从甘蔗的嫩叶中提取过氧化物酶的方法.pdf

本发明是这样实施的：
1、原料匀浆：

称取甘蔗嫩叶1000g，洗净、凉干。加入预冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0
磷酸钾抽提液2000mL，匀浆，匀浆后用140目尼龙布过滤，弃去残渣，得
滤液。
2、酶的制备：

于上述滤液中慢慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达40％
置0-4℃下放置过夜，次日在常温下，以4000rpm离心15min，弃沉淀，
得上清液。在上清液中再加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达80％，
置0-4℃下放置过夜，以4000rpm离心20min，弃上清液，得沉淀，此沉
淀即为粗酶。
3、乙醇分级分离

向16.3g粗酶中加入100mL预冷4℃的0.05mol/L pH7.0磷酸钾缓冲液，
将溶液于透析袋中，放入重蒸馏水中于4℃下透析48小时。直至硫酸铵透析
完毕为止(可用5％乙酸钡溶液检查)，透析在4℃下进行，将透析袋中液体倒
出，4000rpm离心15min，弃沉淀，得上清液。将上清液倒入烧杯并置于冰浴
中，在不断搅拌下慢慢加入1倍原上清液体积的-15℃乙醇溶液，放置20min，
4000rpm离心20min，收集沉淀，将沉淀溶于20mL 0.05mol/L pH7.0磷酸钾缓
冲液中，在重蒸馏水中透析除去乙醇，可得R2值近于1的酶溶液(R2值表明
酶的纯度，R2＝O.D403nm/O.D275.nm)。
4、葡聚糖凝胶G-100柱层析

将上述酶液进行浓缩，将上述酶液经葡聚糖凝胶G-100层析柱层析，
层析柱规格为2×40cm。用pH6.8 0.02mol/l磷酸钾缓冲液洗脱，自动部分收
集器收集，恒流泵恒流，每管5mL，收集呈酶活性的洗脱液，将洗脱液在
4℃下超滤，冻干即为纯酶制剂。
5、酶活性及蛋白质含量的测定方法

酶活性测定方法：测定前将酶液稀释300-500倍，吸1mL酶液，加入
2mL联苯铵醇的醇的钠缓冲液(在200mL容量瓶中，先加入2/3重蒸馏水及
2.3mL冰乙酸和184mg联苯铵，在50-60℃水浴中加热溶解，然后加入5.45g
无水醇的钠。待完全溶解后，冷却，定容)，在28-32℃水浴中保温5min，
测定时，加入1mL 0.1mol/LH2O2，立即摇匀，并转入比色皿中，用分光光度
计在波长580nm下测定光密度的变化。以加入过氧化氢起计时，每15秒钟
读数一次。
E＝(O.D45秒-O.D15秒)×2×稀释倍数/1000
酶活单位为：O.D/ng蛋白×min
蛋白质含量测定方法：按考马斯亮蓝G-250法。