药物活性组合物和给药装置 本申请引用了不同的公开文献。这些文献的内容在此声明均并入本发明申请中。
本发明涉及药物活性物质、尤其是抗原物质的组合物，活性物质与一种粘液性的辅料混合，并可用一种构造成喷雾给药器的给药装置这样地施用于鼻粘膜上，以致能达到至今从未有其它方法达到的效果。
特别地，本申请包括一种进行鼻内给药的疫苗，它由下列组成：
(a)流感表面蛋白，它配制成脂性的(病毒体)；
(b)粘液性的辅料细菌源；
(c)特定的喷雾给药器，它这样构造，以可使近100％的喷出物施用到对药效作用有重要意义的鼻粘膜上。
抗原优选是流感-表面糖蛋白，它配成脂性的(所谓的病毒体)。该病毒体与一种粘液性的辅料相混合，后者是细菌源。理想的是，它来自活性的或非活性的毒素，如热变性毒素(Heat Labile Toxin)(HLT)、霍乱毒素(CT)或前霍乱原质体(PCG)(Procholeragenoid)。鼻用喷雾器如此构造，使活性物质可主要地宽域地喷施在鼻粘膜上。基于本发明的剂型可用于不同的医药适应症，如对抗流感地接种或其它感染性疾病，以及用于治疗处理鼻塞、受损鼻粘膜的再造或一般粘液性局部疾病。
不同作者已叙述了脂质体(人造膜)的免疫激活性功能(Gregoriadis，G.：免疫辅剂：用于脂质体的作用，当代免疫学11(1990)89-97)。当抗原耦接到脂质体表面(Glück R，Mischler R，Finrel B，Que JU，ScarpaB，Cryz SJ Jr：在老年人中的病毒性流感疫苗的免疫原性，Lancet344(1994)，160-163)，被包围在脂质体内部(Gregoriadis G，Davis D，Davis A：作为免疫辅料的脂质体：抗原植入研究。疫苗5(1987)145-151)或仅与脂质体混合(De Haan A，Geerligs HJ，Huckshorn JP，VanScharrenburg GJM，Palache AM，Wilschut J：脂质体的粘液性免疫辅料活性：通过采用一种流感病毒亚种疫苗和共服的脂质体对老鼠作内鼻免疫化来诱导系统性IgG和分泌性IgA响应。疫苗13(1995)613-616)时，该免疫激活功能可实现。当这种脂质体用反向膜(transmembranen)和融合基因糖蛋白“刺突化(gespiked)”(例如流感糖蛋白(Glück，R.，Mischler，R.，Brantschen，S.，Just，M.，Althaus，B.，Cryz，S.J.，Jr.：使重构的流感病毒性(IRIV)疫苗传导系统免疫增强化，用于抗肝炎A的免疫化。临床研究期刊90(1992)2491-2495)或仙台糖蛋白(Gould-Fogerite，S.，Mazurkiewicz，J.E.，Bhisitkul，D.，Mannino，R.J.：将生理活性的糖蛋白重组进大脂质体，用作向动物细胞中的运载器。见于C.H.Kim，J.Diwan，H.Tedeschi und J.J.Salerno(Hrsg)，膜生物化学和生物基因学中的进展，Plenum出版公司，纽约(1987)，569页)，将观察到另外的免疫激活作用。
至今为止，这种作用多数是按非肠道用药而描述为的(i.m.，s.c.或i.p.)。但一些作者发现，这些制剂可用常规方法(点施或常规鼻喷雾)成功给药。结果几乎唯一地取决于采用实验体、多数为老鼠的实验，与人类相比，它们相对于其体重有很大的鼻粘膜。向它们施用的抗原量如此之高，以致只是出于经济上的及产品安全性的原因它们几乎不用在人类身上。还表明，尽管是脂质制剂中采用理智的抗原(流感)剂量且作正确的鼻施用，也不可能获得满意的效果。
其它作者因此研究了一种有效的可经鼻施用的疫苗的开发，其中代替脂质制剂的是，抗原与一种粘液性的辅料细菌源混合。其中采用特别是HLT、CT或非毒性的HLT或CT衍生物(Elson CO，Ealding W：用霍乱毒素在老鼠身上作粘液性刺激后产生的系统性和粘液性免疫性。免疫学杂志132(1984)2736-2741)。
文献中的结果表明了在经鼻施用后事实上很有前景的作用效果，这首先在供试动物身上表现出来。但是，一些少量的在人类身上的临床研究证实了一定的效果(Tamura S-J，Ishihira K，Miyata K，Aizawa C，Kurata T：用霍乱毒素B亚种和微量的海参毒素来提高对流感疫苗的响应的机理。疫苗13(1995)339-341)。但是待采用的抗原量和辅料量很高，这再次引起对产品安全性和商业化可能性的关注。
至今所述的、用于开发一种可经鼻应用的、预防性或治疗性活性疫苗的研究的其它缺点是至今采用的不令人满意的给药器系统。
至今有以单-、双-和多剂量给药器形式存在的鼻用喷雾器。借助施加色料(甲基蓝)和鼻内诊镜检查的、对至今采用的鼻用喷雾器的详细研究和检测已经证实，待喷洒的物质(疫苗、药物溶液)只有至多25％到达甲介状体的、与粘液有关的免疫系统的粘膜上。
与粘膜液有关的免疫系统的粘膜存在于鼻道中，在甲介状体(鼻瓣鳃体)范围中的鼻的侧壁上，例如图1所示的人类甲介状体的狍子甲介状体，用现今采用的鼻用喷雾器，由于显著的损失在鼻前庭(鼻前庭)(见图2)中及在鼻中隔上，只有不够量的药物活性物质到达主鼻道中。这种鼻构造用免疫学上非活性的扁平上皮和皮脂腺包覆(Walter Becker，Hans HeinzNaumann，Carl Rudolf Pfaltz：颈-鼻-耳-治疗学，Thieme出版社，斯图加特，纽约，1992)。
至今的鼻用给药器-它将足够剂量喷洒到呼吸道粘膜上(特异和非特异性防御的组织)-存在不足的原因是多样的：
(1)由于不足够的解剖知识，喷雾给药时的喷流主段被引导到一个不正确的方向上。因此，几乎没有药物活性物质到达主鼻道。喷出的流体部分地经过上唇向下流动。
(2)在鼻子部分的喷雾物料的直径并不适应解剖学关系。内鼻孔是天然地缝隙状的并具有喷管的功能(见图2)。通常宽的鼻药杆(Nasenstücke)并不压抑这一解剖学上的窄体。在内腔鼻根(Lumen Nasi)之前喷雾时，喷雾柱中仅有相应于内腔鼻根的宽区的一部分到达主鼻孔。
(3)最佳喷雾角至今仍未从科学上予以彻底研究。对于常规的喷雾给药器而言，对保持正常状态的头部，该角度在相对于水平位置相对于或人体纵轴的垂直方向的30°至80°之间任意改变。因此显著量的损失，即直至施用体积的90％的损失就是显然的了。我们的系统研究已经表明，最佳喷雾角为50-80℃。
(4)常规的鼻用喷雾器具有一个太短的鼻药杆。由手指轴环到喷雾器开口的距离太短。用现今的喷雾器，仅用一次动作不能成功到达内部鼻孔。喷雾器的鼻药杆应该至少0.7厘米长，特别优选有1-1.5cm长。
因此本发明的一个目的是，提供一种改进了的药理活性物质的组合物以及一个改进了的给药装置，尤其是用于预防和治疗感染疾病。这些目的将通过权利要求中规定的技术解决方案而达到。下列令人惊异的共激励效应的组合形式用于取得最佳预防和治疗作用，即由脂质体与一种粘液性辅料混合，并用一种新的给药装置或一种新的鼻用喷雾器施用。
相应地，本发明复合体由以下部分组成：
(a)一种活性物质(抗原)；
(b)一种称量出的、由脂质体和粘液性辅料组成的混合物；和
(c)一种新的药用仪器，即一种特定的给药装置或鼻用喷雾器。
本发明特别涉及一种鼻内施用的疫苗，包括：
(a)流感表面蛋白，它配制成脂质的(病毒体)；
(b)粘液辅料细菌源；和
(c)特定的喷雾给药器，它这样构造，以至几乎100％的喷雾量宽域地施加在对药效重要的鼻粘膜上。
活性物质为抗原、尤其是流感糖蛋白，它由于其反向膜的区域而易于植入人工膜(脂质体)中。还可能的是，其它抗原单独地或与流感抗原结合而耦合到脂质体的表面上。根据抗原的化学性质，该耦联自动地发生或借助一种化学交联分子而发生，化学交联分子如早先已叙及的那些(Martin FJ，Papahadiopoulos D：Irreversible coupling ofimmunoglobulin fragments to preformed vesicles.生物化学杂志257(1982)286-288)。它也可为一种DNS-质体或RNS-质体，它可为抗原编码并包括在脂质体中。
在本发明范围内，概念“抗原”既包括完整的分子，也可为该分子的一个片断，它有抗原的性质和/或可用于免疫化。此外，概念“抗原”包括和/或分子片断，它们是刺激免疫的。
在本发明疫苗中采用的流感表面蛋白优选包括Hmagglutinin(HA)。此外，该流感表面蛋白可包括与神经氨酸甙酶化合/或组合的Hmagglutinin(HA)。
在一个特别的实施形式中，本发明涉及一种疫苗，它含有其它抗原。特别地，其它的抗原可已经结合在病毒体的表面上。
在另一个优选的实施方案中，涉及按本发明的疫苗，它除了含有由流感表面蛋白组成的抗原外，还含有其它抗原，优选来自致病组织的那些。在此，该致病组织可为一种病毒、一种细菌、一种真菌或一种寄生物。该组织包括不同的疾病病原体，例如为肝炎A-病毒，肝炎B-病毒，呼吸道合胞体-病毒(肺病毒)，副流感病毒，腮腺炎病毒，Mabilli病毒，HIV，白喉细菌(白喉棒状杆菌)，破伤风杆菌，肺炎球菌，流感嗜血杆菌，大肝杆菌，白色念珠菌，曲霉属，毛滴虫属，锥虫属，利什曼虫属，鼠弓形体，恶性疟原虫，间日疟原虫，卵形疟原虫，三日疟原虫，吸虫属和线虫属。特别地，吸虫属包括埃及血吸虫，S.mansoni，S.Japoniaum，线虫属包括Tricharis trichiura，Ascaris lumbricoides和Trichinellaspiralis。
此外，本发明包括一种疫苗，它是一种流感疫苗。特别地，本发明包括一种疫苗，它可用于预防和/或治疗普通的感染/感染性疾病。此外，该疫苗用于预防和/或治疗流感类疾病，用于预防和/或治疗鼻塞，用于治疗鼻粘膜的破损。此外，本发明优选地包括疫苗，其中每个剂量(100μl)含Hmagglutinin的含量在1-30μg之间，优选在3-10μg，最优选为3.75μg。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种疫苗，其中的粘液辅料为一种活性的毒素，一种无活的毒素和/或一种无毒的毒素。该粘液辅料特别地优选包括热变性毒素(HTL)，霍乱毒素(CT)和/或前霍乱原质体(PCG)。在一个另外优选的实施方案中，该粘液辅料是(埃氏)大肠杆菌的热变性毒素(HLT)。在另一个优选的实施方案中，毒素可以是灭活的。该灭活化可通过重组技术来实现。
在另一个实施方案中，本发明包括一种疫苗，它含有热变性毒素(HLT)和/或霍乱毒素(CT)，其比例为1∶2至20∶1，较好为1∶1至1∶10，最好为7.5∶1。
上述的概念“称量出的、由脂质体和粘液性辅料”一方面涉及抗原和磷脂及粘液辅料的正确比例，它对提供满意的效果是重要的。临床研究已表明以下事实：磷脂(例如磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺、中性的、阴离子的或阳离子的磷脂)与流感抗原的理想比例为1∶1-20∶1。最理想的为3∶1。流感抗原与活性粘液辅料(毒素)HLT或CT的比例为1∶2至20∶1，优选为7.5∶1。
如上面提到的那样，流感抗原与非活性的粘液辅料(无活性的毒素)PCG或HLT和CT的非毒性衍生物的比例在3∶1-1∶20之间，理想的为1∶2。
在用于测量刺激免疫的粘液性作用的体内试验中已令人惊异地表明，辅药脂质体和粘液性辅料的混合并不是产生一种作用效果的加和，而是使药效作用提高到至少5倍。
概念“新的药用仪器”指喷雾给药器，它特别适用于鼻内免疫(接种疫苗)。当给药情况差或给药不够时，则一起提供一种粘液性有效物质是不够的。
新仪器的特征在于，它充分考虑了鼻子的解剖学状况：
(1)从手指轴环到喷头的距离优选为至少4.0cm。
(2)其鼻药杆的前部由一种基本上呈园环状的突出体构成，它例如至少为5mm长和直径至多为5mm。
(3)在本发明中所述的给药装置的喷雾角优选为与水平线呈50°-70°。
(4)给药装置或喷雾给药器的主体方向的轴优选通过一种特定的轴环来确定：该轴环是优选地可插在给药装置的鼻药杆前部上的且如此构造，它在鼻用喷雾给药时可支承在上嘴唇上，以便使喷雾方向基本上朝向鼻孔的侧壁上。
这样一种支承在上唇上的轴环构造是优选的，因此上唇相对地靠近鼻子，且其距离足够大，以便形成一个进行有利地输药的有效操纵杆。此外，敏感的唇部触摸式传感器使得使用者在不用在镜子前观照就能检查轴环是否正确放置(中心地或平行地)。除此之外，该轴环也可构造成支持在其它的本体部分或头部的形式。
该细小的鼻药杆的最小长度优选为0.5cm，更好为1cm，而后面的较粗的鼻药杆优选最少长1cm，为2cm更好。从脊部的手指表面到喷雾尖头的距离应为至少2cm，优选2.5-3cm，或者从手指台阶(轴环)到喷雾尖头的距离应该至少为3cm，优选为4-5cm。当头部保持正常的垂直位置时，喷雾器的喷雾角应优选为与水平线保持50°-70°。
喷出雾液的主体部分应达到中间到下部鼻muschel部位。即，它应该达到中部鼻道区。这一般要求给药器设于几乎水平方向。一个这样的方向，如本发明中所述，要通过安上一种特定的给药器-轴环来设定。同样可能的是，将该轴环和给药器构成一体的或集成在一起的。在这种情况下，固定装置/连接装置已与给药器牢固地连接或与它构成一体的。
在一个优选的实施方案中，喷雾给药器是一种仪器，其带喷头的鼻药杆优选最多5mm粗和至少5mm长，其手指轴环至喷头尖头之间的距离为3cm，且它借助一个可安装的轴环这样使得它可插入鼻孔，以使鼻用喷雾器的主体段与水平方向呈约15-20°的角。
在另一个优选的实施方案中，抗原为一种流感表面抗原的混合物，它存在于脂质体的表面上。该物质可与其它致病微生物的抗原结合。如上面已提到的那样，本发明的疫苗因此也可含有其它抗原，优选其它致病有机体的抗原。
在另一个实施方案中，前述的方法用于预防感染性疾病，用于治疗鼻塞和不同的鼻粘膜障碍。
下面参照附图示例地叙述本发明的优选实施方案，其中：
图1是人类甲介状体与狍子甲介状体的对比示意图。
图2是内部鼻孔构造的解剖图示；
图3是按本发明给药装置的一个优选实施方案的原理性构造的图示；
图4是有效施药时正确的喷雾角的示意；
图5是一种细胞学图示：不同的细胞群落的定量化，这些细胞群落通过个体(每组20个)的鼻腔涂抹技术、按三类不同的鼻内接种后至多29天而得到的。与B和C组明显较少的增加相对照(P＜0.005)，可观察到A组中作为局部的免疫应答标志的中心细胞(centroblasten)显著增加；
图6是按本发明的不带轴环给药装置的一个优选实施方案；
图7a和7b是用于图6所示本发明给药装置的轴环的优选实施方案的两个视图。
实施例1
用HLT作为另加的粘液性辅料来制备
一种粘液性病毒体的流感病毒疫苗
流感病毒体疫苗的制备见叙于glück R，Wegmann A：流感抗原的脂质性表达；见叙于Nicholson KG，Webster RG，Hay AJ，Hrsg.，流感教科书(1998)，400-409页，伦敦：Blackwell；不久，制备包括流感病毒的：主干H1N1 A/新加坡/6/86，H3N2 A/武汉/359/95和B/北京/184/93-它们在已孵化过的鸡蛋(Huhnereiern)中培养一将由位于英国伦敦的生物学标准和控制国家研究院提供。完好的病毒体由绒膜尿囊膜-液体通过区域离心法而分离出来且用β-丙内酯使之失活。提纯了的病毒体放入一个缓冲物中，它含有于PBS-NaCl中的0.1M的八亚乙二醇单(N-十二烷基)醚(OEG)(Nikko Chemicals，Japan)。将它于21℃培养20分钟，以便尽可能地完全破坏掉病毒成分。
为了萃取Hmagglutinin(HA)和神经氨酸甙酶，将混合物于100000xg离心分离60分钟。含有HA、NA和病毒性磷脂(PL)的上清液将用于制备不同的鼻内疫苗制剂。还加入另外的磷脂(磷脂酰胆碱[Lipoid，德国)并使之溶解。该病毒体在通过色谱法除去OEG-Detergens的过程中自发地生成。向一个粘液性疫苗剂量(100μl)中-其中含有来自三种流感病毒主干中每一种的3.75μg HA(如由WHO推荐的那样)，和35μg卵磷脂-加入0.5μg大肠杆菌的热变性毒素(HLT)，大肠杆菌来自增生性主干大肠杆菌HE22VK(Vogel FR，Powell MF：疫苗辅料和辅剂概要。疫苗设计：亚基和辅料途径(M.F.Powell，M.J.Newmann，Hrsg.)Plenum出版社，纽约(1995)141页)，它用作为粘液性辅料。
实施例2
该大肠杆菌细胞在一个自由式离心机(Westfalia AG)中沉积且悬浮在磷酸盐缓冲的生理盐水中(PBS，6.06g/LNa2HPO4，1.46g/L KH2PO4 2.4g/LNaCl pH7.4)。
细胞内热稳定的毒素(HLT)的释去通过在一个球磨中(例如Dyuna-Mill，W.Bachofen AG)或在一个法式挤压机(French-Press)中进行匀浆而实现。例如：10L细胞悬浮体以33ml/分钟的流率泵送通过球磨。该球磨装有500ml玻璃珠，以3000/分钟的速度旋转，且其缝隙开口为0.05mm。
在均浆溶液中对固态的细胞成分的分离借助切线式过滤法实现。例如：10升细胞-溶解产物于一个Prostak系统中(Millipore AG)、在使用一个孔径为0.2μ的过滤器的情况下浓缩至约4升。此后用24升PBS作后冲洗。渗透物通过一种0.2μ灭菌过滤器(例如Gelman Supor DCF，Pall)过滤。
借助亲合色谱法由渗透物中分离出HLT。作为固定相，采用固定化的半乳糖(例如来自Pierce的半乳糖凝胶)或固定化的乳糖(例如来自Pharmacia的乳糖凝胶)。移动相由PBS(缓冲物A)和在半浓缩了的PBS中的5％(g/v)乳糖(缓冲物B)组成。例如：无菌过滤了的细胞溶解产物将加到用缓冲物A预调定的柱子上，该柱子此后用缓冲物A冲洗。直至在280nm处的UV-吸收达到基线。此后用缓冲物B将HLT由柱子上洗脱出来。
实施例3
一种粘液性病毒体流感疫苗的制备，使
用PCG作为另外的粘液性辅料
在实施例1中叙述了一种流感病毒体疫苗的制备。向一个粘液性疫苗剂量中-它含有：三种流感疫苗主干的每一种有3.75μg HA(如由WHO推荐的那样)和35μg卵磷脂-加入6μg前霍乱原(Procholeragenoid)作为粘液性辅料，该前霍乱原通过提纯了的CT的加热制得，而该CT又得自V.霍乱(Inaba 569B)(Pierce NF，Cray WC，Sacci JB，Craig JP，Germanier R，Fürer E：前霍乱原：一种用于口腔免疫化的安全和有效抗原，以对付实验性霍乱。Inf.Immünity 40，3(1983)1112-1118)。
实施例4
一种粘液性肝炎-B(HBs-)疫苗的制备
将磷脂酰基乙醇胺(R.Berchtold，生物化学实验室，Bern，瑞士)溶于甲醇中，再加入0.1％(v/v)三乙胺。该溶液然后与γ-马来酰亚胺基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)混合(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)(比例磷脂酰乙醇胺：GMBS＝2∶1)，GMBS事先溶解在二甲亚砜中。在室温下温育约15分钟后，该溶液剂在真空下在一个Speedvac-离心机中蒸发1小时。重组体HBs-颗粒将按已知的方式于CHO-细胞谱系中制备并提纯。
为了得到带有半胱胺酸残基的HBs颗粒，将该粒用40mMol/升DL-二硫苏糖醇(DTT)在室温下处理5分钟。使用一种Sephadex-G10-柱(Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsula，瑞典)除去该DTT，且加入八亚乙二醇(Fluka Chemicals，瑞士)(CEG)至终浓度为100mMol/升。该蒸发了的磷脂酰基乙醇胺-GMBS)然后与该HBs-溶液混合1小时(HBs∶GMBS之比例为1∶2)，未结合的GMBS然后通过半胱胺酸束缚。该反应借助薄层色谱法监测。
将32 mg磷脂酰胆碱(Lipoid GmbH，路德维希港，德国)和6mg磷脂酰乙醇胺加到事先交联了的磷脂酰乙醇胺-GMBS-HBs中，将该混合物溶解于总体积为2.66ml的PBS中，它含100mMOEG(PBS-OEG)中。
流感A/新加坡-Hmagglutinin将按前叙于实施例1中的方式提纯。一种含4mg Hmagglutinin的溶液将在100000下离心30分钟，而沉降物溶解于1.33ml PBS-OEG中。
混合该磷脂和Hmagglutinin溶液，并用超声处理1分钟。该混合物然后在100000g下离心1小时，并无菌过滤上清液(0.22μm)。
在使用BioRad-SM-Bio-Beads的情况下按实施例1所述，然后通过除去Detergen而除去带有吸收的HBs的病毒体。一个含50μg HBs-抗原/ml的原液将加入按实施例2的10μg/ml HLT，并按实施例6所述装入喷雾给药器中。
实施例5
试管试验以检测粘液性辅料的活性
粘液性辅料的生物学活性将借助按实施例1的流感病毒体、HLT、PCG、一种病毒体和HLT的混合物和一种按实施例2的由病毒体和PCG组成的混合物来测定。后面的溶液将加入到Y-1-肾上腺细胞ATCC：CCL79(Y-1-肾上腺肿瘤，老鼠类甾醇分泌物)于微型培养体中，按Sack DA和SackRB(Sack DA和Sack RB：采用Y-1肾上腺细胞于微型培养体中进行肠毒素原大肠埃希杆菌测试。Infect，Imun.11(1974)334-336)：(a)HLT(5μg/ml)，(b)PCG(60μg/ml)，(c)流感病毒体和HLT：3种细胞干(H1N1，H3N2，B)各37μg/ml流感Hamagglutinin，100μg/ml磷脂酰胆碱和5μg/ml及(d)流感病毒体和PCG：三种细胞干各37μg/ml流感Hamagglutinin，100μg/ml磷脂酰胆碱和60mg/ml PCG。
后面的辅料活性(以单元位计)如下测定：
(a)15单位，(b)6单位，(c)80单位，(d)36单位。最高的生物辅料活性将用由病毒体和HLT或病毒体和PCG组成的混合物进行检测。辅料作用将借助细胞毒性参数确定。
实施例6
不同的喷雾给药器的临床评价
按本发明的给药装置在其基础构造部分基本上与常规的喷雾给药装置器是可比的，但它特别适应于解剖学构造，以对任意一种，特别是此处描述的药物活性物质能特别好地作经鼻给药。
按本发明的给药装置2的一个特别优选的实施方案示于图3和图6中。在图3中示出的按本发明给药装置(喷雾给药器)2的一个侧视图中，主要的部件是易识别的。给药装置2主要具有一个装有一种(未示出)药物活性物质的容器4和一个喷雾-或泵压机械装置6。泵压机械装置6用一种结合段8与容器4液密地结合。用按本发明的给药装置2的泵动和喷雾借助常规方式、并通过操作手指轴环10而实现。在容器4中存在的药物活性物质将通过一个沿泵压机械装置延伸的开口12提供给出口开口14。
按本发明的给药装置2本身不同于、特别是由于鼻药杆的结构性构造而不同于已知的喷雾给药器，在有效地给出药物活性物质时，鼻药杆16发挥了重要作用。鼻药杆16优选是与泵压机械装置6和手指轴环10整体地构造在一起。鼻药杆16优选与泵压机械装置6和手指轴环10构成一个整体。该鼻药杆16优选分为两段18和20，其中鼻药杆16上，在手指轴环一方设置的段18比与出口开口14相邻设置的段20的直径要大些。两段16和20的过渡区构成一个挡板22，它用作-按本发明的一个优选的实施方案-在鼻药杆16的段20上可固定的轴环24，以支承在使用者的上唇上。
在邻近于出口开口14设置的、鼻药杆16的段20优选构成基本上园筒形状，并其直径d20最大为5mm，优选约2-4mm。鼻药杆16的前段20的长度l20优选至少为5mm，优选最少为10mm，特别优选为10-20m。轴环24是可穿过鼻药杆16段20、优选从出口开口14处可移开的，并借助一个旋转固定装置旋转固定地把持在给药装置2上。旋转固定装置可以例如有多边形体的外形，例如具有椭园形的横截面，这是在鼻药杆16的前面段20和一个相应的、在轴环24上留出的空间26来实现的。
按照本发明给药器2的另一个实施方案，突入一个患者的鼻子中的喷雾给药器突起段也可构造在轴环24上。这样一种实施方案在图7b中示例示出。如在图7b中所示，在轴环24上已构造了一个基本上为管状的突出段28，它可支立在鼻药杆16的、与出口开口14相邻设置的段20上。在这种情况下，管状突出段28的尺寸优选基本上相应于前述实施方案中的尺寸(d20和l20)。
鼻药杆16的段18有利地具有的长度l18为至少10mm，优选约20mm。两个段18和20的尺寸将这样选择，使得使用者的背侧手指表面和喷雾尖头或出口开口14之间的距离至少为2cm，有利地为2.5-3cm。当轴环24至喷雾尖头14之间的距离为至少3cm或有利地为4-5cm时，这尤其是好的。
通过具有这些尺寸的按本发明给药装置2，药物活性物质基本上被直接准确地喷入主鼻孔或内鼻孔中，以可以达到比已知系统显著更高的有效性。
按本发明的给药装置2有利地安排了轴环24，以便对较适合的尺寸而言可补充调节最佳喷雾角α。然而轴环24也可与前述喷雾给药器2无关地装在常规给药装置上，以便使用该常规喷雾给药器、基于该精确可调的喷雾角α，可以获得显著改善的效果。
或者通过选择鼻药杆16的尺寸，或者通过适宜的轴环24来调节最佳的喷雾角α，可获得改进的效果。优选的是将新的给药装置2与前述的尺寸和为了调节最佳喷雾角α的设计的轴环24组合起来，以便达到最好的处理结果。
如前面简短解释的那样，轴环24借助管状段28穿过鼻药杆16的段20移动。在安装了的状态下，轴环24优选与给药装置旋转固定地结合。例如，旋转固定方式可通过一个在至少一个侧面打平的园形外形轮廓在鼻药杆16上实现，轴环24可借助一个相应构型的开口与该轮廓旋转固定地安装。轴环24具有一个支承段30，它可座落在使用者的上唇上，以便与在患者鼻孔中存在的鼻药杆16的段20共同限定出喷雾角α。最佳喷雾角α优选为50°至70°。
轴环24的支承段30弯成一种与上唇形状易于匹配的形状，以便提供最佳的安放-和支承面。轴环24可由任一种适宜的材料制造，优选用可注铸的人造材料制成。
为了评价效果，试验了不同的给药装置。为此，1％甲基蓝溶液装入5种不同的鼻用给药器中：
(a)一种按本发明的、带定向轴环的喷雾给药器，该轴环固定喷雾出的液体的方向；
(b)一种不带定向轴环的按本发明喷雾给药器；
(c)一种常规的市售喷雾给药器，它没有长2cm、直径4mm、喷雾角为50°的细长的鼻药杆；
(d)一种按本发明的喷雾给药器，但它具有50°的喷雾角；和最后
(e)一种按本发明的喷雾给药器，但它带手指轴环，它离喷头3cm。
总体的喷雾给药器称为所谓的双剂量给药器。每一喷雾给药器用5个受试对象在医生看护下检测。受试对象将每一剂量的甲基蓝溶液喷入适宜的右或左鼻孔。借助鼻内视镜照亮粘膜-甲介状体并进行照相。在甲介状体上蓝色强度和蓝色着色的面将借助1-4的标度来评价。评价给出下列结果(几何平均)：
组(a)：19点，组(b)：16点，组(c)：7点，组(d)：9点，组(e)：12点。
仅在组(a)中，喷雾液体几乎全部地喷到鼻粘膜上。同样在组(b)中，喷出物的较大部分喷到了粘膜上。在其余组中，喷出物的重要部分喷到了鼻前庭中，在那里，待施用的喷雾液不产生药效。
实施例7
带和不带HLT的鼻内病毒体的流感疫苗的临床效果的比较，它们在一种本发明已叙及的新型喷雾仪器中使用，取得人们的自愿后与非经肠的市售流感疫苗比较。
开放的随机化临床研究在与Helsinki宣言的原则和与当地的法律和关于临床研究的规程完全一致的情况下进行。根据Luzern州伦理委员会对协议书的批准和报端士联邦健康管理当局备案，有80个健康的志愿者(18-64岁)提供了他们的书面表达的参加试验的意愿。当他们在进行免疫化的时间点上标记为急性或慢性疾病病人或当用免疫抑制药剂或已知的免疫兴奋剂进行同时处理时，志愿者将被隔离。
鼻内疫苗制剂对三组中的每一组将用20个志愿者给药(表1)。组A和B于1天中于每个鼻孔内得到制剂A或B2个剂量，且在1周后得到2个剂量，组C在1天内得到双倍增浓的制剂A的2个剂量。组D用非经肠制剂作三角肌肌内接种。血-和唾液取样(Omnisal，GB)将在第一次种疫苗之前和第一次免疫化之后一个月(29±2天)进行。由于技术性的问题，仅能评价首先47个人的唾液试样。鼻孔的排放细胞学检查在免疫化前和之后第4，8天和1个月后进行。
对血样和唾液样进行编号，以便于分析。
对HA-疫苗成分的血清免疫应答将通过标准测试法，使用4个相应抗原的Hmagglutinin单位而测定。血清在试验前30分钟在56℃处理。滴度值是以血清的最高稀释度的倒数值表示的，该稀释度能完全阻止Hmagglutination。滴度≥1∶40被认为是有保护作用的。
总的-和流感特异性的IgA-抗体将借助已知的ELISA-方法测定(Tamura SI，Ito Y，Asanuma H等人：针对流感病毒感染的交叉保护，它是由三价灭活的疫苗鼻内用霍乱毒素B亚单位接种提供的。免疫学杂志149(1992)981-987)。病毒特异的IgA-值以每μg的总体-IgA-浓度的特IgA的ELISA-单位表示。
鼻上皮细胞唯一地由在每个人身上两个鼻孔的上颌鼻甲(胚)上用同类的小型尼龙刷采集，该刷是用于支气管镜检查时作细胞病理学研究的(Glück U，Gebbers，J-O，吸烟者的鼻细胞病理学：一种空气污染的可能的生物标记？Am.J.Rhinol.10(1996)55-57)。取样通过同一研究者(U.G.)在鼻镜检查法监控下用一种能旋转和平移运动的器械、沿着下部鼻甲(胚)突出体(Turbinatanheftung)进行。细胞将转移到一个玻璃的载玻片上并立即固定到一种由200ml乙醇+100ml丙酮+6滴三氯乙酸的溶液中。
帕帕尼科拉乌法着色的载玻片将通过病理学研究的、在Luzern州立医院，细胞病理学研究机构中，使用的载玻片构成，并未记载免疫化状态。
闪光细胞、杯状细胞、淋巴细胞、Centroblasten、中性白细胞、嗜曙红细胞和Schuppen上皮细胞的平均细胞数将在每个载玻片的25个代表性区域内以100x来测定。
基线-和后免疫化滴度值之间的显著性将通过Paired-T试验法来测定。4个免疫化试验-它用于在研究组中引起抗-HA-保护抗体-的区别将通过X2测定。
所有在临床研究中观察到的有缺陷的结果必须记录下来。一种不足的结果以受试者的基线(免疫化前)状态的不利变化来定义的，不管该结果是否与免疫化相关联地出现。不利的结果(局部的或系统的反应)-它在免疫化后出现-将由临床者以一种特定的用于不利结果的报告表格来记载下来。不利结果的基线比率将在免疫化前测定。
平均年龄40岁和可比社会地位的80个人将征召来用于研究。参加者的27.5％为女性。所有3个鼻用免疫化制剂及非经肠疫苗将能很好地承受。在三组鼻疫苗物质之间没有出现显著的诊断学区别，有三种制剂易于承受。在单个情况下，后面出现的可能的伴随反应报道有：发烧、疲乏、恶心、鼻炎、鼻塞和鼻咽炎同样，非经肠的病毒体疫苗也能很好地承受。
血清学的免疫应答示于表2中。滴度的显著上升在组A(以7天的间距作2次鼻疫苗接种)、组C(一次鼻疫苗接种，双份剂量)及组D(针对3种病毒株非经肠疫苗接种)观察到了。最高的抗体滴度值(GMT)的几何平均值在组A和D中发现。组D具有针对HIN1-株的最高GMT值(P≤0.05)。在H3N2-株的情况下，在组A和D之间没有显著的区别。
这些组比组B和C反应得显著地更好。对于B-株而言，在组A、C和D中没有显著的区别。但它们比组B显出了明显更高的滴度。血清转化率最高值出现在组A和D中。通常它们显著高于组B和C中的转化率，且对3种病毒株而言，按欧共体对非经肠流感疫苗提出的血清学要求满足了(欧共体委员会，在欧共体内医药产品的规程。对流感疫苗的要求的协调。(1992)，93-98页。卢森堡：欧共体公告办公室)。
体液的粘液性免疫应答(唾液)示于表3中。IgA-滴度的最大上升值在组A中观察到。它显著地好于其它组中的值。考虑到总的IgA，组A中GMT也同样是最高的。粘液转化率(IgA-滴度升高4倍)又是在组A中最高。在肌肉内作疫苗接种的情况下，只有很弱的粘液转化率。
鼻粘膜的排放细胞学检查在组A、B和C中进行。结果汇总于图5中。我们确定鼻粘膜上皮的细胞数(闪光-和非闪光柱状细胞，杯状细胞和Schuppen上皮细胞)和脊髓/单-和淋巴细胞的细胞数(淋巴细胞，中性白细胞，嗜曙红细胞和Centroblasten)。在组A中，一种明显的杯状细胞增生可在作疫苗接种后第4和8天证实。此外我们观察到淋巴细胞和Centroblasten在同样天数里的强劲升高。另外，嗜曙红细胞和中性白细胞的升高在开始接种后第8天观察到。柱细胞的数量保持不变。
在组B中仅有淋巴细胞、中性白细胞和嗜曙红细胞粒质体(Granulozyte)的少量升高。在该组中未见到活化的淋巴细胞的征兆。
在组C中，甚至可以测到比在组A中更强的杯状细胞增生。此外，嗜曙红细胞和中性白细胞粒质体在该组中在第4和8天有最强的升高。在该组中，成淋巴细胞的升高弱于在组A中。P＝≤0.05。在第一次接种后一个月，各组中细胞组成的原先状态又恢复了。
图5涉及鼻细胞学：不同细胞群落的定量，它通过鼻涂抹技术、在三种不同的鼻内接种后直至29天由单个个体(每组20人)获得。与在组B和C中显著较低的升高，相比，观察到作为局部免疫应答的标志的Centroblasten的显著升高(P＜0.005)。
实施例8
带HLT或PCG的鼻内病毒体流感疫苗在志愿者身上的临
床作用效果的比较，在一个按本发明所叙的新喷雾仪器中给药
两种抗-流感喷雾疫苗的免疫应答和可耐受性在双盲研究中进行，它用总共158个年龄为18-67岁的、健康的瑞士志愿者作此研究。
一种三价的病毒体流感疫苗(提纯了的HA，用磷脂酰胆碱配制)与来自大肠杆菌的热变性毒素(HLT)以一种形式组合，它适于作鼻内给药。一个人用剂量含7.5μg HA(对每种流感株而言)和2μg HLT。在第1和8天，对在18-59岁或≥60岁的组中个体受试者每个鼻孔给予一个剂量。在免疫化后约4周采取血清试样。反应少和弱。那些获得了保护性的血清-抗HA-抗体滴度(≥40)的人(成人或老人)数百分值如下：A/拜耳(92％，91％)，A/武汉(92％，78％)和B/北京(59％，50％)。免疫化后的GMT和GMT上升的翻番在两个老年组之间是可比的。那些不具有保护性的基线滴度值、但在免疫化后获得了保护性水平的人(成人或老人)的人数百分值如下：A/拜耳(79％，85％)，A/武汉(86％，56％)和B/北京(48％，41％)。
第二种粘液性疫苗制剂含有7.5μg HA和12μg前霍乱原(Procholeragenoid)(PCG)。该制剂同样也能很好地承受，且比HLT-制剂具有大约低一些的免疫原。那些获得保护性的血清-抗-HA-抗体滴度值的人数百分值如下：A/拜耳94.2％，A/武汉80.8％和B/北京36.5％。各组的血清转化率示于表4中。
这些结果表明，鼻内途径给药的病毒体流感疫苗对包括老人在内的成人是安全的和免疫发生性的。
实施例9
在鼻内应用一种病毒性流感疫苗后老鼠身上产生的粘液性免疫应答，该疫苗带HLT、带PCG或没有另外的粘液辅料
10个长成的雌性卵巢/c-老鼠将用30μl或是在实施例1中所述的流感疫苗或在实施例2中所述的流感疫苗接种。10只老鼠的对照组得到不带另外辅料、但有同样病毒体组成的病毒性疫苗制剂。一周后，每组的一半得到一个第二种鼻内剂量。三周后进行鼻清洗(NW)和支气管肺泡冲洗(BAL)。表5相应于实施例9。特异IgA的求取将通过已知的ELISA方法进行。结果(GMT)归纳于表6中。
对所有三个疫苗株(A/约翰内斯保，A/南京，B/哈尔滨)的最高GMT值可在这一组中验证，该组已用按实施例1的疫苗接种两次。在它仅接种一次后，它甚至在BAL中反应出最高的IgA-水平。
一个令人满意地出现的IgA-应答也在这样一组老鼠身上得到，它已用按实施例2的制剂作鼻内接种。对照组-它未加另外的粘液性辅料的病毒体制剂-仅显示出很弱的粘液性免疫应答。
这些结果表明，一种鼻内给药的病毒体流感疫苗-它含粘液性辅料-可诱导出高的粘液性抗体应答。
在老鼠身上对病毒体流感疫苗的临床前研究：鼻内应用
(相应于实施例9的表5) 组1 组2 组3 组4 组5 组60天 流感疫苗-病毒 体+HLT鼻内 (同左) 流感疫苗-病毒 体+PCG鼻内 (同左) 流感疫苗- 病毒体 (同左)7天 流感疫苗-病毒 体+HLT鼻内 - (同上) - 流感疫苗- 病毒 -28天 NW&BAL (同左) (同左) (同左) (同左) (同左)
老鼠身上的IgA-流感-抗体，GM滴度的倒数的GMT(ELISA)
(相应于实施例9的表6) 组 H1N1 NW H1N1 BAL H3N2 NW H3N2 BAL B NW B BAL 1 320 12800 380 3200 320 9220 2 阴性 140 阴性 24 阴性 1540 3 160 760 470 760 220 770 4 阴性 阴性 阴性 阴性 10 阴性 5 4 阴性 阴性 阴性 4 阴性 6 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
实施例10
粘液性肝炎病毒-B-(HBs-)疫苗的临床评价
按实施例4制备该疫苗，且装入按实施例5的鼻用喷雾给药器中。该产品在10个志愿者身上试验：在第1天每个鼻孔给药100μl，一周后再给药一次。在第1天(接种前)和第29天采取血样。按HBs-抗体将借助RIA(甘油琼脂)评定。接种前的滴度的几何平均值为7IU/ml，在第29天为159IU/ml.
实施例11
在鼻内使用一种DNA-质体后老鼠的粘液性免疫应答，该DNA-质体为腮腺炎病毒的HN-抗原编码，加入到含10％阳离子性磷脂中的流感病毒体中，并与HLT混合(5μg/ml)
用a)用于给腮腺炎病毒的HN-抗原编码的裸DNA(组c)或b)在用病毒体预免疫化后包括在病毒体中的DNA(组A)或c)未作预免疫化(组B)对老鼠组作鼻内免疫化。对照组(H)用活体Urabe-腮腺炎病毒(Priorix，SKBRixensart)作鼻内免疫处理。如表7中所示，在已作预免疫处理的老鼠组中，IgG的滴度的几何平均值(GMT)高于老鼠组B和C中的该值(Lovell GH：Proteosomes，hydrophobic anchors，iscoms and liposomers forimproved presentation of peptide and protein vaccines，In：NewGeneration Vaccines(1990)(G.C.Woodrow und M.M.Levine Hrsg.)Dekker，New York，141-168页；Cusi MG und Gluck R：Intranasalimmunization of mice with mumps DNA entrapped into influeuzavirosomes.IBS’s 4th Annual Conference on Genetic Vaccines，25.-27.10月，1998年，华盛顿特区)。已用裸DNA作鼻内免疫处理的那些老鼠的组展现了很低的IgG-水平，对此，那些用腮腺炎病毒免疫处理了的老鼠(组H)显示了好的IgG-应答。通过粘液免疫性分析我们发现，除了用裸DNA免疫处理了的外，所有其它老鼠组均展现了IgA。仅在用腮腺炎病毒鼻内免疫处理了的老鼠的鼻清洗物(NW)中我们才能检测到升高的IgA滴度(组H)。
细胞素检测在采用由老鼠脾上取出的原始脾细胞来进行，该细胞在免疫处理后12天取出。表8汇总了代表性的测量值，它们由两个分立的实验得到。用腮腺炎病毒抗原刺激了的老鼠细胞-它事先已用DNA-病毒体鼻内接种-诱导了IL-2和IFN-γ的生产。此外，被流感感染了的老鼠诱导了IL-4的生产。由用腮腺炎病毒免疫处理了的动物身上取出的细胞在用腮腺炎抗原体外刺激后产生了IFN-γ，IL-2，IL-4和IL-10。如同用提纯了的腮腺炎抗原作对照免疫处理的那样，用DNA-病毒体进行的免疫处理与Th1-表型作关联。此外收集和考虑IgG-总水平和病毒特异的IgG1或IgG2a之间的比例、在组A中IgG2a-Isotyp的量，它表示了Th2-应答。表7：对老鼠作支气管炎泡冲洗时的体液IgG、IgA的、和对老鼠作鼻清洗时的IgA的滴度几何平均值(GMT) 老鼠 IgG BAL IgA NW IgA 组A 356 8 10 组B 15 11 10 组C 12 2 2 组H 1585 2 20表8：对老鼠身上细胞素生产的表征性测量，通过两个分立的实验得到 组 IL-2 IFN-γ IL-4 IL-10 A 300 300 150 0 B 150 625 0 0 C 300 100 0 0 D 600 100 150 600
实施例12
借助带和不带HLT的流感病毒体、用一种新的喷雾
给药器在志愿者身上处理鼻塞
在一个临床研究中，选出30个具有感冒症状和急性鼻塞的志愿者。对全部志愿者而言，呼吸强度通过每个单个鼻孔作鼻腔测压法(帕斯卡)测室。随后将他们随机地分成3组，每组10人。组A得到一个按实施例1的接种物剂量(每鼻孔100μl)，组B得到相同的剂量，但没有粘液性辅料HLT，组C每个鼻孔得到100μl 0.9％ NaCl(生理食盐水)。在15、30分钟、1和2小时后测量空气流。
测量数据汇总于表9中。在组A和B中的评价值显著地好于在组C中的值。在这两组中可以确认这呼吸功能的明显改善。
表9：对志愿者作喷雾处理之前和之后鼻腔测压法几何平均值 组 呼吸强度(Pa) 0分钟 15分钟 30分钟 60分钟120分钟 A 490 693 712 681 521 B 497 687 705 672 538 C 488 497 513 521 501
实施例13
借助流感病毒体和HLT在志愿者身上
作粘膜(Mukosalsionen)处理
如实施例7所述，使志愿者作鼻内接种。如此处所述，鼻内疫苗处理3，7和28天后，测定平均杯状细胞数。我们能够在细胞学涂抹法中用杯状细胞增生来确定上皮改变(Glück U，Gebber J-O：吸烟者中的鼻细胞病理学：空气污染的一种可能生物标志？Am.J.Rhinol.10(1996)55-57)。杯状细胞对粘膜层具有保护功能。首次鼻内疫苗处理后一个月，粘膜的细胞状态显著地好于先前状态。
新的疫苗因此可用作治疗剂来处理受损状态的鼻粘膜。
实施例14
用具有和不具有流感病毒体的HLT作经鼻给
药来预防肠毒性的大肠杆菌性腹泻
一组访问突尼斯(Tunesien)的旅行者由38个人组成。按照表达的意愿，所有的人都参与研究中。随机地将19个志愿者用按实施例1的制剂以1周的间距接种二次，相对的是，19个人没得到接种物质。第一次鼻内接种28天后，从所有志愿者身上抽取血样。19个接种了的人在血清中显示了对于粘液性辅料(HLT)的高的Ig G-水平。对照组保持抗-HLT阴性。当他们离开突尼斯之前、一个月之后，向每个参与者分发一份特定的健康事项调查表格。该组20天后由突尼斯返回家去，且已填好的调查表用于评估腹泻疾病。在接种了的一组中仅报告了二个人有腹泻问题，相对照的是，未接种的组中有9个人在逗留在突尼斯期间发生了腹泻。这些数据表明，疫苗对阻止肠毒性的大肠杆菌疾病性腹泻是有效的。实施例7：表1：临床记录 疫苗组 N(男性)平均年龄(岁)疫苗处理次数(间距)施用 组成(ug)完 整的疫苗处 理：每株的HA 组成(ug)完整 的疫苗处理： HLT A 20(14)39.7 2(1周)鼻内 15 2 B 20(14)35.5 2(1周)(同上) 15 - C 20(16)43.8 1(同上) 15 2 D 20(14)41.2 1肌肉内 15 -