的粘度，可用作免疫增强剂和食品工业中的增稠剂；
5、操作方便，不需要特殊设备，可用于工业化生产。
实施例1．水溶性多糖的提取
(1)脱色去杂 取丝状蓝藻(鲜藻或干藻)若干，粉碎后加80％(v/v)的乙醇溶液浸泡。干藻不易粉碎的，可直接浸泡，待以下第(2)步水浸后再搅碎；浸泡量因蓝藻种类不同而异，浸泡干藻时一般为每克藻样加20-100ml乙醇溶液。
藻样在用80％的乙醇溶液在室温下浸泡过夜后，于50℃搅拌提取2小时，过滤以除去小分子和有色杂质。收集藻样，加上述浸泡量一半体积以上的乙醇溶液再提取1小时。过滤收集藻样，加无水乙醇洗涤数次，并让乙醇自然挥发。
(2)热水提取 上述脱色去杂后的藻样，加蒸馏水在室温下浸泡过夜。加水量因蓝藻种类不同而异，为藻样干重的10-100倍：一般种类加水10-20倍，葛仙米、地木耳等极易吸水的种类则加水50-100倍。
藻样浸透后，在80-100℃下搅拌提取2-3小时，自然冷却至室温，离心(5000-6000g,15-30分钟)，保留上清液。藻渣再加上述用水量一半以上的蒸馏水在同样温度下提取1小时，离心收集上清液，合并二次提取液。过于粘稠的提取物，如葛仙米的提取液，在难以离心时可采用4层纱布趁热过滤等方法来分离提取液与不溶物。
(3)减压浓缩 将上述提取液在40-50℃下减压浓缩至原体积的五到二十分之一。
(4)乙醇沉淀 将上述浓缩液用乙醇进行沉淀，乙醇的终浓度为80％(v/v)。过滤收集沉淀物，用无水乙醇、无水丙酮洗涤数次以进一步脱色去杂。沉淀物经真空干燥制得粗多糖。
实施例2．胞外多糖的制备
(1)脱细胞 离心收集丝状蓝藻后的培养液，经抽滤并过0.45m多孔滤膜，制得脱细胞培养液。
(2)减压浓缩 将上述脱细胞培养液在40-50℃下减压浓缩至原体积的十到二十分之一。
(3)脱盐、沉淀 将上述浓缩液先经透析(分子截流量为3500道尔顿)脱盐、去除小分子杂质，再冷冻干燥制得胞外多糖。或将上述浓缩液直接按实施例1之(4)的方法用乙醇沉淀、反复数次以脱盐去杂，再用无水乙醇、无水丙酮洗涤，真空干燥，制得胞外多糖。
若制备酸性胞外多糖，可采用加少量季铵盐的方法直接将多糖从脱细胞培养液中沉淀出来，再经80％(v/v)乙醇溶液、无水乙醇、无水丙酮洗涤后干燥，从而制得胞外多糖。沉淀胞外多糖时所加的季铵盐有溴代十六烷基三甲铵(CTAB)、十六烷基盐酸吡啶(CPC)等，用量为100-200mg/L，方法一般是将CTAB或CPC等配制成小于10％的溶液后再加入，但也可以直接溶于脱细胞培养液。
实施例3．多糖的分离纯化
(1)去蛋白 如果需要将粗多糖中的蛋白质去掉，可采用Sevag法或蛋白酶解法进行。若采用Sevag法，一般是加入与多糖溶液(1-10％)等体积的氯仿-正丁醇(5∶1,v/v)混合液，充分混匀，离心(1500g,10分钟)，取上层水相。重复进行数次后，加入乙醇(终浓度80％,v/v)沉淀多糖。
采用酶解法时，可分别向多糖溶液加入胃蛋白酶和胰蛋白酶在37±2℃下分别酶解1-2小时。所加酶量因酶活单位和藻种不同而有较大差异，以酶解、透析(MWCO=3500)后多糖样品中蛋白含量降至合乎要求为准(如小于2％)。
(2)阴离子交换层析 将粗多糖或上述去蛋白后的多糖样品加热溶解于蒸馏水(-1-10mg/ml)，过0.45m多孔滤膜后在DEAE-Sepharose等阴离子交换层析柱上进行层析，用蒸馏水、1.0M和2.0M NaCl进行逐步洗脱，用苯酚-硫酸法监测糖量，分部收集洗出物，分别浓缩、透析后冻干，或用乙醇沉淀后真空干燥。所得各部多糖样品中，水洗出物为中性多糖，盐洗出物为酸性多糖。
实施例4．葛仙米、地木耳和发菜等念珠藻天然样品补体激活活性多糖的提取分离及其运动粘度
(1)脱色去杂 取葛仙米、地木耳和发菜风干天然藻样若干，浸泡于80％(v/v)的乙醇溶液，浸泡量为每克藻样40ml乙醇溶液。在室温下浸泡过夜后，于50-C搅拌提取2小时，过滤，收集藻样，加同体积80％的乙醇溶液再提取1小时。过滤收集藻样，加无水乙醇洗涤数次，并让乙醇自然挥发。
(2)热水提取 上述脱色去杂后的藻样，用适量蒸馏水在室温下浸泡过夜。用搅拌器将吸水膨胀后的藻样打散，再加适量蒸馏水(二次加水总体积为每克藻样100毫升)后在100*C下搅拌提取3小时。趁热用4层纱布过滤以分离葛仙米提取液与不溶物；但地木耳和发菜的提取液，在自然冷却至室温后，采用离心(6000g,30分钟)法分离，保留上清液。藻渣再加同体积的蒸馏水在同样温度下提取1小时，纱布过滤(葛仙米)或离心(地木耳、发菜)，合并二次提取液。
(3)乙醇沉淀 将上述提取液在40℃下减压浓缩至原体积的五分之一后，加入乙醇进行沉淀，乙醇的终浓度为80％(v/v)。过滤收集沉淀物，用无水乙醇、无水丙酮洗涤数次，经真空干燥制得粗多糖。这样制得的粗多糖都为絮状物，色泽基本为白色，但葛仙米和地木耳多糖略带微黄色，发菜多糖略带灰色。葛仙米、地木耳和发菜多糖的得率分别为40％、30％和17％。
(4)粗多糖的精制 取上述纱布过滤的葛仙米粗多糖加热溶解于适量蒸馏水，冷却后离心，取上清液，采用上述乙醇沉淀、无水乙醇和无水丙酮洗涤、真空干燥的办法精制。
取三种念珠藻的粗多糖加热溶解于蒸馏水配制成10％的水溶液，采用Sevag法去蛋白，即加入与多糖溶液等体积的氯仿-正丁醇(5∶1,v/v)混合液，充分混匀，离心(1500g,10分钟)，取上层水相。重复进行4次后，加入乙醇(终浓度80％,v/v)沉淀多糖，用无水乙醇、无水丙酮洗涤后真空干燥。
(5)阴离子交换层析将多糖样品加热溶解于蒸馏水(1.5mg/ml)，过0.45m多孔滤膜(Acro 50A)后在DEAE-Sepharose Fast Flow柱(5-40cm,Pharmacia)上进行阴离子交换层析，用蒸馏水、1.0M和2.0M NaCl进行逐步洗脱，用苯酚-硫酸法监测糖量，分部收集洗出物，分别浓缩、透析后冻干。其中，发菜多糖在经该层析柱后用2.0M NaCl进行洗脱时未检测到糖样。
(6)生物活性 经检测，按上述方法制备的多糖(包括粗多糖和分离纯化后的多糖)具有很强的补体激活活性。其中，经阴离子交换层析后，酸性多糖的活性明显高于中性多糖。
(7)运动粘度 上述多糖具有较高的粘度，0.1％的上述各类多糖水溶液在25±0.01℃下的运动粘度：(a)经4层纱布过滤制得的葛仙米粗多糖为4.79厘斯，该多糖经溶解于蒸馏水、离心、乙醇沉淀、干燥后制得的多糖为6.61厘斯，该样品经阴离子交换层析后制得的蒸馏水、1M和2M NaCl洗脱物分别为0.95、141、1.45厘斯；(b)地木耳粗多糖、经阴离子交换层析后制得的蒸馏水、1M和2M NaCl洗脱物分别为4.16、1.76、1.18、1.12厘斯；(c)发菜粗多糖、经阴离子交换层析后制得的蒸馏水和1M NaGl洗脱物分别为3.10、1.20、1.20厘斯。
实施例5．念珠藻胞外聚合物的制备及其运动粘度
(1)培养条件 地木耳和发菜藻种为中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库提供的Nostoc commune FACHB 261、N.flagelliforme FACHB 838。葛仙米为从天然群体中无菌分离出的藻种。培养基为Woods Hole MBL液体培养基(有或无NaNO3)，容积为10升，温度为28*1*C，光强为160mE·m-2·s-1，通加湿的压缩空气，接种量为20ml(光密度为1.0,1=750nm，光径5cm)，共培养18天。
(2)胞外聚合物的制备 离心收获念珠藻后的培养液，经抽滤并过0.45m多孔滤膜(Acro 50A)，制得脱细胞培养液。在40℃下减压浓缩至-500ml后，用Spectra/Por透析袋(MWCO=3500)进行透析，冷冻干燥，制得胞外聚合物。从上述有氮和无氮培养基中分离的胞外聚合物与生物量的比例分别为：葛仙米28％和31％；地木耳66％和15％；发菜22％和20％。其中，经检测，葛仙米的胞外聚合物含糖量较低，但地木耳和发菜胞外聚合物主要为多糖类物质。
(3)运动粘度 在25±0.01℃下，从有氮和无氮培养基中分离的胞外多糖水溶液(0.1％)的运动粘度分别为：葛仙米0.95和0.94厘斯；地木耳3.45和1.77厘斯；发菜1.01和1.08厘斯。