魔芋葡甘聚糖硫酸酯抗凝血剂的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种抗凝血剂的制备方法，具体涉及一种魔芋葡甘聚糖硫酸酯抗凝血剂的制备方法。
背景技术
魔芋葡甘聚糖(Konjac Glucomannan，KGM)是从成熟魔芋块茎中提取的一种高分子量水溶性非离子型复合多糖，其主链由D-甘露糖和D-葡萄糖以β-1，4吡喃糖苷键连接，甘露糖与葡萄糖的摩尔比约为1.6∶1，在主链甘露糖的C3位置上存在着以β-1，3糖苷键结合的支链结构，大约每32个糖残基上有3个支链，支链只有几个残基的长度，并且每19个糖残基上有1个乙酰基团。根据来源不同，KGM分子中甘露糖和葡萄糖的摩尔比为1.6~4.2。一般认为，KGM的粘均分子量约为70~80万，光闪射法测得KGM的重均分子量为1.12×108~2.62×106。天然的魔芋葡甘聚糖是由放射状排列的胶束组成，其晶体结构有α性(非晶型)和β型(晶型)两种。X-射线衍射分析表明，魔芋葡甘聚糖粒子显示近似无定型结构，退火的纤维式的KGM显示出伸展的二折螺旋形结构，构象分析表明，其有利的手性为左旋。
魔芋葡甘聚糖地结构示意如下：
硫酸酯化多糖或称多糖硫酸酯是多糖大分子链中单糖分子上的某些羟基被硫酸根所取代而形成的一类多功能生理活性物质，具有良好的血液相容性或抗凝血等生物活性，其来源主要有天然硫酸酯化多糖和人工合成硫酸酯化多糖，魔芋葡甘聚糖有与肝素相近的骨架结构，其单体分子中C2，C3和C6位上的羟基均具有较强的活性，经硫酸酯化后可制成类肝素的物质。因此，从多糖的构效关系可推测魔芋葡甘聚糖硫酸酯(Konjac glucomannansulfates，KGMS)将具有较好的抗凝血活性。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种以魔芋精粉为原料，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作溶剂，在磺化剂氯磺酸的作用下制备魔芋葡甘聚糖硫酸酯抗凝血剂的方法。
本发明的技术方案是：一种魔芋葡甘聚糖硫酸酯抗凝血剂的制备方法，其特征是由下述步骤实现：按魔芋精粉：N，N-二甲基甲酰胺∶氯磺酸质量比为1∶3∶3~1∶10∶10准备魔芋精粉、N，N-二甲基甲酰胺、氯磺酸，向装有N，N-二甲基甲酰胺的容器中加入魔芋精粉，搅拌20~40分钟后，向该容器中滴加氯磺酸，搅拌，在70~95℃下反应2~12小时，得到深褐色混合溶液；向该深褐色混合溶液中加入体积比为深褐色混合溶液的1~3倍的丙酮得到沉淀，将沉淀物溶解于蒸馏水中，用质量百分比浓度为10~30％的NaOH溶液调节pH值至6.5~8.5，透析24~72小时，浓缩，经冷冻干燥即得魔芋葡甘聚糖硫酸酯化产物。
其主要反应历程可描述为：
R＝HorSO3Na
魔芋葡甘聚糖硫酸酯抗凝血剂，其抗凝血活性可用KGMS对血浆的凝血酶原时间(PT)，活化部分凝血活酶时间(APTT)，凝血酶原时间(TT)的影响作为衡量标准。抗凝血活性的测试方法为：APTT检测，取90μL柠檬酸化血浆和10μL的KGMS溶液，37℃预温1分钟，然后加入37℃预温APTT悬浮液100μL，混匀，37℃孵育5min；加入37℃预温0.025M CaCl2溶液100μL，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间。TT检测，取190μL柠檬酸化血浆和10μL的KGMS溶液，37℃预温2分钟，加入37℃预温凝血酶溶液200μL，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间。PT检测，取90μL柠檬酸化血浆和10μL KGMS溶液，37℃孵育2分钟，加入37℃预温凝血活酶200μL，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间，即为PT值。
本发明以魔芋精粉为原料，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作溶剂，在磺化剂氯磺酸的作用下制备魔芋葡甘聚糖硫酸酯(KGMS)。产品魔芋葡甘聚糖硫酸酯具有显著的抗凝血活性，有望开发成新一代类肝素抗凝血剂及抗心血系统疾病药物。同时，与国外相比，国内魔芋资源的开发仍以外销中间产品为主，国内对魔芋的开发特别是深度开发还很不够，因此，为了缩短与国外的差距，开发出科技含量高的魔芋新型系列产品，这不仅可以极大的提高农副产品的附加价值，而且可以发挥资源优势，带来极大的社会经济效益。
【附图说明】
图1为魔芋葡甘聚糖硫酸酯在不同浓度下的APTT图
图2为魔芋葡甘聚糖硫酸酯在不同浓度下的TT值图
图3为魔芋葡甘聚糖及魔芋葡甘聚糖硫酸酯的红外谱图
【具体实施方式】
实施例1
将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶装置于盐水—冰浴中，加入80ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，然后加入魔芋葡甘聚糖(Konjac Glucomannan，KGM)粉末8g，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸20ml，搅拌，使之充分冷却，2h滴加完毕，溶液呈乳白色，迅速将三颈瓶移入水浴中，在70℃恒温搅拌反应2h左右，溶液变成褐色。冷却至室温，用10％NaOH中和后加入100ml丙酮，析出沉淀，离心，收集沉淀，将沉淀溶于水，透析72h，过滤，冷冻干燥，即得到魔芋葡甘聚糖硫酸化产物，记为KGMS-1。
实施例2
将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶装置盐水—冰浴中，加入100mlDMF，然后加入KGM粉末13g，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸75ml，搅拌，使之充分冷却，3.5h滴加完毕，溶液呈乳白色，迅速将三颈瓶移入水浴中，在80℃恒温搅拌4h左右，溶液变成褐色。冷至室温，用10％NaOH中和后加入250ml丙酮，析出沉淀，离心，收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水，透析48h，过滤，冷冻干燥，即得到魔芋葡甘聚糖硫酸化产物，记为KGMS-2。
实施例3
将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶装置于盐水—冰浴中，加入150mlDMF，然后加入KGM粉末15g，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸130ml，搅拌，使之充分冷却，5h滴加完毕，溶液呈乳白色，迅速将三颈瓶移入水浴中，在90℃恒温搅拌反应6h左右，溶液变成褐色。冷却至室温，用10％NaOH中和后加入400ml丙酮，析出沉淀，离心，收集沉淀，将沉淀溶于水，透析72h，过滤，冷冻干燥，即得到魔芋葡甘聚糖硫酸化产物，记为KGMS-3。
图1、图2显示，未经硫酸酯化的魔芋葡甘聚糖几乎没有抗凝血活性，但经硫酸酯化后，表现出显著的抗凝血活性。当样品的浓度分别为17.5、35和70μg/mL时，KGMS-1的APTT值分别为151、173和232s；KGMS-2的APTT值分别为183、216和288s；KGMS-3的APTT值分别为204、253和337s。当样品浓度分别为12.5、25和50μg/mL时，KGMS-1的TT值分别为20、28和30s；KGMS-2的TT值分别为24、33和39s；KGMS-3的TT值分别为27、39和45s。与大多数多糖硫酸酯类似，当KGMS的浓度低于100μg/mL时，其PT值基本上没有什么变化，均在20s左右。
用Nicolet 170-SX型傅立叶变换红外光谱仪，溴化钾压片记录KGM及KGMS的红外光谱图，如图3所示。在3400cm-1和3200cm-1处有强吸收，显示有-OH基团存在，在3040cm-1处有弱吸收，显示有-CH2或CH3基团的C-H键伸缩振动，在1727cm-1及1644cm-1处的一组强吸收峰，显示有C＝O的对称和非对称伸缩振动，在1403cm-1处的一强吸收峰，显示有C-O的伸缩振动，在1238cm-1处的强吸收峰，证明了有-OSO3的S＝O伸缩振动，在935~1044cm-1处的强吸收峰是C-O-C(糖环)的伸缩振动，在808cm-1处的强吸收峰，显示有C-O-S键的伸缩振动，红外光谱表明已形成硫酸酯。
用元素分析仪(MOD-1106，Carlo Erba Strumentazione，Italy)对KGM和KGMS进行组成分析，其结果示于表1。KGMS的平均取代度(DS)按下式计算：
DS=162×Ws32-102×Ws]]>
式中Ws为KGMS中S元素的含量。从表1可看出，当氯磺酸与糖单元的摩尔比增加时，KGMS的取代度(DS)随之增加，DS与氯磺酸的用量有密切的依赖关系，因此，可以很容易的通过控制氯磺酸的用量来控制KGMS的取代度。
用激光光散射-尺寸排除色谱联用装置(SEC-LS)测定KGMS的重均分子量(Mw)。散射光强度采用多角激光光散射仪(DAWN-DSP，Wyatt Technology Co.，Santa Barbara，USA)测定，光源为He-Ne激光。配置P-100泵(Thermo Separation Products)和TSK-GEL G4000HHR柱(7.8mm×300mm)和示差折光检测器(RI-150)，色谱柱温度为25℃，流动相为四氢呋喃，用双光束示差折光指数仪(DRM-1020，Otsuka Electronics Co.)，在25℃和波长为633nm的条件下测定KGMS在四氢呋喃中的折光指数(dn/dc)。用Astra软件进行数据采集和分析，从而确定KGMS的重均分子量Mw及其多分散系数d(d＝Mw/Mn)，其结果示于表2。KGMS的重均分子量随着磺化剂用量的增加而逐渐降低，表明在磺化剂的作用下魔芋葡甘聚糖分子逐渐降解。KGMS的多分散系数(d)较大且随着分子量的降低而减小，表明KGMS的分子量分布较宽。本实验室所制备的3种KGMS的分子量都很接近，可以推测，KGMS表现出的抗凝血活性上的差异主要不是由分子量的大小引起的，而主要是由磺酸基的取代度高低所决定。
表1为取代度与氯磺酸用量关系图及元素分析数据。
表1
Sample Usage of chlorosulfonic S％ C％ H％ DS
acid(g)
Weight(g) Mol ratio
KGM 0 0 0 42.16 7.93 0
KGMS-1 17.45 1 10.06 26.13 4.41 0.83
KGMS-2 34.90 2 14.30 21.47 3.25 1.18
KGMS-3 52.35 3 15.33 29.37 4.19 1.51
表2为魔芋葡甘聚糖的重均分子量与多分散性。
表2
Samples Mw(×105) d
KGMS-1 1.24 2.95
KGMS-2 1.21 2.87
KGMS-3 1.19 2.73