用于制造生臭豆腐的菌群及卤水组合物以及制造生臭豆腐的方法 本申请是1998年12月17日递交的申请号为98125700.3的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明提供一种用于制造生臭豆腐的菌群，用于制备生臭豆腐且适合所述菌群生长的卤水组合物，及使用所述菌群及卤水组合物制造生臭豆腐的方法。
背景技术
臭豆腐是我国特有的传统发酵食品。传统臭豆腐的制造方式为开放式酿造法，将蔬菜、虾仁等材料加盐腌渍，置于自然环境中任其腐败发臭得到臭卤水(臭豆腐的发酵液)后，将豆腐块泡入其中，约发酵4-6小时捞起而成(Su，Y.C.，Traditional fermented foods in Taiwan，In Proceedings of the Oriental Fermented Foods，p.15，Food IndustryResearch and deveopment Institute，Taiwan，Hsiuchu，1980)。
臭豆腐是属一种碱性发酵食品，在发酵期间微生物将蛋白质水解成胺基酸及胜肽，并伴随氨的释出及酸碱值的上升。碱性发酵食品的主要发酵菌种为Bacillus sp.，该属的菌株大多具有分泌胞外蛋白酶的能力，可水解蛋白质而产生胺基酸和胜肽，并于发酵过程中释出氨(Wang，J.和Fung，D.Y.C.，Alkaline-fermented foods：a review withemphasis on pidan fermentation.Crit.Rev.Microbiol.22：101，1996)。
依传统方式制造的臭卤水，发酵作用菌株主要是存在于腌渍原料中，所以发酵风味会因每批原料不同而有所改变，品质无法稳定控制。此外，制造臭卤水时仅将材料进行粗略的切割，材料的组织较不易分解，因此微生物生长缓慢，一般发酵需费时6个多月以上才可完成，且由于采用开放式发酵法，发酵期间所产生的臭味，易引起虫类聚集产卵，卫生安全性极差，且易发生各种病原菌及微菌的污染，有害人体健康。
因而开发出卫生、品质稳定且具良好风味的生臭豆腐地制造方法，是有其必要性及经济价值的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于制造生臭豆腐的菌群，其是由传统臭卤水中，经筛选及鉴定而得到的，可用于制造风味良好且卫生的生臭豆腐。
本发明的另一目的是提供用于制造生臭豆腐且适合所述菌群生长的卤水组合物及其制备方法。
本发明的再一目的是提供一种制造生臭豆腐的方法，其是使用所述的菌群及卤水组合物进行的。该生臭豆腐可通过蒸、煮、油炸及红烧等加工方法制得可食用的臭豆腐。
本发明的目的是提供一种用于制造臭豆腐的菌群，适合该菌群发酵的卤水组合物，以及制造生臭豆腐的方法及由其制得的生臭豆腐。
赖等人曾研究臭豆腐的制造，他们以蛋白质分解能力为依据筛选臭豆腐酿造用微生物(赖敏男(1997)臭豆腐的制造。食品工业9：25)。李淑芬等人由传统臭卤水样品中分离具有蛋白质分解能力的细菌，发现其中主要的菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)及枯草杆菌(Bacillus subtilis)，后两者应为主要的发酵菌种(李淑芬、王吉彬、张平平(1996)，臭豆腐中蛋白质分解细菌的分离与鉴定。食品科学23：1)。
然而以单一菌株接种进行卤水发酵时，结果并不很理想。本发明则是由传统臭卤水中筛选及鉴定出优良臭卤水发酵菌群。
本发明菌群主要包括A2菌组及S3菌组两种。其筛选过程如下：从台湾各地收集臭卤水样品，将具有臭味的臭卤水样品稀释涂抹培养后再进行平板接种，筛选仍具有臭味的菌组而得。经鉴定，A2菌组主要包括杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)及乳酸菌属(Lactobacillus)，S3菌组主要包括杆菌属及肠球菌属。
对上述菌群，利用菌体脂肪酸组成鉴定系统(Miller，L.和Berger，J.Bacteria Identification by Gas Chromatograph of Whole Cell FattyAcids，HP Application Note.288.4l(1985))，依据Microbial ID System(MIS)的标准操作步骤及分析方法，在菌体经收集、皂化、甲基化、萃取及碱洗后，将此脂肪酸甲基酯(FAME)利用惠普公司(Hewlett-Packard)的5890 Series II气相层析仪、3396积分器和7673B自动取样器加以分析。
进一步鉴定出A2菌组主要包括球形杆菌(Bacillus sphaericus)、肠球菌属及乳酸菌属，于1998年12月9日保藏于位于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，保藏编号为CCRC980003；并于1998年12月8日保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 98023。S3菌组主要包括球形杆菌、鸟肠杆菌(Enterococcusavium)、酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)及耐久肠球菌(Enterococcus durans)，于1998年12月9日保藏于位于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，保藏编号为CCRC980004；并于1998年12月8日保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 98024。
本发明还提供用于制造生臭豆腐且适合于本发明菌群生长的卤水组合物，包括一种最适于A2菌组发酵的卤水组合物，及最适于S3菌组发酵的卤水组合物。所述适于A2菌组发酵的卤水组合物的组成为高丽菜或刺苋、竹荀、豆腐、虾子及食盐。而所述适于S3菌组发酵的卤水组合物的组成为高丽菜或刺苋、竹荀、豆腐及食盐，不含虾子。
适于A2菌组发酵的卤水组合物，按照各组分材料的重量公斤数与所添加的水的体积升数的百分比，优选包含高丽菜或刺苋、竹荀、豆腐20-40％(w/v)、虾子2.5-10％(w/v)及食盐。而适于S3菌组发酵的卤水组合物优选包含高丽菜或刺苋、竹荀、豆腐30-50％(w/v)及食盐。
所述适于A2菌组发酵的卤水组合物更优选包含高丽菜或刺苋20-40％(w/v)、竹荀10-30％(w/v)、豆腐30％(w/v)、虾子5％(w/v)及食盐0.5-1.5％(w/v)。而适于S3菌组发酵的卤水组合物更优选包含高丽菜或刺苋20-40％(w/v)、竹荀10-30％(w/v)、豆腐40％(w/v)及食盐0.5-2％(w/v)。
根据本发明，由A2菌组接种于所述适于A2菌组发酵的卤水组合物中发酵而得的臭卤水，可制得较佳风味及整体喜好性的臭豆腐。而由S3菌组接种于所述适于S3菌组发酵的卤水组合物发酵而得的臭卤水，可制得外观、风味、口感及整体喜好性均佳的臭豆腐。然而菌组S3接种于适合A2菌组发酵的卤水组合物中发酵而得的臭卤水，其制得的臭豆腐的品评结果并不好，显示S3菌组不适合发酵含有虾子的卤水培养基。
本发明的用于制备臭豆腐的臭卤水的制备方法，是将本发明菌群经冷冻或冷冻干燥保存的菌体，直接接种或经平板活化培养后再接种，或自臭卤水直接转接至已灭菌的卤水培养基中，以非开放式发酵制造臭卤水。
本发明还提供制备生臭豆腐的方法，是使用本发明菌群及卤水组合物，包括将生豆腐倒入由本发明菌群于本发明卤水组合物中发酵完成的臭卤水中，于室温下浸泡0.5-12小时后而得到生臭豆腐。浸泡时间优选为4-8小时。所得生臭豆腐可再以清水冲洗。本发明的生臭豆腐可通过炸、蒸、煮或红烧等加工步骤制得可食用的臭豆腐。
下述非限制性的实施例用以进一步说明本发明的菌群、用以发酵的卤水及生臭豆腐的制法。
具体实施方式
实施例1
本发明菌群的筛选与保存
由台湾各地收集10个臭卤水样品(如表一)，及自制的臭卤水样品2个。取臭卤水样品10毫升转接至已灭菌的卤水培养基中，于30℃下静置发酵一个月后，由固定的三位操作人员以鼻子嗅闻发酵后的卤水培养基，判断是否有臭味产生。若具有臭味，则重复进行转接，以确定其是否具有再现性。样品B、G及J转接的卤水并没有臭味产生。将发酵后具有臭味的卤水稀释涂抹于TSA培养基上，经30℃好气培养24小时后，将各个稀释倍数的平板上所有的菌体，分别以接种环刮取接种至卤水培养基中，于30℃非开放式发酵一个月后，同样由固定人员以鼻子嗅闻，确定何种稀释倍数的接种仍具有相同的臭味产生能力，以此方式减少菌相，决定最少数量的必需菌相。筛选的结果如表二所示。稀释至103倍的接种后仍有臭味的菌组有E、S及W，稀释至102倍的接种后仍有臭味的菌组有A及F。另外，样品C、D、H及I经稀释涂抹后的平板接种，并不具臭味再现性。将具有臭味再现性的卤水以冷冻保存其中的发酵菌株，并重新编号为A2、E3、F2、S3及W3。将发酵菌组自冷冻保存菌体活化后，接种至卤水培养基进行臭味再现性的试验，结果如表二所示，A2及S3二组菌组自冷冻保存菌体活化后，仍具有臭味再现性。
为了解A2及S3菌组的菌相，将冷冻保存菌体稀释涂抹于TSA培养基，30℃好气培养2天后进行随机挑菌，将所挑选的分离株以菌体脂肪酸组成鉴定系统进行鉴定。发现A2菌组主要是由球形杆菌、肠球菌属及乳酸菌属组成，S3菌组主要是由球形杆菌、鸟肠杆菌、酪黄肠球菌及耐久肠球菌组成。
实施例2
卤水组合物及臭卤水的制造
按照各组分材料的重量公斤数与所添加的水的体积升数的百分比，适于A2菌组发酵的卤水组合物包含高丽菜30％(w/v)、竹荀20％(w/v)、豆腐30％(w/v)、虾子5％(w/v)及食盐1％(w/v)。而适于S3菌组发酵的卤水组合物包含高丽菜30％(w/v)、竹荀20％(w/v)、豆腐40％(w/v)及食盐1％(w/v)。原料经搅拌碎均质后，取200毫升的卤水培养基装入250毫升血清瓶中，以121℃灭菌45分钟；若装液量为800亳升(1升血清瓶)，则以121℃灭菌60分钟。
将卤水发酵菌群在冷冻保存菌体活化后，取75微升的菌液均匀涂抹于TSA(Trypticase Soy Agar(BBL，Maryland))培养基上，于30℃好气培养24小时后，以接种环将平板上的菌体刮取接种至已灭菌的卤水培养基中，于30℃非开放式发酵一个月。
实施例3
生臭豆腐的制造
取60块生豆腐置于干净的塑胶盒中，倒入已发酵完成的臭卤水1600毫升，于室温下浸泡四小时后，以清水冲洗而得到卫生的生臭豆腐。
实施例4
依本发明制得的臭豆腐的品评试验
将依前述各实施例制得的生臭豆腐于4℃冷藏过夜后，取出油炸，控制油炸的初温为150℃。进行嗜好性感官品评：
由50位未经训练的品评员进行卫生臭豆腐的嗜好性感官品评，针对样品的外观、风味、口感及整体喜好性(搭配泡菜食用)等四项嗜好性感官特质，以九分制(1＝极不喜欢，9＝极喜欢)标示喜好程度，样品供应顺序采取随机排列，以三位数乱码标示。将品评结果输入电脑，以SAS统计软件进行变异数分析(ANOVA)。品评结果如表三及表四所示。
表一、臭卤水样品 样品 编号取样地点 pH NaCl％生菌数(cfu/ml) A新竹市光复路王记臭豆腐 5.72 1.89.0×108(好)8.5×108(厌) B 新竹市中正路臭豆腐摊贩 5.34 1.3 1.3×108(好)1.3×108(厌) C台北市通化街臭豆腐摊贩 5.54 1.95.6×107(好)1.1×108(厌) D 台北市广州街独臭之家 7.72 1.4 9.0×107(好) 2.7×108(厌) E 台北市临沂街臭豆腐 5.64 2.9 1.0×109(好) 1.0×109(厌) F 台北市古亭市场 5.20 1.8 1.3×109(好) 1.4×109(压) G 高雄武庙市场 6.12 1.5 1.4×107(好) 2.4×107(厌) S 台北市南门市场 6.08 2.2 1.8×109(好) 1.5×109(厌) W 台北市西门市场 6.85 7.3 3.1×108(好) 6.0×108(厌) H云林大埠乙颖公司 - -- I自制传统卤水(1) - -- J自制传统卤水(2) - --
表二、各卤水样品中筛选所含菌群的臭味再现性结果 样品编号 转接 稀释涂抹接种 (稀释倍数) 甘油管 活化接种 A +* +(102) + B C + D + E + +(103) F + +(102) G S + +(103) + W + +(103) H + I + J
*：+表示有臭味产生
表三、以各菌组在含虾子的卤水组合物中发酵制得的生臭豆腐品评结果 用以发酵的菌 组编号 外观 风味 口感 整体喜好性 A2 6.28a 5.96a 6.14a 6.34a S3 5.56b 5.20b 5.62b 5.42b
ab：表同行中相同字母的平均值间无显著差异
表四，以各菌组在不含虾子的卤水组合物中发酵制得的生臭豆腐品评结果 用以发酵的 菌组编号 外观 风味 口感 整体喜好性 A2 6.30a 5.86ab 6.04a 6.08b S3 6.36a 6.50a 6.28a 6.78a
ab：表同行中相同字母的平均值间无显著差异