葛仙米、地木耳培养中污染的控制方法 技术领域
本发明涉及微藻生物技术领域，更具体涉及葛仙米、地木耳培养中污染的控制方法。
背景技术
念珠藻是蓝藻门Cyanophyta蓝藻纲Cyanophyceae段殖藻目Hormogonales念珠藻科Nostocaceae的一类分布地域广、生态环境复杂、形态结构多样的藻类类群，其植物体胶状或革状，成熟植物体有球形、叶状、丝状、泡状等多种形状，中空或实心，营漂浮或着生生长。其原植体由许多直径数微米的纤细藻丝集结成肉眼可见的群体，群体形状因“种”而异，如发菜(Nostoc flageliforme Kütz.)、地木耳(Nostoc commune)、葛仙米(Nostoc sphaeroides)在新鲜状态下分别呈头发状、扁平耳状或小球(珠)状，干燥后程度不等地有所缩变，均具有丰富的营养价值，在《本草纲目》、《本草纲目拾遗》、《陕西中草药》、《梧州府志》、《全国中草药汇编》等书籍中已有记载。念珠藻不仅在自然界普遍发生，而且自古以来都是我国民间的传统食物；其中葛仙米，学名：拟球状念珠藻，具有食疗、保健、滋补等功效；同时又具有药性，常食用能清热解毒，凉血明目，促进新陈代谢；葛仙米的天然生产状况已经衰落，需求和生产产量的矛盾不可回避。随着人类活动加剧，近年来，葛仙米的生长地逐渐缩小，产量也不断减少.其天然年产量不足一吨，而且日趋减少，远远满足不了需求，随着近年来的旅游资源开发，过度的采集又带来了生态、环境破坏和自然资源萎缩。然而葛仙米产品在东南亚国际市场很受欢迎，在国内市场难寻其“仙踪”。地木耳，俗称地皮菜、地耳、地衣、地软，营养价值高，是典型的高蛋白、低脂肪、低热值的绿色保健食品；野生地木耳的生长受到自然界干旱少雨的限制，处于自生自灭状态，同时地木耳对大气污染十分敏感，生活环境具有一定的选择性，随着环境污染范围的扩大，其生长区域逐年减少，过去很多生长地木耳的地方都难见其踪迹。近年来，在世界范围内的野生食物开发利用热潮中，地木耳也已进入人们的的菜谱；但由于野生地木耳地资源十分有限，极大地限制了人们对地木耳的食物需求。为了满足人们物质生活水平提高的需要，开展葛仙米、地木耳的人工养殖研究势在必行。
葛仙米、地木耳培养过程中会受到各种污染生物的威胁，主要有杂藻、浮游动物、及蚊子的幼虫，污染生物使产量减少，蚊子的幼虫以念珠藻为食，在收获时很难除去，影响成品的质量；严重时，使培养无法进行。中国专利文献：一种培养葛仙米的方法，分类号：C12N 1/12，申请日：1999.10.22，公开日：2001.05.09，申请号：99120005.5，申请人：中国科学院水生生物研究所，该专利中仅仅提到在葛仙米培养中微生物污染严重时需彻底更换培养液，并对反应器进行灭菌处理，未提出具体的操作方法。中国专利文献：一种培养地木耳的方法，分类号：C12N 1/12，申请号：03119091.X，申请人：中国科学院水生生物研究所，该专利仅仅涉及在地木耳培养中污染严重时需彻底更换培养液，对反应器或培养池灭菌，也未提出地木耳污染控制的具体方法。经检索未见到一种葛仙米、地木耳培养中污染的预防、控制方法被公开或使用。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种葛仙米、地木耳培养中污染的控制方法，该方法简单易行，除去污染生物的效率高，可以将培养池中污染的生物量控制在葛仙米、地木耳总生物量的1％以内，在收获时采用清洗的方法，进一步减少了杂藻、浮游动物的量。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
进行葛仙米、地木耳的人工养殖，污染控制方法的步骤是：1、在用葛仙米和地木耳群体制备藻丝或者藻殖段时整个过程均采用无菌处理；藻丝或藻殖段的培养也在无菌条件下进行，一般每8-20天更换一次培养液，换培养液时在超净工作台中进行，直至葛仙米、地木耳的球形群体直径增大到0.04-0.1毫米。2、当葛仙米、地木耳直径至0.04-0.1毫米时，培养过程可不需要严格的无菌处理，但在不同培养容器中转接或扩大培养规模时，要用水清洗培养容器、培养池内壁，用水洗后，最好用60-95％的乙醇溶液在容器内壁擦洗一遍，或者用0.001％-5％的高锰酸钾擦洗一遍或者浸泡2-6小时。3、对生产用的种藻进行清洗或筛洗：在开放式培养中，培养液会被杂藻、浮游动物等污染，在更换培养液时，藻体表面会附着这些污染物，当藻体直径在0.2毫米以上时，可以利用葛仙米、地木耳在水中的沉降速度较快，杂藻沉降速度慢，浮游动物也集中在上清液中，倒掉上清中的污染；反复倾倒沉降可除去大部分的污染生物；当藻体直径在1毫米以上时，可以用孔径为0.7-1毫米的不锈钢筛对藻体进行筛洗。4、为了避免配制培养液的水中可能带来的各种浮游生物及其卵的污染，用8-16层纱布将水过滤后再使用。5、室外培养中蚊子的幼虫很容易在培养池中繁殖，并在池底以藻为巢，可通入0.5％-20％的二氧化碳30分钟-4小时，液体缺氧而杀死蚊子幼虫；或在培养池底筑一小坑，等蚊子幼虫聚积在小坑后将其除去。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：解决了葛仙米、地木耳人工培养过程污染的控制，可以有效的预防、控制培养池中的污染的量，使培养能顺利进行，保证培养藻体的质量。设备简单，安全性高，操作方便，对藻的生长无不良影响，成本低，能有效的将培养过程中培养液的污染生物量控制在1％以内，葛仙米、地木耳成品的污染生物量控制在0.05％，适合工厂规模化生产中污染的控制。
具体实施方式
人工养殖的葛仙米、地木耳主要为球形，少为哑铃形、椭圆形；由藻丝或藻殖段长成直径为5-7毫米的成品，需要2-3个月时间；将葛仙米、地木耳由藻丝或藻殖段培养为5-7毫米的成品期间，每8-20天更换一次培养液。在葛仙米、地木耳培养中污染的预防控制方法的步骤如下：
1、在制种阶段采用纯培养：制备藻丝或藻殖段时所用的锥形瓶、玻璃匀浆器、涂棒、移液管、培养液、水、培养容器均需在高压蒸汽灭菌15分钟，藻丝的制备在无菌条件下操作进行，需要通气培养时通入无菌气体；葛仙米、地木耳的藻丝或藻殖段需要15-30天才能长成0.05毫米以上的微球体，期间更换培养基时在超净工作台中进行，培养时通入无菌的空气。
在本发明中所涉及到的培养液均为下面的培养液，培养液为：
磷酸氢二钾20-60mg/L、
硫酸镁40-80mg/L、
氯化钙20-40mg/L、
柠檬酸4-8mg/L、
柠檬酸铁铵5-9mg/L、
乙二胺四乙酸二钠盐1-2mg/L、
碳酸钠5-30mg/L、
微量元素0.5-3ml/L、
余者为水；
其中微量元素为每1000毫升含：
硼酸1.5-3g、
氯化锰1-2g、
硫酸锌0.1-0.25g、
镍酸钠0.2-0.4g、
硫酸铜0.02-0.1g、
硝酸钴0.03-0.05g、
余者为水；
2、接种前对培养池、培养容器进行清洗：当葛仙米、地木耳球体直径长到0.04-0.1毫米时，可以在室内或室外采用开放式培养，在室内可用1-10升试剂瓶、玻璃缸等透明容器培养葛仙米、地木耳；室外可采用长0.4-1.2米，宽0.1-0.8米，高0.2-0.5米的方框或表面积为6-1000平方米的跑道式培养池培养。在接种前，用优质地表水或自来水刷洗培养容器或培养池内壁，重复1-3遍；最好先用优质地表水或自来水将培养容器或培养池内壁刷洗一遍；再用60-95％的乙醇溶液或0.1-5％的高锰酸钾溶液刷洗一遍，也可用0.001-0.1％的高锰酸钾溶液浸泡2-6个小时；最后再用水清洗1-3遍。
3、对生产用的种藻进行清洗或筛洗：在开放式培养中，培养液会被杂藻、浮游动物等污染，在更换培养液时，藻体表面会附着这些污染生物；当藻体直径在0.2毫米以上时，葛仙米、地木耳在接种前，可用水对藻体进行清洗，葛仙米、地木耳球形群体在水中沉降速度较快，杂藻、浮游动物沉降速度较慢，通过向葛仙米、地木耳容器注水，静置30秒-4分钟，倒掉上清液，重复2-4次，可以除去70-90％的污染生物。当培养的藻体直径大于1毫米时，也可用孔径大小为0.7-1毫米筛子进行筛洗，对于工厂大规模生产，可用一定孔径的重力斜筛进行清洗，该方法能除去80-95％的污染生物；在开放式培养中，培养液中含有杂藻和轮虫、纤毛类等浮游动物，用上述方式有较好的效果；对于收获的成品球体也可以用上述方法进行清洗。对于清洗葛仙米、地木耳的水可用4-12层纱布过滤后可反复使用。
4、配制培养液的水过滤：可用自来水或二级以上(包括)地表水配制培养液，为了避免水中可能带来的各种污染，用8-16层纱布进行过滤后再使用。
5、杀死或清除浮游动物：室外开放培养易受到蚊子幼虫污染，除去蚊子幼虫，可在更换培养液时，将收获的藻体盛于一长0.5-4米，宽0.5-4米，深0.3-2米的方框内，同时向方框内注入1-5倍藻体重量的水或培养液，通入0.5-20％的二氧化碳30分钟-4小时，可因水或培养液缺氧而杀死蚊子幼虫，然后在将藻体接入培养池中继续培养，也可直接向培养池中通入0.5-20％的二氧化碳而杀死蚊子幼虫；或在培养池底筑一小坑，蚊子幼虫喜欢聚集在培养池中水流较缓的地方，等蚊子幼虫聚积在小坑后将其除去。